專利名稱：一株解淀粉芽孢桿菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株具有高效解磷能力的芽孢桿菌菌株及其在制備生物活化劑中的應用。
背景技術：
磷是植物生長發育所必須的礦物質元素之一，植株缺磷時，會出現分蘗推遲、穗粒數減少、籽粒干癟等現象。我國有74%的耕地土壤缺磷，約有95%的土壤中磷為難溶形式，所以植株很難直接吸收利用。目前，農業生產上多是通過反復施加磷肥來獲得高產，但是磷肥施入土壤后易與Ca2+、Fe2+、Al3+等金屬離子結合生成難溶性的磷酸鹽，導致磷肥失效，不能被作物直接利用，這樣不僅增加了農業成本，還造成了嚴重的環境和生態問題。
土壤中有許多微生物具有解磷能力，它們可以將土壤中難溶性的有機磷或無機磷轉化成植物可以利用的磷，將這類微生物制成解磷菌劑，對提高磷肥利用率、減少磷肥投入和溶解土壤難溶磷等方面起著重要的作用，對保持農業生態環境的平衡、發展持續高效農業具有深遠的戰略意義。目前，已報道的具有解磷能力的微生物包括細菌、真菌和放線菌等，其中解磷細菌的數量和種類較多，如芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、埃希氏菌屬(Escherichia)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)等。利用解磷細菌制成菌肥施入土壤后，不僅能夠提高土壤可溶磷含量，而且能夠加強土壤中硝化細菌和其他有益微生物的活動、改善植物根部營養，提高作物的產量。由于解磷菌種類的不同，以及不同解磷菌解磷能力的差異，所以解磷菌的篩選尤為重要。解磷菌篩選的成果如下現有技術一“一種解磷真菌及其在制備生物菌肥中的應用”(中國專利文獻，申請號201010590115. 2)。該發明米用常規方法從云南省晉寧縣磷礦廠礦土中利用解磷微生物篩選培養基，篩選獲得解磷真菌Penicillium oxalicum Mo-Po菌株。該發明利用Mo-Po菌株堆肥發酵煙草廢棄物制備的生物菌肥能作為各種蔬菜種植中的基肥，在土壤含磷量較高的農田里能夠作為化學磷肥的替代品。然而，該發明篩選解磷真菌時采集的樣品來源范圍小，相對來說解磷真菌的種類數量較少，且在傳代的過程中容易蛻化，從而在進一步的純化過程中容易失去解憐能力。現有技術二 “一種當歸根際高效解磷菌及其制備得到的菌劑和應用”(中國專利文獻，申請號201110103328. 2)。該發明公布了一株當歸根際高效解磷菌Bacillussp. DGP01，該解磷菌能將難溶性的無機磷轉化為可供植物直接利用的優質磷素化合物，提高土壤中磷肥利用效率和難溶性磷的生物可溶性。遺憾之處是，該解磷菌只對土壤無機磷具有解磷作用，對難溶性有機磷無效。現有技術三“高效解磷的丁酸梭菌A5-4及應用”(中國專利文獻，申請號201010153419. 2)。該發明從化糞池底泥中分離篩選得到一株高效解磷的丁酸梭菌，該菌株可以在厭氧的條件下溶解磷酸鈣，將該菌株制成微生物菌肥后施入土壤，可以提高土壤中的可溶磷含量。然而，該解磷菌時采集地點限于無氧環境，篩選出的菌株為厭氧菌，即對水生作物如水稻或是水產品養殖等具有解磷能力，對大多數好氧作物沒有什么效果，應用范圍較小。

發明內容
本發明的目的是提供一株高效解磷菌即解淀粉芽孢桿菌，該菌株對土壤中的難溶性的有機磷和無機磷均具有較好的溶解效果。本發明所提供的高效解磷芽孢桿菌，為一株解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) PS57CGMCC No. 6473。所述的解淀粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) PS57 CGMCC No. 6473,是革蘭氏陽性桿菌，頂端生芽孢；在Yro培養基上生長良好，48h形成直徑2-3mm大小的圓形菌落，有運動性，好氧，菌落呈白色有光澤，表面濕潤、平坦，邊緣整齊；生長溫度范圍250C -37°C，最適生長溫度30°C -37°C ;生長酸堿度范圍pH 2-9，最適pH值為7.0。 