專利名稱：黃麻鏈霉菌nf0919菌株代謝產物在防治番茄病害上的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物及用途,更具體地說涉及一種黃麻鏈霉菌iStreptomycescorchorusii )NF0919菌株代謝產物及其在番茄病害防治上的應用，屬于微生物農藥技術領域。
背景技術：
番爺葉霉病/Wra)、番爺灰霉病ciflerea)和番爺枯萎病(.Fusarium oxysporum)和番爺疫病infestans)是番爺上主要的真菌和卵菌病害。番茄病害的防治當前主要通過化學防治來防控，常用的化學藥劑有腐霉利、多菌靈、乙霉威、百菌清煙劑、嘧菌酯、醚菌酯、苯醚甲環唑、烯肟菌酯、唳酰菌胺和吡唑醚菌酯等。長期以來，由于多頻次、多劑量施用化學藥劑，造成番茄病原菌對常用化學藥劑都產生了不同程度的抗(耐)藥性，生產上屢屢出現防治失敗的事例。目前成功用于防治番茄病害的微生物農藥專用制劑較少。文獻已報道生物防治控制病害的生防菌屬(種)主要有木霉菌屬真菌spp.)中的綠色木霉(Trichoderma viride )和哈茨木霉(Trichoderma harzianum)；芽抱桿菌屬細菌 iBaciIlusspp.)中的枯草芽抱桿菌多粘芽抱桿菌Cfeci77w5·和巨大芽孢桿菌(ifeciJrJrW1S megaterium');假單胞菌屬細菌spp.)中的突光假單胞細菌fluorescens')·;農用抗菌素，如農抗120、春雷霉素和武夷菌素等。本發明提供的可同時兼治番茄真菌和卵菌病害的頡頏細菌黃麻鏈霉菌NF0919菌株，在現有技術中沒有提及和公開。

發明內容
提供黃麻鏈霉菌iStreptomyces corchorusii) NF0919菌株發酵液中產物的提取方法，及提取物在防治番爺葉霉病、番爺灰霉病、番爺枯萎病和番爺疫病上的應用。本發明是通過以下技術方案實現的
本發明中提供用的黃麻鏈霉菌NF0919菌株的菌株特征，見專利ZL 201010236886. I。黃麻鏈霉菌(拉丁文學名為Streptomyces corchorusii) NF0919菌株，已于2010年7月8日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏單位地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號為=CGMCC No. 3968。本發明的黃麻鏈霉菌NF0919菌株發酵液中代謝產物的提取方法，包括以下步驟
(A)菌株的活化與一級種子培養液的培養
將保存的NF0919菌株的斜面在高氏一號培養基上活化，30°C培養10 d，挑取I cm2大小的菌塊接種于50 mL—級種子培養液中(250 mL三角瓶裝培養液50 mL)，置于170 rpm搖床上30°C振蕩培養44 48 h，其中所述的50 mL—級種子培養液的成分為可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨l%，NaCl O. 5%, K2HPO4 O. 2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl和K2HPO4含量的單位比例為W/V;
(B)二級種子培養液的培養
將步驟(A)所得一級種子培養液按5% (V/V)的接種量接入50 mL 二級種子培養液中(250 mL三角瓶裝培養液50 mL),170 rpm,30 °C搖床上培養48 - 52 h，其中所述的5%的單位比例為V/V ;所述的50 mL 二級種子培養液的成分(W/V):馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 2%, CaCO3 O. 1%，K2HPO4 O. 05%, MgSO4 O. 05%,淀粉酶 O. 01%,馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO3、K2HPO4^MgSO4和淀粉酶含量的單位比例為W/V ；
(C)發酵培養液的培養
將步驟(B)所得二級種子培養液按5% (V/V)的接種量接種于裝有160 L發酵培養液的容積為200 L的發酵罐中，其中所述的5%的單位比例為V/V，設置發酵參數為溶氧100%，消泡劑I. 6 L，攪拌速度為360 rpm,發酵溫度為36 °C，發酵時間為72 h，pH 6. 8 7. 2， 所述的發酵培養液的成分為(W/V):馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 6%，K2HPO4 O. 05%, NaCl
O.2%, MgSO4 O. 05%, CaCO3 O. 1%，ρΗ7· 2-7. 4，馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、K2HPO4、NaCl、MgSO4和CaCO3含量的單位比例為W/V ;所述的消泡劑為XP-100F系列發酵用有機硅消泡劑；
(D)NF0919菌株發酵液中代謝產物分離方法
