專利名稱：一種用于提取紫珠屬植物葉片dna的方法
技術領域：
本發明屬于植物分子生物學領域，具體而言，涉及一種紫珠屬植物新鮮葉片和硅膠干燥葉片的DNA提取方法。
背景技術：
馬鞭草科紫珠屬植物共有150余種，中國產49種，其中大多數種類葉片和根中富含黃酮類、縮合鞣質、多糖類等次生代謝物質，具有止血、散瘀、消炎等功效，因此本屬許多種植物是我國傳統的中藥材。此外，本屬植物因果實紫色似串串珍珠而得名，是優良的秋冬季觀果園林植物，極具觀賞價值和開發前景，但有些種類存在株型散亂、果實小、抗性差等問題，因此，為了改良上述不良性狀，開發本屬植物的園林觀賞價值，有必要開展紫珠屬植物的育種研究，從而獲得園林性狀更加優良的資源。
隨著分子生物學的發展，利用分子標記輔助育種技術可大大加快育種進程，提高育種效率。而DNA提取是開展分子標記研究的前提和關鍵。紫珠屬植物作為藥用植物，其葉片和根部都含有較多的黃酮類、縮合鞣質，這些次生代謝物的存在嚴重影響了 DNA提取的純度，進而影響到后續的DNA擴增工作。因此，紫珠屬植物的DNA成功提取是開展本屬植物分子標記和輔助育種研究的重要前提。關于紫珠屬植物葉片DNA提取方法未見報道。
電泳結果表明，傳統的DNA提取方法(如SDS法)提取出來的本屬植物老鴉糊、紫珠、枇杷葉紫珠等種類的葉片DNA中常含有蛋白質，在紫外燈下表現為點樣孔呈現亮帶，DNA純度檢測顯示A26(i/2M小于I. 80，且由于葉片中含有較多的黃酮類、縮合鞣質等雜質，這些物質的存在對后續的分子標記技術有很大的影響。因此，有必要對紫珠屬植物的葉片DNA提取方法進行改進。

發明內容
針對上述情況，為了克服現有技術的缺陷，本發明的目的在于通過大量試驗研究，提供一種用于提取紫珠屬植物葉片DNA的方法。該方法可有效解決傳統SDS提取法提取的總DNA帶有少量蛋白，并消除紫珠屬植物葉片內過多的黃酮類、縮合鞣質等雜質造成的DNA純度低的問題。本發明的目的是這樣實現的
一種用于提取紫珠屬植物葉片DNA的方法，包括如下步驟
(1)在滅菌離心管中加入裂解液，備用，所述裂解液包含如下組分pH8.0的Tris HCl80-120mM、pH8.0 的 EDTA 30_60mM、NaCl 60-120mM、3_6wt% PVPU. 5-2wt% SDS、2_3wt% 巰基乙醇、0. 7-1. 2wt% RNAase ；
(2)取紫珠屬植物的葉片，在研缽中加液氮迅速研磨呈粉末，然后將粉末轉入所述離心管中，使樣品與裂解液充分混勻；
(3)將上述離心管置于62-68°C水浴中保溫15-30min，期間輕輕搖動離心管2_4次；
(4)取出離心管，加入KAc使終濃度為0.8-1. 2M，然后冰浴15_30min ；(5)室溫下10000-15000rpm 離心；
(6)取上清液置另一滅菌離心管中，加入等體積的氯仿異戊醇混合溶液，其配比是氯仿異戊醇體積比為24 :1，混勻，室溫下6000-10000rpm離心；
(7)取上清液置于新的滅菌離心管中，重復步驟(6)操作；
(8)離心后取上清液轉入新的滅菌離心管中，加入2/3體積的_20°C下預冷的異丙醇，混勻，置于_20°C冰箱中20-40min ；
(9)取出后6-12°C下10000-1500 0rpm離心，棄上清液，收集沉淀；
(10)加入70%(v/v)乙醇漂洗沉淀，然后6-12°C下13000-18000rpm離心，棄上清，收集沉淀；
(11)重復步驟(10)操作；
(12)棄上清，得基因組DNA。優選地，所述用于提取紫珠屬植物葉片DNA的方法，包括如下步驟
