專利名稱：異常畢赤酵母的制作方法
技術領域：
本發明涉及異常畢赤酵母，屬于微生物領域。
背景技術：
高檔次白酒深受消費者歡迎，但質高量少，其價格也逐年上漲。大量高檔次以下的白酒需要使用成香成味物質含量較高的調味酒來進行勾調，從而達到較高的質量水平，符合相應的質量標準。傳統的調味酒生產是以純糧固態和半固態發酵的工藝模式進行的，一般使用大曲作為糖化發酵劑，而利用大曲中的多種細菌、酵母菌、霉菌和各種酶類(淀粉酶、果膠酶、纖維素酶、酸性蛋白酶等酶類)共同作用而獲得目的產物。而現代調味酒生產逐漸趨向于純菌種發酵，根據風味要求的不同，使用特殊功能性菌種進行相應風味調味酒的生產。其中，酯香調味酒的生產主要利用產酯酵母進行發酵。在生物領域，酵母作為模式生物，常用來作為表達外源基因的宿主菌。畢赤酵母作為一種甲醇利用型酵母菌，自20世紀80年代年開發以來，通過不斷的研究，至今已有多個種屬被開發出來，主要包括Candida和Pichia兩個種屬，共有30余種。其中尤以畢赤酵母發展最快，研究最清楚，也是目前行業內生產酯香調味酒使用較多的菌種之一。但由于釀酒行業是一個傳統行業，從食品安全角度考慮，目前國內還未有酒類企業對外宣稱利用轉基因菌株直接進行白酒生產。因而，通過自然選育，并使用傳統人工誘變的方式是目前酒類行業獲取特殊功能性菌株的常用途徑。盡管一些企業和研究機構對EA風味物質的生成進行過研究，也獲得了一些高產乙酸乙酯的特殊功能性菌株，其相比傳統大曲，雖然在產酯能力上有所提升，但總體上來看產酯量仍不能滿足生產要求。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一株高產乙酸乙酯的異常畢赤酵母。本發明提供的異常畢赤酵母Pichia anomala JNC-EA002,該菌株于2012年4月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCCNo. 5955，保藏地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，郵編100101。該菌株特點如下在麥芽汁瓊脂培養基上，30°C，培養24h后，菌落略突起，乳白色，表面褶皺，邊緣平滑。通過顯微鏡觀察，該菌株細胞形態為球形、卵圓形至長圓形，出牙生殖。本發明還提供了異常畢赤酵母在生產乙酸乙酯中的用途。本發明還提供了異常畢赤酵母在釀酒中的用途。本發明還提供了異常畢赤酵母在生產調味酒中的用途。本發明的菌株異常畢赤酵母Pichia anomala JNC-EA002,是從劍南春集團有限責任公司的曲藥和糟醅中分離得到，先通過生產性能選育，再經過進一步紫外線(UV)誘變所獲得的一株高產乙酸乙酯的菌株。
本發明菌株采用下述流程進行選育樣品采集一增殖培養一純種分離一生產性能測試一制備菌懸液一誘變前培養一誘變一變異菌株的分離篩選一遺傳穩定性試驗本發明的有益效果本發明的異常畢赤酵母產酯能力強，傳代性好，適合長期規模化生產使用。本發明的異常畢赤酵母的產酯能力可達到8. 75g/L，為乙酸乙酯的生產提供了新的選擇；也可用于釀酒生產和調味酒的生產。本發明提供的異常畢赤酵母P ichia anomala JNC-EA002,該菌株于2012年4月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCCNo.5955。


圖I、多株菌株代謝產物中乙酸乙酯的含量，縱坐標為乙酸乙酯的含量(單位g/L)。圖2、出發株和誘變株產酯能力分析，縱坐標為乙酸乙酯的含量(單位g/L)。
具體實施例方式本發明的異常畢赤酵母Pichia anomala JNC-EA002已于2012年4月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC No. 5955，保藏地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，郵編100101。該菌株特點如下在麥芽汁瓊脂培養基上，30°C，培養24h后，菌落略突起，乳白色，表面褶皺，邊緣平滑。通過顯微鏡觀察，該菌株細胞形態為球形、卵圓形至長圓形，出牙生殖。本發明還提供了異常畢赤酵母在生產乙酸乙酯中的用途。本發明還提供了異常畢赤酵母在釀酒中的用途。