把步驟(C)所得發酵液在10000 rpm離心5 min得上清液，用濃鹽酸調節pH至2. 0，出現沉淀，再次離心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35°C真空干燥得提取物。本發明的有益效果是
本發明提供黃麻鏈霉菌NF0919菌株發酵液中代謝產物的提取方法，并證明其提取物可同時兼治番茄多種病害。大田防治結果表明，該菌株代謝產物對番茄葉霉病、番茄灰霉病、番茄枯萎病和番茄疫病均有很好的防治效果。
具體實施方式
實施例本發明中提供用的黃麻鏈霉菌NF0919菌株的菌株特征，見專利ZL201010236886. I。本發明黃麻鏈霉菌NF0919菌株發酵液中產物的提取方法，包括以下步驟
(A)菌株的活化與一級種子培養液的培養
將保存的NF0919菌株的斜面在高氏一號培養基上活化，30°C培養10 d，挑取I cm2大小的菌塊接種于50 mL—級種子培養液中(250 mL三角瓶裝培養液50 mL)，置于170 rpm搖床上30°C振蕩培養44 48 h，其中所述的50 mL—級種子培養液的成分為可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨l%，NaCl O. 5%, K2HPO4 O. 2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl和K2HPO4含量的單位比例為W/V;
(B)二級種子培養液的培養
將步驟(A)所得一級種子培養液按5% (V/V)的接種量接入50 mL 二級種子培養液中(250 mL三角瓶裝培養液50 mL),170 rpm,30 °C搖床上培養48 - 52 h，其中所述的5%的單位比例為V/V ;所述的50 mL 二級種子培養液的成分(W/V):馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白
2.2%, CaCO3 O. 1%，K2HPO4 O. 05%, MgSO4 O. 05%,淀粉酶 O. 01%,馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO3、K2HPO4^MgSO4和淀粉酶含量的單位比例為W/V ；
(C)發酵培養液的培養
將步驟(B)所得二級種子培養液按5% (V/V)的接種量接種于裝有160 L發酵培養液的容積為200 L的發酵罐中，其中所述的5%的單位比例為V/V，設置發酵參數為溶氧100%，消泡劑I. 6 L，攪拌速度為360 rpm,發酵溫度為36 °C，發酵時間為72 h，pH 6. 8 7. 2，所述的發酵培養液的成分為(W/V):馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 6%，K2HPO4 O. 05%, NaCl
O.2%, MgSO4 O. 05%, CaCO3 O. 1%，ρΗ7· 2-7. 4，馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、K2HPO4、NaCl、MgSO4和CaCO3含量的單位比例為W/V ;所述的消泡劑為XP-100F系列發酵用有機硅消泡劑；
(D)NF0919菌株發酵液中代謝產物的提取方法
把步驟(C)所得發酵液在10000 rpm離心5 min得上清液，用濃鹽酸調節pH至2. 0，出現沉淀，再次離心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35°C真空干燥得提取物。本實施例的實施效果
(I )NF0919菌株發酵液的提取物，對番茄葉霉病菌、番茄灰霉病菌和番茄枯萎病菌的毒力測定方法如下
取適量提取物，用無菌水梯度稀釋，制成含提取物濃度分別5. 0,2. 5、I. 25,0. 625和
O.3125 mg/L的PDA平板，并設無菌水為空白對照，對照藥劑用化學藥劑為98%多菌靈(Carbendazim)按上述相同稀釋濃度制成含藥PDA平板。用直徑為4 mm的打孔器分別在長有番茄葉霉病菌、番茄灰霉病菌和番茄枯萎病菌的PDA平板的邊緣打取菌餅，將菌餅接種到上述含藥(提取物和多菌靈)平板中央，每個病原菌的每個濃度設4個重復。將平板置于25°C保溫培養箱中，培養72 h。用十字交叉法測定菌落凈生長直徑(菌落凈生長直徑=菌落直徑一菌餅直徑)，計算抑制率。抑制率=(空白對照菌落凈生長直徑一含藥的菌落凈生長直徑)/空白對照菌落凈生長直徑X 100%。用DPS 13. O軟件計算毒力回歸方程。NF0919發酵液的提取物對番茄葉霉病菌、番茄灰霉病菌和番茄枯萎病菌的毒力測定結果
毒力測定結果表明，NF0919菌株發酵液的提取物對番茄葉霉病菌、番茄灰霉病菌和番茄枯萎病菌菌絲的生長均有強烈抑制作用(表I)，其EC5tl值(表3)分別為O. 4233 mg/L、
O.3652 mg/L和O. 5220 mg/L。相比之下，相同稀釋倍數條件下98%多菌靈對番茄葉霉病菌、番茄灰霉病菌和番茄枯萎病菌菌絲生長抑制率(表2)較低，其EC5tl值(表3)分別為O. 7511mg/L、0. 6754 mg/L和O. 9656 mg/L。NF0919發酵液活性的提取物對番茄病原菌的室內毒力極顯著高于化學藥劑多菌靈。表I. NF0919菌株發酵液的提取物對番茄病原菌的平均抑制率