(1)在滅菌離心管中加入裂解液，備用，所述裂解液包含如下組分pH8.0的Tris HCl90-110mM、pH8. (^AEDTA 45-50mM、NaCl 90-100mM、4_5wt% PVPU. 5-2wt% SDS、2. 3-2. 7wt%疏基乙醇、0. 9-1. lwt% RNAase ；
(2)取紫珠屬植物的葉片，在研缽中加液氮迅速研磨呈粉末，然后將粉末轉入所述滅菌離心管中，上下顛倒，使樣品與裂解液充分混勻；
(3)將上述離心管置于65°C水浴中保溫20min，期間輕輕搖動離心管2_3次；
(4)取出離心管，加入KAc使終濃度為0.95-1. 05M，然后冰浴20 min ；
(5)室溫下13000 rpm 離心 20 min ；
(6)取上清液置另一滅菌離心管中，加入等體積的氯仿異戊醇混合溶液，其配比是氯仿異戊醇體積比為24 :1，輕輕顛倒離心管，混勻，室溫下8000 rpm離心IOmin ；
(7)取上清液置于新的滅菌離心管中，重復步驟(6)操作一次；
(8)離心后取上清液轉入新的滅菌離心管中，加入2/3體積的_20°C下預冷的異丙醇，輕輕顛倒混勻，置于-20 °C冰箱中30 min ；
(9)取出后9"€下13000 rpm離心10 min,棄上清液,收集沉淀；
(10)加入70%(v/v)乙醇漂洗沉淀,然后9°C下15000 rpm離心15 min,棄上清,收集沉淀；
(11)重復步驟(10)操作一次；
(12)棄上清，得基因組DNA。進一步優選地，所述用于提取紫珠屬植物葉片DNA的方法，其中步驟(2)所述的植物葉片應去除葉柄、葉脈部分，取葉肉部分，其用量為約Icm2面積，質量約20mg。進一步優選地，所述用于提取紫珠屬植物葉片DNA的方法，其中所述紫珠屬植物為白棠子、老鴉糊、紫珠、枇杷葉紫珠、大葉紫珠、白毛紫珠、杜虹花、短柄紫珠、裸花紫珠。進一步優選地，所述用于提取紫珠屬植物葉片DNA的方法，其中所述紫珠屬植物的葉片為新鮮葉片或硅膠干燥葉片。本發明涉及的紫珠屬植物葉片DNA提取方法與傳統SDS提取法相比，具有以下優點和顯著的進步
(I)最終提取的因組DNA純度高，有效克服了傳統CTAB法提取含有蛋白、DNA純度較低等問題，保證了后續分子標記技術的順利開展。(2)提取時間縮短為4-5h，提高了工作效率。(3)所需的樣品量少，DNA得率高，僅需20mg葉片，提取的DNA可以滿足分子標記
的用量。(4)根據紫珠屬植物的特點進行改進，是適合紫珠屬植物葉片DNA提取的通用方法，尤其適用于白棠子、老鴉糊、紫珠、枇杷葉紫珠、大葉紫珠、白毛紫珠、杜虹花、短柄紫珠、裸花紫珠等本屬植物葉片DNA提取。此外，本發明同樣適用于其它蛋白不易去除以及含黃酮類、縮合鞣質等次生代謝物質的植物葉片DNA提取。(5)適用于采用硅膠法干燥保存的紫珠屬植物葉片，解決了外地采樣的長距離運 輸導致樣品失效的問題。
具體實施例方式以下通過實施例形式對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明，但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。實施例一新鮮葉片DNA的提取
裂解緩沖液成分為Tris .Cl 100 mM,pH8. 0 ；EDTA 50mM, pH8. 0 ；NaCl IOOmM ；5% PVP,配置好后高溫121°C滅菌20min備用；
