專利名稱：黃麻鏈霉菌nf0919菌株代謝產物在葡萄病害防治上的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物及用途，更具體地說涉及一種黃麻鏈霉菌iStreptomycesmrdor狀ii)NF0919菌株發酵液中代謝產物的提取方法，及提取物在葡萄病害防治上的應用，屬于生物農藥技術領域。
背景技術：
由植物病原真菌圍小叢殼菌(Mlomerella ci/ 濟侵染引發的葡萄炭疽病、囊孢殼菌iPhysalospora侵染引發的葡萄房枯病、鏈格孢菌iAlternaria viticola)引發的葡萄穗軸褐腐(枯)病、Coniothyrium dlodiella侵染引發的葡萄白腐病、單軸霉屬iPlasmopara vi ticola)侵染引發的葡萄霜霉病、灰葡萄孢菌(此cinerea )侵染引發的葡萄灰霉病和痂囊腔菌ampelina)侵染引發的葡萄黑痘病是我國葡萄上發生的主要病害。·葡萄病害當前主要通過化學防治來防控，常用的化學藥劑有甲基硫菌靈(thiophanate-methyl)、波爾多液(bordeaux mixture)、五氯酌·鈉(sodiumpentachlorophenol)λ 乙酸銅(cupric acetate)、啼菌酯(azoxystrobin)、醚菌酯(kresoxim-methyl)、啼霉胺(pyrimethanil)、苯醚甲環唑(difenoconazole)、烯 B虧菌酯(enestroburin)、氟嗎啉(fIumorph)、卩定酸菌胺(boscalid)、甲霜靈(metalaxyl)、霜霉威(propamocarb)、多菌靈(carbendazim)、咪鮮胺(prochloraz)、卩比唑醚菌酯(pyraclostrobin)和烯酰嗎啉(dimethomorph)等。長期以來，由于多頻次、多劑量施用化學藥劑，造成葡萄病原菌對常用化學藥劑都產生了不同程度的抗(耐)藥性，生產上屢屢出現防治失敗的事例。目前成功用于防治葡萄病害的生物農藥專用制劑還沒有。文獻已報道生物防治控制葡萄病害的生防菌屬(種)主要有(I)木霉菌屬真菌Spp.)中的綠色木^ (Trichoderma viride )^ Pp1(Trichoderma harzianum)和長枝木霉艦longi brachi a turn ) ； (2)芽抱桿菌屬細菌spp.)中的枯草芽抱桿菌
錯質芽抱桿菌{Bacillus cereus)、多粘芽抱桿菌(抱^77心polymyxa )、巨大芽抱桿菌和解淀粉芽抱桿菌amyloliquefaciens)； (3)單格孢菌(Ulocladium atrum) ; (4)鏈霉菌屬細菌焊c^spp.)中的灰綠鏈霉菌(Streptomyces griseovirides) λ{Streptomyces hygroscopicus)Λ(51 treptomyces aureochromogenes)矛口鏈霉菌(51 treptomyces kitasazwaensis) ； (5) {叚單胞菌屬細菌(戶似肌spp.)中的洋蔥假單胞菌(Pseudomonas、焚光假單胞
細菌(戶似肌和惡臭假單胞菌(戶似肌putida)； (6)酵母菌中的季也蒙畢赤氏酵母CPicAia guiIIiermondii)和羅倫隱球酵母Iaurentii)
坐寸O大多數菌株或制劑只能防治一種病害，而利用同一頡頏放線細菌同時兼治葡萄多種病害在現有技術中沒有提及和公開。

發明內容
提供黃麻鏈霉菌iStreptomyces cor chorus ii ) NF0919菌株發酵液中產物的提取方法，及提取物在防治葡萄炭疽病、葡萄房枯病、葡萄穗軸褐腐病、葡萄灰霉病、葡萄黑痘病和葡萄白腐病上的應用。本發明是通過以下技術方案實現的
本發明中提供用的黃麻鏈霉菌NF0919菌株的菌株特征，見專利ZL 201010236886. I。黃麻鏈霉菌(拉丁文學名為Streptomyces corchorusii) NF0919菌株，已于2010年7月8 日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏單位地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號為=CGMCC No. 3968。本發明的黃麻鏈霉菌NF0919菌株發酵液中代謝產物的提取方法，包括以下步驟
(A)菌株的活化與一級種子培養液的培養