濃度(mg/L)_5^0_2^5_ I. 25O. 625O. 3125_O_
對番茄葉霉病菌的平均抑制率(％)_ 91.63 80.52 69.8056.2446.72_O_
對番茄灰霉病菌的平均抑制率(％)_ 92.92 83.49 72.9360.3449.20_O_
對番茄枯萎病菌的平均抑制率(％)_ 89.23 77.20 65.3453.4041.46_O_
表2. 98%多菌靈對番茄病原菌的平均抑制率
濃度(mg/L)_5^0_2^5_ I. 25O. 625 O. 3125_O_
對番茄葉霉病菌的平均抑制率(％)_ 80.26 69.32 57.6546.94 35.76_O_
對番茄灰霉病菌的平均抑制率(％) " 83. 13 —71.50 ~ 58. 35_ 49.20— 37.43 O
對番茄枯萎病菌的平均抑制率(％)_ 79.23 67.64 53.8041.56 29.84_O_
表3. NF0919菌株發酵液的提取物對番茄病原菌的毒力測定結果
權利要求
1.黃麻鏈霉菌iStreptomycescorchorusii ) NF0919菌株(該菌種特性見專利ZL201010236886. I)發酵液中代謝產物的提取方法。
2.根據權利要求I所述的黃麻鏈霉菌NF0919菌株發酵液中代謝產物的提取物，在防治番爺葉霉病、番爺灰霉病、番爺枯萎病和番爺疫病上的應用。
3.權利要求I所述的黃麻鏈霉菌NF0919菌株發酵液中代謝產物的提取方法，其特征在于包括以下步驟 (A)菌株的活化與一級種子培養液的培養 將保存的NF0919菌株的斜面在高氏一號培養基上活化，30°C培養10 d，挑取I cm2大小的菌塊接種于50 mL 一級種子培養液中，置于170 rpm搖床上30°C振蕩培養44 48 h,其中所述的50 mL—級種子培養液的成分為可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，K2HPO4 O. 2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl和K2HPO4含量的單位比例為W/V ； (B)二級種子培養液的培養 將步驟(A)所得一級種子培養液按5%的接種量接入50 mL 二級種子培養液中，170rpm,30 °C搖床上培養48 - 52 h，其中所述的5%的單位比例為V/V ;所述的50 mL 二級種子培養液的成分:馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 2%, CaCO3 O. 1%, K2HPO4 O. 05%，MgSO4 O. 05%,淀粉酶O. 01%,馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO3、K2HPO4, MgSO4和淀粉酶含量的單位比例為VV； (C)發酵培養液的培養 將步驟(B)所得二級種子培養液按5%的接種量接種于裝有160 L發酵培養液的容積為200 L的發酵罐中，其中所述的5%的單位比例為V/V，設置發酵參數為溶氧100%，消泡齊IJ(XP-100F系列發酵用有機硅消泡劑)1.6 L，攪拌速度為360 rpm,發酵溫度為36 V，發酵時間為72 h，pH 6. 8 7. 2，所述的發酵培養液的成分為馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白·2. 6%, K2HPO4 O. 05%, NaCl O. 2%, MgSO4 O. 05%, CaCO3 O. 1%，ρΗ7· 2-7. 4，馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、K2HPO4 ,NaCl、MgSO4和CaCO3含量的單位比例為W/V; (D)NF0919菌株發酵液中代謝產物提取方法 把步驟(C)所得發酵液在10000 rpm離心5 min得上清液，用濃鹽酸調節pH至2. 0，出現沉淀，再次離心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35°C真空干燥得提取物。
全文摘要
本發明為黃麻鏈霉菌NF0919菌株(其在CGMCC的保藏編號為CGMCCNo.3968，菌種專利號為ZL201010236886.1)發酵液中活性代謝產物的提取方法。代謝產物能有效防治番茄葉霉病(Fulviafulva)、番茄灰霉病(Botrytiscinerea)、番茄枯萎病(Fusariumoxysporum)和番茄疫病(Phytophthorainfestans)。
文檔編號C12R1/465GK102911970SQ20121035462
公開日2013年2月6日 申請日期2012年9月23日 優先權日2012年9月23日
發明者楊敬輝, 陳宏州, 莊義慶, 張文文 申請人:江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所