在I. 5 mL滅菌離心管中加入500 ML裂解緩沖液、50 ML 20%的SDS、14 ML巰基乙醇、5ML RNAase備用；取白棠子新鮮葉片大約Icm2，在研缽中加液氮迅速研磨呈粉末，之后將粉末轉移至上述離心管中，上下顛倒，使樣品與裂解液充分混勻；將上述離心管置于65 °〇水浴中保溫20 min，其間輕輕搖動離心管2-3次；取出離心管，加入150 ML 5M的KAc，然后冰浴20 min ;室溫下13000 rpm離心20 min ;取上清液置滅菌離心管中，加入等體積的氯仿異戊醇混合溶液，其配比是氯仿異戊醇體積比為24 :1，輕輕顛倒離心管，混勻，室溫下8000 rpm離心10 min ;取上清液置于新的I. 5 mL無菌離心管中，重復等體積氯仿異戍醇抽提一次；離心后取上清液轉入新的I. 5 mL離心管中，加入2/3體積的-20 °C下預冷的異丙醇，輕輕顛倒混勻，置于-20 °C冰箱中30min ;取出后9 "€下13000 rpm離心10 min,棄上清液，收集沉淀；加入70% (體積比)乙醇I mL漂洗沉淀，然后9°C下15000 rpm離心15min,棄上清，收集沉淀；重復70%乙醇漂洗一次；棄上清，將離心管倒置在吸水紙上，風干，得風干物，用50ML TE緩沖液溶解，即得高質量的基因組DNA，經過稀釋后可直接用于PCR擴+
>曰o實施例二硅膠法干燥保存葉片DNA的提取
野外樣品保存野外采集枇杷葉紫珠的幼嫩葉片3-4片，裝入50mL離心管中，用藍色硅膠顆粒填充葉片與離心管壁之間的空隙，注意盡量使葉片完全被硅膠顆粒包埋，然后旋緊離心管蓋，于1-2天內、硅膠變為粉紅色前帶回室內，將葉片取出放入空離心管中，放A _70°C冰箱中保存。裂解緩沖液成分為=Tris Cl 100 mM, pH8. 0 ；EDTA 50mM, pH8. 0 ；NaCl IOOmM ；5%PVP，配置好后高溫121°C滅菌20min備用；
DNA提取0嫩提取在1.5 mL滅菌離心管中加入500 ML裂解緩沖液、50 ML 20%的SDS、14 ML巰基乙醇、5ML RNAase備用；從超低溫冰箱中取枇杷葉干燥葉片大約1cm2，在研缽中加液氮迅速研磨呈粉末，之后將粉末轉移至上述離心管中，上下顛倒，使樣品與裂解液充分混勻；將上述離心管置于65 °C水浴中保溫20 min，其間輕輕搖動離心管2-3次；取出離心管，加入150 ML 5M的KAc，然后冰浴20 min ;室溫下13000 rpm離心20 min ;取上清液置滅菌離心管中，加入等體積的氯仿異戊醇混合溶液，其配比是氯仿異戊醇體積比為24 :1，輕輕顛倒離心管，混勻，室溫下8000 rpm離心10 min ;取上清液置于新的I. 5 mL無菌離心管中，重復等體積氯仿異戊醇抽提一次；離心后取上清液轉入新的I. 5 mL離心管中，加入2/3體積的_20°C下預冷的異丙醇，輕輕顛倒混勻，置于-20 °C冰箱中30min ;取出后9 °C下13000 rpm離心10 min,棄上清液，收集沉淀；加入70%(體積比)乙醇I mL漂洗沉淀，然 后9°C下15000 rpm離心15 min，棄上清，收集沉淀；重復70%乙醇漂洗一次；棄上清，將離心管倒置在吸水紙上，風干，得風干物，用50ML TE緩沖液溶解，即得高質量的基因組DNA，經過稀釋后可直接用于PCR擴增。
權利要求
1.ー種用于提取紫珠屬植物葉片DNA的方法，包括如下步驟 (1)在滅菌離心管中加入裂解液，備用，所述裂解液包含如下組分pH8.O的Tris · HCl80-120mM、pH8.O 的 EDTA 30_60mM、NaCl 60-120mM、3_6wt% PVPU. 5-2wt% SDS、2_3wt% 巰基こ醇、0· 7-1. 2wt% RNAase ； (2)取紫珠屬植物的葉片，在研缽中加液氮迅速研磨呈粉末，然后將粉末轉入所述離心管中，使樣品與裂解液充分混勻； (3)將上述離心管置于62-68°C水浴中保溫15-30min，期間輕輕搖動離心管2_4次； (4)取出離心管，加入KAc使終濃度為O.8-1. 