將保存的NF0919菌株的斜面在高氏一號培養基上活化，30°C培養10 d，挑取I cm2大小的菌塊接種于50 mL—級種子培養液中(250 mL三角瓶裝培養液50 mL)，置于170 rpm搖床上30°C振蕩培養44 48 h，其中所述的50 mL—級種子培養液的成分為可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨l%，NaCl O. 5%, K2HPO4 O. 2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl和K2HPO4含量的單位比例為W/V;
(B)二級種子培養液的培養
將步驟(A)所得一級種子培養液按5% (V/V)的接種量接入50 mL 二級種子培養液中(250 mL三角瓶裝培養液50 mL),170 rpm,30 °C搖床上培養48 - 52 h，其中所述的5%的單位比例為V/V ;所述的50 mL 二級種子培養液的成分(W/V):馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 2%, CaCO3 O. 1%，K2HPO4 O. 05%, MgSO4 O. 05%,淀粉酶 O. 01%,馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO3、K2HPO4^MgSO4和淀粉酶含量的單位比例為W/V ；
(C)發酵培養液的培養
將步驟(B)所得二級種子培養液按5% (V/V)的接種量接種于裝有160 L發酵培養液的容積為200 L的發酵罐中，其中所述的5%的單位比例為V/V，設置發酵參數為溶氧100%，消泡劑I. 6 L，攪拌速度為360 rpm,發酵溫度為36 °C，發酵時間為72 h，pH 6. 8 7. 2，所述的發酵培養液的成分為(W/V):馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 6%，K2HPO4 O. 05%, NaClO. 2%, MgSO4 O. 05%, CaCO3 O. 1%，ρΗ7· 2-7. 4，馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、K2HPO4、NaCl、MgSO4和CaCO3含量的單位比例為W/V ;所述的消泡劑為XP-100F系列發酵用有機硅消泡劑；
(D)NF0919菌株發酵液中代謝產物分離方法
把步驟(C)所得發酵液在10000 rpm離心5 min得上清液，用濃鹽酸調節pH至2. 0，出現沉淀，再次離心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35°C真空干燥得提取物。本發明的有益效果是
本發明提供黃麻鏈霉菌NF0919菌株發酵液中代謝產物的提取方法，并證明其提取物可同時防治葡萄的果實、葉柄和葉片上的多種病害。大田防治結果表明，該菌株代謝產物對葡萄炭疽病、葡萄房枯病、葡萄穗軸褐腐、葡萄灰霉病、葡萄黑痘病和白腐病等葡萄病害均有很好的防治效果。
具體實施方式
實施例本發明中提供用的黃麻鏈霉菌NF0919菌株的菌株特征，見專利ZL201010236886. I。本發明黃麻鏈霉菌NF0919菌株發酵液中產物的提取方法，包括以下步驟
(A)菌株的活化與一級種子培養液的培養
將保存的NF0919菌株的斜面在高氏一號培養基上活化，30°C培養10 d，挑取I cm2大小的菌塊接種于50 mL—級種子培養液中(250 mL三角瓶裝培養液50 mL)，置于170 rpm搖床上30°C振蕩培養44 48 h，其中所述的50 mL—級種子培養液的成分為可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨l%，NaCl O. 5%, K2HPO4 O. 2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl和K2HPO4含量的單位比例為W/V。·
(B) 二級種子培養液的培養
將步驟(A)所得一級種子培養液按5% (V/V)的接種量接入50 mL 二級種子培養液中(250 mL三角瓶裝培養液50 mL),170 rpm,30 °C搖床上培養48 - 52 h，其中所述的5%的單位比例為V/V ;所述的50 mL 二級種子培養液的成分(W/V):馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白
