專利名稱：焦磷酸測序法檢測β1受體基因多態性的試劑盒及方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，具體的是涉及焦磷酸測序法檢測β I受體基因多態性的試劑盒及方法。
背景技術：
β I腎上腺素受體阻斷藥是能選擇性地與β I腎上腺素受體結合、從而拮抗神經遞質和兒茶酚胺對β受體的激動作用的一種藥物類型，臨床常用的心血管藥物如阿替洛爾(氨酰心安)、美托洛爾(美多心安)、比索洛爾等均屬于此類。美托洛爾在臨床上廣泛用于治療心絞痛、心律失常、高血壓、甲狀腺機能亢進、嗜鉻細胞瘤、心肌梗塞，其血藥濃度療效具有顯著的個體差異大。β I腎上腺素受體屬于G蛋白偶聯受體超家族，它們以腎上腺素和去甲腎上腺素 為內源性配體，與Gs偶聯調節細胞內cAMP水平和L型Ca2+通道的開放頻率，調節機體的生理功能。Ser49Gly與Gly389Arg多態性影響β 腎上腺素受體功能，從而影響美托洛爾等藥物治療高血壓的療效和不良反應的發生情況(Clin Pharmacol Ther 2003;73:366-71)。中國人群中4949Gly和389Arg的發生頻率分別為16. 2%和76. 4%，此類患者對β I腎上腺素阻斷藥物更為敏感，療效相對較好。查明患者β I腎上腺受體的基因型，確定患者對美托洛爾的敏感性，根據患者β I腎上腺受體基因不同單倍型調整劑量，對于不能耐受的患者，建議換藥。研究結果表明，高血壓病人收縮壓與舒張壓的降低均與腎上腺素受體單倍型相t匕，49Ser389Arg / 49Ser389Arg 與 49Ser389Arg / 49Gly389Arg 單倍型的患者對美托洛爾的反應良好，而 49Ser389Gly / 49Gly389Arg 和 49Ser389Gly / 49Ser389Gly 單倍型患者對美托洛爾治療無降壓效應。這一結果揭示，腎上腺素受體單倍型可作為美托洛爾抗高血壓療效的預測指標(Clin Pharmacol Ther 2006;80:23-32)。開發快速、高效、準確、便捷、經濟的檢測β I受體基因多態性的試劑盒將為其底物藥的臨床個體化治療起到積極的推動作用。焦磷酸測序(Pyro sequencing)技術是新一代DNA序列分析技術,該技術無須進行電泳，DNA片段也無須熒光標記，是一種通用型技術平臺。該技術具有操作簡便、檢測成本低、所需樣品量小、快捷、準確、高通量等特點，符合臨床大樣本檢測要求。

發明內容
本發明旨在提供一種焦磷酸測序法檢測β I受體(SEQ ID NO. I)多態性的試劑盒及方法，以實現快速、簡便、準確、高效、實用、經濟的檢測其底物β I受體阻斷藥個體化用藥相關基因SNP。為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為一種焦磷酸測序法檢測β I受體基因多態性的試劑盒，包括如下引物(I)擴增引物:
上游引物5/-TCA ACT GGC TGG GCT ACG C_3' (SEQ ID NO. 2)；下游引物5'-TCT CCG TGG GTC GCG TG-3' (SEQ ID NO. 3)；其中，下游引物的5'進行生物素標記；(2)測序引物5/ -GCA AGG CCT TCC AG-3' (SEQ ID NO. 4)；試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規試劑。一種應用上述試劑盒檢測β I受體基因多態性的方法，包括如下步驟(I) DNA 提取；(2)聚合酶鏈反應配制50μ I PCR擴增體系，包含10XPCR buffer 5. O μ I, dNTP 4. O μ 1，上游引物1·5μ 1，下游引物 1·5μ l，rTaq0.5y 1，水 35·5μ 1，模板 2·0μ I ;循環程序為:95。C 5min預變性；依次在95° C 30S，50° C 30S，72° C 30S，進行35個循環；72° C保持5min，最終保持在4° C，得擴增產物；( 3 )焦磷酸測序單鏈樣本純化；(4)焦磷酸測序及結果分析。本發明的試劑盒對β I受體RS1801253目標序列進行分析和檢測，該目標序列包括野生型 CCGCAAGGCCTTCCAGCGACTGCTCTGCTGCGCGCGCA (SEQ ID NO. 5)和突變型 CCGCAAGGCCTTCCAGGGACTGCTCTGCTGCGCGCGCA (SEQ ID NO. 6)。由于設計了特異性高的引物，并且選擇了合適的方法，本發明的試劑盒適用于對β I受體基因多態性進行快速檢測，可廣泛應用于臨床上β I受體阻斷藥個體化用藥方案制定的基因檢測。與現有技術相比，其應用焦磷酸測序技術可以快速、準確地進行短DNA序列分析，便于構建標準化操作流程；具有高通量、低成本等特點；PCR產物即可直接用于測序，不需進行產物純化等二次處理，操作極為簡便，所需樣品量小。


圖I為本發明β I受體(rsl801253)突變雜合子焦磷酸測序結果；圖2為本發明β I受體(rsl801253)突變純合子焦磷酸測序結果。