2M，然后冰浴15_30min ； (5)室溫下10000-15000rpm 離心； (6)取上清液置另ー滅菌離心管中，加入等體積的氯仿異戊醇混合溶液，其配比是氯仿異戊醇體積比為24 :1，混勻，室溫下6000-10000rpm離心； (7)取上清液置于新的滅菌離心管中，重復步驟(6)操作； (8)離心后取上清液轉入新的滅菌離心管中，加入2/3體積的-20°C下預冷的異丙醇，混勻，置于_20°C冰箱中20-40min ； (9)取出后6-12°C下10000-15000rpm離心，棄上清液，收集沉淀； (10)加入70%(v/v)こ醇漂洗沉淀，然后6-12°C下13000-18000rpm離心，棄上清，收集沉淀； (11)重復步驟(10)操作； (12)棄上清，得基因組DNA。
2.根據權利要求I所述用于提取紫珠屬植物葉片DNA的方法，其特征在于包括如下步驟 (1)在滅菌離心管中加入裂解液，備用，所述裂解液包含如下組分pH8.O的Tris · HCl90-110mM、pH8. O 的 EDTA 45_50mM、NaCl 90-100mM、4_5wt% PVPU. 5-2wt% SDS、2. 3-2. 7wt%疏基こ醇、0. 9-1. lwt% RNAase ； (2)取紫珠屬植物的葉片，在研缽中加液氮迅速研磨呈粉末，然后將粉末轉入所述滅菌離心管中，上下顛倒，使樣品與裂解液充分混勻； (3)將上述離心管置于65°C水浴中保溫20min，期間輕輕搖動離心管2_3次； (4)取出離心管，加入KAc使終濃度為O.95-1. 05M，然后冰浴20 min; (5)室溫下13000 rpm 離心 20 min ； (6)取上清液置另ー滅菌離心管中，加入等體積的氯仿異戊醇混合溶液，其配比是氯仿異戊醇體積比為24 :1，輕輕顛倒離心管，混勻，室溫下8000 rpm離心IOmin ； (7 )取上清液置于新的滅菌離心管中，重復步驟(6 )操作一次； (8)離心后取上清液轉入新的滅菌離心管中，加入2/3體積的-20°C下預冷的異丙醇，輕輕顛倒混勻，置于-20で冰箱中30 min ； (9)取出后9°C下13000 rpm離心10 min,棄上清液,收集沉淀； (10)加入70%(v/v)こ醇漂洗沉淀,然后9で下15000 rpm離心15 min,棄上清,收集沉淀； (11)重復步驟(10)操作一次； (12)棄上清，得基因組DNA。
3.根據權利要求I或2所述用于提取紫珠屬植物葉片DNA的方法，其特征在于步驟(2)所述的植物葉片應去除葉柄、葉脈部分，取葉肉部分，其用量為約Icm2面積，質量約20mgo
4.根據權利要求I或2所述用于提取紫珠屬植物葉片DNA的方法，其特征在于所述紫珠屬植物為白棠子、老鴉糊、紫珠、枇杷葉紫珠、大葉紫珠、白毛紫珠、杜虹花、短柄紫珠、裸花紫珠。
5.根據權利要求I或2所述用于提取紫珠屬植物葉片DNA的方法，其特征在于所述紫珠屬植物的葉片為新鮮葉片或硅膠干燥葉片。
全文摘要
本發明公開了一種用于提取紫珠屬植物葉片DNA的方法，該方法是對傳統SDS提取法的改進，適用于紫珠屬植物的新鮮葉片或硅膠干燥葉片DNA提取，可有效解決傳統SDS法提取的總DNA帶有少量蛋白，并消除紫珠屬植物葉片內過多的黃酮類、縮合鞣質等雜質造成的DNA純度低的問題。
文檔編號C12N15/10GK102851278SQ20121035882
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月25日 優先權日2012年9月25日
發明者許林, 杜克兵, 陳法志, 戢小梅, 謝焰鋒, 郭彩霞, 周媛, 童俊, 陳衛東 申請人:武漢市林業果樹科學研究所