2.2%, CaCO3 O. 1%，K2HPO4 O. 05%, MgSO4 O. 05%,淀粉酶 O. 01%,馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO3、K2HPO4^MgSO4和淀粉酶含量的單位比例為W/V。(C)發酵培養液的培養
將步驟(B)所得二級種子培養液按5% (V/V)的接種量接種于裝有160 L發酵培養液的容積為200 L的發酵罐中，其中所述的5%的單位比例為V/V，設置發酵參數為溶氧100%，消泡劑I. 6 L，攪拌速度為360 rpm,發酵溫度為36 °C，發酵時間為72 h，pH 6. 8 7. 2，所述的發酵培養液的成分為(W/V):馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 6%，K2HPO4 O. 05%, NaClO. 2%, MgSO4 O. 05%, CaCO3 O. 1%，ρΗ7· 2-7. 4，馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、K2HPO4、NaCl、MgSO4和CaCO3含量的單位比例為W/V ;所述的消泡劑為XP-100F系列發酵用有機硅消泡劑。(D) NF0919菌株發酵液中代謝產物的提取方法
把步驟(C)所得發酵液在10000 rpm離心5 min得上清液，用濃鹽酸調節pH至2. 0，出現沉淀，再次離心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35°C真空干燥得提取物。本實施例的實施效果
(I )NF0919菌株發酵液的提取物，對葡萄炭疽病菌、葡萄房枯病菌、葡萄穗軸褐腐病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄黑痘病菌和葡萄白腐病菌的室內毒力測定
NF0919菌株發酵液的提取物對葡萄炭疽病菌、葡萄房枯病菌、葡萄穗軸褐腐病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄黑痘病菌和葡萄白腐病菌的室內毒力測定方法如下
取適量提取物，用無菌水梯度稀釋，制成含提取物濃度分別10、5、2. 5、1.25、O. 625,0 mg/L的PDA平板，并設無菌水為空白對照，對照藥劑用化學藥劑為98%多菌靈(carbendazim)按上述相同稀釋濃度制成含藥PDA平板。用直徑為4 mm的打孔器分別在長有葡萄炭疽病菌、葡萄房枯病菌、葡萄穗軸褐腐病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄黑痘病菌和葡萄白腐病菌的PDA平板的邊緣打取菌餅，將菌餅接種到上述含藥(提取物和多菌靈)平板中央，每個病原菌的每個濃度設4個重復。將平板置于25°C保溫培養箱中，培養72 h。用十字交叉法測定菌落凈生長直徑(菌落凈生長直徑=菌落直徑一菌餅直徑)，計算抑制率。抑制率=(空白對照菌落凈生長直徑一含藥的菌落凈生長直徑)/空白對照菌落凈生長直徑X 100%。用DPS 13. O軟件計算毒力回歸方程。NF0919發酵液的提取物對葡萄炭疽病菌、葡萄房枯病菌、葡萄穗軸褐腐病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄黑痘病菌和葡萄白腐病菌的室內毒力測定結果
毒力測定結果表明，NF0919菌株發酵液的提取物對葡萄炭疽病菌、葡萄房枯病菌、葡萄穗軸褐腐病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄黑痘病菌和葡萄白腐病菌菌絲的生長均有強烈抑制作用(表 I)，對 6 個病原菌的 EC5tl 值(表 3)分別為 O. 5514 mg/L、0. 7529 mg/L、I. 4329 mg/L、1.1984 mg/LU. 9479 mg/L和0. 2876 mg/L。相比之下，相同稀釋倍數條件下98%多菌靈對葡萄炭疽病菌、葡萄房枯病菌、葡萄穗軸褐腐病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄黑痘病菌和葡萄白腐病菌的菌絲生長抑制率(表2)較低，其EC5tl值(表3)分別為1.6830 mg/L、3. 1266 mg/L、 5.2827 mg/LU. 5762 mg/L、7· 1469 mg/L 和 0. 6975 mg/L。NF0919 發酵液活性的提取物對葡萄病原菌的室內毒力極顯著高于化學藥劑多菌靈。表I. NF0919菌株發酵液的提取物對葡萄病原菌的平均抑制率