本發明另一目的在于提供一種高效解磷微生物菌劑，其活性成分為所述的解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) PS57 CGMCC No. 6473。該高效解磷微生物菌劑,為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)PS57CGMCC No. 6473的發酵液；或為所述發酵液與草炭、輕質碳酸鈣經混合、粉碎得到的，三者混合比例為1:3-5:0. 03-0. 05，優選1:4:0. 04 (重量比)。本發明還一目的在于提供一種得到所述解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) PS57 CGMCC No. 6473的發酵液的方法，包括以下步驟I)制備一級種子液將所述PS57接種于LB液體培養基中，37°C培養18_20h，得到一級種子液；2)制備二級種子液將步驟I)中的一級種子液按照總體積5-8%的接種量接入LB液體培養基中，于37°C培養22-26h (優選24h)，得到二級種子液；3)發酵培養將步驟2)中的二級種子液按照總體積5-8%的接種量接入發酵培養基(發酵培養基配方葡萄糖10g，豆柏粉10g，玉米淀粉5g，酵母粉lg，磷酸二氫鉀I. lg，氯化鈣0. lg，硫酸鎂I. 5g，硫酸錳0. lg，蒸餾水1000mL，pH7. O ;使用前用常規方法115°C滅菌30min)中，37°C培養24h，得到PS57的發酵液。本發明再一目的在于提供一種制備所述高效解磷微生物菌劑的方法，將所述發酵液與高溫滅菌后的草炭、輕質碳酸鈣按照的比例在攪拌機內攪拌均勻，粉碎后得到。本發明還提供一種活化磷肥，包括磷肥和按磷肥質量的1-50%添加的所述高效解磷微生物菌劑。本發明還提供解淀粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) PS57 CGMCCNo. 6473在溶解土壤難溶磷中的應用。該應用中，所述土壤難溶磷為包括磷酸鈣、磷灰石和磷鐵礦中的磷酸三鈣等的無機磷，或包括卵磷脂等在內的有機磷。本發明基于一株高效解磷菌一解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)PS57 CGMCC No. 6473提出以上技術方案，該菌株是從安徽的植物根圍土壤中經分離、純化篩選得到的高效解磷菌株。在實驗室培養環境下，該菌株能夠可溶提高土壤中的可溶磷含量，將用該菌株制成的菌劑和土壤充分混勻后，播種冬小白菜D49 (種子，購自昌平區沙河南大橋農貿市場)，于溫室中培養40天，然后收獲植株，測量葉片中的磷含量和根系土壤中的可溶磷含量，結果葉片中的磷含量提高了 36. 8 %，根系土壤中的可溶磷含量提高了80. I %，說明該菌株具有很強的解磷作用。本發明將對提高磷肥的利用率，節約磷礦資源，改善生態環境，提高作物產量，以及為制備解磷細菌肥料(如微生物解磷菌劑等)提供優良高效的菌株資源等方面起到重要作用，應用前景廣闊。下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。


圖I為磷標準曲線。
具體實施方式

本發明從土壤中篩選出一株具有較強解磷能力的菌株，即解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens),名稱為PS57,該菌株已于2012年8月23日保藏于位于中國北京市朝陽區北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 6473。解淀粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciences) PS57CGMCC No. 6473 是革蘭氏陽性桿菌，頂端生芽孢；在YPD培養基上生長良好，48h形成直徑2-3mm大小的圓形菌落，有運動性，好氧，菌落呈白色有光澤，表面濕潤、平坦，邊緣整齊；生長溫度范圍25°〇-371，最適生長溫度301-371;生長酸堿度范圍pH 2_9，最適pH值為7. O ;部分生化特性如表I所示表I 解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciences)PS57CGMCC No. 6473 的部分生化特性