具體實施例方式下面結合實施例對上述試劑盒及檢測方法進行詳細描述。實施例I :β 受體-pyroF (上游引物)5' -TCA ACT GGC TGG GCT ACG C-3/ (SEQ IDNO. 2)；β I 受體-pyroR (下游引物):5' -TCT CCG TGG GTC GCG TG-3' (SEQ ID NO. 3)；測序引物5'-GCAAGG CCT TCCAG-3' (SEQ ID NO. 4)；I. DNA 提取I. I實驗前試劑材料準備與檢查工作如下(I)檢查試劑盒保質期以及確保Wash Buffer I和2中已添加乙醇，并在瓶上相應標識處打勾V ； (2)異丙醇(如無，可用無水乙醇替代)和75%乙醇；(3)高壓滅菌有效期內的I. 5mL Eppendorf管和各類移液槍頭。
I. 2從4°C冰箱中取出裝有全血的EDTA抗凝管，上下顛倒數次混勻；I. 3在I. 5mL Eppendorf管對應標本唯一性標識做好標記；I. 4 分別移取 900uL Cell Lysis Solution 加至滅菌的 I. 5mL Eppendorf 管；I. 5小心移取300uL全血轉移至上述加有Cell Lysis Solution的I. 5mL EP管；I. 6 蓋上 Eppendorf 管蓋，室溫孵育 IOmin ；1.713，OOOrpm 室溫離心 20 秒；I. 8取出Eppendorf管,觀察白色沉淀；I. 9開Eppendorf管蓋，手持管底部，傾斜EP管口棄去部分紅色上清，盡量將紅色上清吸盡；I. 10蓋上Eppendorf管,用手指彈擊EP管底部,使白色沉淀重懸；1.11移取300111^ Nuclei Lysis Solution 入上述Eppendorf 管中，蓋上管，上下顛倒數次混勻；I. 12 打開 Eppendorf 管，移取 IOOuL Protein Precipitation Solution 入上述Eppendorf管中，蓋上管管，振蕩器上劇烈振蕩20秒；13，OOOrpm室溫離心3min ；I. 13移取上清轉移到新的已滅菌I. 5mL Eppendorf管；I. 14移取300uL異丙醇入EP管，蓋上管蓋，上下顛倒數次混勻，可見白色絮狀gDNA析出；I. 1513, OOOrpm 室溫離心 Imin ；I. 16打開Eppendorf管，手捏管底部，傾斜管口棄去上清；I. 17移取300uL 75%乙醇加入Eppendorf管，蓋上管蓋，輕柔上下顛倒洗滌沉淀；I. 1813, OOOrpm 室溫離心 Imin ；I. 19打開Eppendorf管，手持管底部，傾斜管口棄去上清；I. 20在實驗臺上放置新濾紙,倒扣Eppendorf管，吸干液體,將Eppendorf管開蓋側放風干；I. 21 目測沉淀大小，加入 50 IOOul DNA Rehydration Solution 至沉淀；I. 22過夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度計進行核酸濃度測定，核酸濃度大于50ng/ul視為合格，如濃度不夠，加入乙醇再次沉淀DNA，然后重新加適量的DNARehydration Solution 溶解 DNA。I. 23在管壁和管蓋上再次標清樣本唯一性編號，并用透明膠帶纏繞保護；I. 24保存核酸標本至4°C冰箱；2.聚合酶鏈反應2. I在試劑準備區配制50 μ I PCR擴增體系(模板添加除外)，各組分及添加量如下表
權利要求
1.一種焦磷酸測序法檢測β I受體基因多態性的試劑盒，其特征在于，包括如下引物 (1)擴增引物 上游引物5' -TCA ACT GGC TGG GCT ACG C-3'； 下游引物5' -TCT CCG TGG GTC GCG TG-3'； 其中，下游引物的5'進行生物素標記； (2)測序引物5'-GCA AGG CCT TCC AG-3'。
2.一種應用權利要求I所述的試劑盒檢測β I受體基因多態性的方法，包括如下步驟 (1)DNA 提取； (2)聚合酶鏈反應 配制 50 μ I PCR 擴增體系，包含10XPCRbuffer 5. O μ I, dNTP 4. O μ 1，上游引物I. 5μ 1，下游引物 I. 5 μ l,rTaqO. 5 μ I,/Jc 35. 5μ 1，模板 2. O μ I ;循環程序為95° C 5min預變性；依次在95° C 30S，50° C 30S，72° C 30S，進行35個循環；72° C保持5min，最終保持在4° C，得擴增產物； (3)焦磷酸測序單鏈樣本純化； (4)焦磷酸測序及結果分析。
全文摘要
本發明公開了一種焦磷酸測序法檢測β1受體基因多態性的試劑盒及方法。所述試劑盒β1受體基因多態性進行檢查，具體是指rs1801253單核苷酸多態性。試劑盒包含如SEQ ID NO.2—4所示的引物。本發明的試劑盒，可以實現準確、快捷、高通量β1受體基因多態性的檢測，從而達到對其底物實現安全合理有效的個體化給藥。
文檔編號C12Q1/68GK102876785SQ20121033876
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月13日 優先權日2012年9月13日
發明者周宏灝 申請人:周宏灝