本發明還提供了異常畢赤酵母在生產調味酒中的用途。本發明的異常畢赤酵母產乙酸乙酯能力強，可用于生產乙酸乙酯；該菌株是從濃香型大曲和糟醅中分離得到的，適用于釀酒生產；乙酸乙酯是白酒中的主要香味物質，故可用本發明的異常畢赤酵母生產調味酒。下述實施例中糖化液的制備中所用到的糖化發酵設備(糖化罐、噴射液化器、真空閃急冷卻系統等)均由宜賓岷江集團岷江機械廠設計制造。下述實施例中的氣相色譜為安捷倫(Agilent)公司6890GC，色譜柱為HP-INN0WAX,檢測器溫度280°C，進樣口溫度260°C，分流比為20 1，程序升溫條件為40°C保持8min，再以5°C /min的速度升至100°C，再以15°C /min的速度升至220°C，保持8min。下述實施例中所使用的培養基均屬于購買的合成培養基，麥芽汁培養基和馬鈴薯培養基均為北京奧博星生物有限公司產品，麥芽汁培養基的貨號02-183，馬鈴薯培養基的貨號02-023 ;酵母膏培養基為北京雙旋培養基制造有限公司產品，貨號為02-22。實施例I自然選育以下菌種均為劍南春集團公司的曲藥和糟醅中分離純化得到的產乙酸乙酯較高的功能性菌種。具體過程如下
①樣品的采集曲藥樣品采集貯存期在2至3個月的濃香型大曲，選取10匹以上的半塊曲磚(不同貯存室)經過粉碎、混合，獲得曲藥綜合樣。粉碎細度為能通過20目篩(即篩子20孔/cm3)的細粉含量占曲藥總量的80%。糟醅選用中上層優質母糟(出窖糟)，取五點，即四角和中心部位的糟醅，每點各取200g混勻，作為I個糟醅子樣品。隨機取10 口窖池(不同班組)的出窖糟，獲得10各糟醅子樣品。在每個糟醅子樣品中各取200g混勻，即選育所需的糟醅綜 合樣。②菌株培養曲藥綜合樣按20g/瓶的標準裝入盛有IOOmL無菌水的250mL三角瓶中；糟醅綜合樣按IOOg/瓶的標準裝入盛有IOOmL無菌水的250mL三角瓶中。浸泡2個小時，每半小時震蕩一次。取各浸泡液的上清液10mL，加入到IOOmL已滅菌(115°C，20min)的麥芽汁液體培養基中，混勻，30°C恒溫、好氧培養24h。然后各取O. 5mL培養液涂在馬鈴薯(PDA)培養基平板上，30 0C，培養24h。選取不同菌落形態的酵母菌在麥芽汁瓊脂培養基上進行純化培養。實施例2生產性能測試菌懸液的制備用無菌棉簽蘸少許蒸餾水，讓棉簽浸潤。在已純化的菌落上輕輕轉動棉簽，讓棉頭沾滿菌種。將沾滿菌種的棉簽迅速插入盛裝20mL無菌水的比濁管中。旋轉棉簽讓菌種分散在無菌水中，由內向外，由慢到快，旋轉抽出棉簽。將菌懸液放在渦旋振蕩器上搖勻后，插入細胞濃度儀中。繼續通過此方法或者添加無菌水的方法，分別調整各種菌懸液的菌液濃度為IO6個/mL。發酵吸取2mL菌懸液和3mL無水乙醇，加入到已配制好的IOOmL麥芽汁培養基中(115°C，滅菌20min)，30°C恒溫，好氧，靜置培養72h。培養結束后，把所有發酵液倒入2000mL圓底蒸餾燒瓶中，并加入60mL質量分數為96%的酒精(分析純)和340mL純水。將圓底燒瓶放入2000mL電熱套中，通過實驗室蒸餾(蒸餾電壓220V)，進行等體積蒸餾，將發酵液中乙酸乙酯全部蒸餾出來，得餾出液IOOmL,做氣相色譜分析，了解每株菌株的產酯能力，挑選出生產性能高的優勢菌株。分析結果見表I和圖I。表I分離純化所得產酯能力較強菌株的主要代謝產物
權利要求
1.異常畢赤酵母，保藏號為CGMCCNo. 5955。
2.權利要求I所述異常畢赤酵母在生產乙酸乙酯中的用途。
3.權利要求I所述異常畢赤酵母在釀酒中的用途。
4.權利要求I所述異常畢赤酵母在生產調味酒中的用途。
全文摘要
本發明涉及異常畢赤酵母，屬于微生物領域。本發明要解決的技術問題是提供一株高產乙酸乙酯的異常畢赤酵母。本發明提供的異常畢赤酵母Pichia anomala JNC-EA002的保藏號為CGMCC No.5955。本發明還提供了該菌株在生產調味酒方面的應用。本發明的異常畢赤酵母菌株產酯能力強，適合于調味酒的大規模生產。
文檔編號C12R1/84GK102876592SQ20121035857
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月24日 優先權日2012年9月24日
發明者謝義貴, 唐勝春, 石永凌 申請人:四川劍南春(集團)有限責任公司