權利要求
1.黃麻鏈霉菌(Streptomycescor chorus ii') NF0919菌株(該菌種特性見專利ZL201010236886. I)發酵液中代謝產物的提取方法。
2.根據權利要求I所述的黃麻鏈霉菌NF0919菌株發酵液中代謝產物的提取物，在防治葡萄炭疽病、葡萄房枯病、葡萄穗軸褐腐病、葡萄灰霉病、葡萄黑痘病和葡萄白腐病上的應用。
3.權利要求I所述的黃麻鏈霉菌NF0919菌株發酵液中代謝產物的提取方法，其特征在于包括以下步驟 (A)菌株的活化與一級種子培養液的培養 將保存的NF0919菌株的斜面在高氏一號培養基上活化，30°C培養10 d，挑取I cm2大小的菌塊接種于50 mL 一級種子培養液中，置于170 rpm搖床上30°C振蕩培養44 48 h,其中所述的50 mL—級種子培養液的成分為可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，K2HPO4 O. 2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl和K2HPO4含量的單位比例為W/V ； (B)二級種子培養液的培養 將步驟(A)所得一級種子培養液按5%的接種量接入50 mL 二級種子培養液中，170rpm,30 °C搖床上培養48 - 52 h，其中所述的5%的單位比例為V/V ;所述的50 mL 二級種子培養液的成分:馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 2%, CaCO3 O. 1%, K2HPO4 O. 05%，MgSO4 O. 05%,淀粉酶O. 01%,馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO3、K2HPO4, MgSO4和淀粉酶含量的單位比例為VV； (C)發酵培養液的培養 將步驟(B)所得二級種子培養液按5%的接種量接種于裝有160 L發酵培養液的容積為200 L的發酵罐中，其中所述的5%的單位比例為V/V，設置發酵參數為溶氧100%，消泡齊IJ(XP-100F系列發酵用有機硅消泡劑)1.6 L，攪拌速度為360 rpm,發酵溫度為36 V，發酵時間為72 h，pH 6. 8 7. 2，所述的發酵培養液的成分為馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白·2. 6%, K2HPO4 O. 05%, NaCl O. 2%, MgSO4 O. 05%, CaCO3 O. 1%，ρΗ7· 2-7. 4，馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、K2HPO4 ,NaCl、MgSO4和CaCO3含量的單位比例為W/V; (D)NF0919菌株發酵液中代謝產物提取方法 把步驟(C)所得發酵液在10000 rpm離心5 min得上清液，用濃鹽酸調節pH至2. 0，出現沉淀，再次離心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35°C真空干燥得提取物。
全文摘要
本發明為黃麻鏈霉菌NF0919菌株(其在CGMCC的保藏編號為CGMCCNo.3968，菌種專利號為ZL201010236886.1)發酵液中活性代謝產物的提取方法。代謝產物能有效防治由植物病原真菌圍小叢殼菌(Glomerellacingulata)侵染引發的葡萄炭疽病、囊孢殼菌(Physalosporabaccae)侵染引發的葡萄房枯病、鏈格孢菌(Alternariaviticola)引發的葡萄穗軸褐腐(枯)病、Coniothyriumdlodiella侵染引發的葡萄白腐病、單軸霉屬(Plasmoparaviticola)侵染引發的葡萄霜霉病、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)侵染引發的葡萄灰霉病和痂囊腔菌(Elsinaeampelina)侵染引發的葡萄黑痘病等多種植物病害。
文檔編號C12R1/465GK102899356SQ20121035462
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月23日 優先權日2012年9月23日
發明者楊敬輝, 陳宏州, 莊義慶 申請人:江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所