_試驗項目_果_
V-P測定+
淀粉水解+
吲哚產生+
明膠液化+葡萄糖氧化發酵+
甲基紅+
運動性+
厭氧生長一 氧化_ 一 過氧化氫酶_二_注“ + ”表示反應陽性；“一”表示反應陰性。解淀粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciences)PS57CGMCC No. 6473 的篩選過程記載于實施例中。
在上述基礎上，本發明還繼續提供了一種高效解磷微生物菌劑。本發明所提供的菌劑，其活性成分為解淀粉芽孢桿菌(Baci I Ius amyIoI iquefaciens ) PS57 CGMCCNo.6473。以下以實施例進一步詳述本發明。實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。實施例I、高效解磷菌解淀粉芽孢桿菌PS57 CGMCC No. 6473的篩選及保藏用本發明的方法篩選高效解磷菌，即解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens),具體方法包括以下步驟 I、初篩篩選物品為來自北京小湯山、安徽合肥、河北廊坊、湖北宜昌、山東煙臺、新疆賈登嶺、河南南陽等地的農作物或園藝植物根圍土壤。具體篩選方法為每份土樣稱取5g，分別放入盛有IOOmL無菌水和玻璃珠的三角瓶中，在搖床上劇烈振蕩30min后于80°C的水浴中保持15-20min。然后用無菌水進行梯度稀釋成10'10_4、10_5、10'10_7后涂布篩選平板(無機磷細菌篩選培養基的配方為葡萄糖10g，磷酸三鈣5g，硫酸銨O. 5g，氯化鈉O. 2g，硫酸鎂O. lg，氯化鉀O. 2g，酵母粉O. 5g，硫酸錳O. 002g，0. 4%溴酚藍(ρΗ6· 7)6mL，瓊脂18g，蒸餾水IOOOmL, pH自然；使用前用常規方法115°C滅菌30min)，每梯度涂2_3皿，于30°C培養箱內培養72h，挑取菌落形態差異明顯的單菌落，選擇溶磷圈直徑大(溶磷圈直徑大于3)及HD/CD (溶磷圈/菌落直徑，解磷指數)數值大(HD/CD數值大于2)的菌落，轉接于LB斜面培養基(LB培養基配方10g胰蛋白胨，5g/酵母粉，IOg NaCl，蒸餾水1000mL，pH 7.0-7. 2，固體培養基加入2%瓊脂；使用前用常規方法115°C滅菌30min)中備用。2、細菌解磷能力的測定2. I檢測細菌對無機磷的解磷能力用無機磷細菌液體培養基(配方為葡萄糖10g，硫酸銨O. 5g，酵母粉O. 5g，氯化鈉O. 3g，氯化鉀O. 3g，硫酸鎂O. 3g，硫酸亞鐵O. 03g，硫酸錳O. 03g，磷酸鈣(Ca3 (P04)2)5g (水不溶物)，蒸餾水lOOOmL，pH 7. 0-7. 5，使用常規方法115°C滅菌30min)測定菌株的解磷能力，測定方法為先預培養將細菌接種到盛有LB液體培養基的三角瓶中，置30°C、200rpm搖床振蕩培養24h得到預培養菌液；然后進行二次培養將細菌轉接到裝有無機磷細菌液體培養基的三角瓶中，每IOmL培養基中加入預培養菌液IOOul，置30°C、200rpm搖床振蕩培養72h ;培養結束后加入無磷活性碳脫色，然后12000rpm高速離心lOmin，將上清液傾出待測。用鑰銻抗比色法測定上清液中磷含量，得到培養菌液中可溶磷的量，菌液中可溶磷量越高表明對應菌株解磷能力越強。磷含量具體測定方法如下2. I. I)吸取上清液0. 5mL置于50mL容量瓶中，用水稀釋至20mL，用IM NaOH或稀硫酸溶液調節PH至3.0，然后到預先置有5mL鑰銻抗顯色劑鑰銻抗顯色劑稱I. 5g抗壞血酸(C6H8O6,左旋比旋光度+21-22度)，溶于IOOmL鑰銻抗貯存液中，此液隨配隨用，可溶期I天；鑰鋪抗儲存液濃硫酸(H2SO4)(分析純)153mL緩緩地傾入約400mL蒸懼水)中,攪拌、冷卻，10. Og鑰酸銨(分析純溶于約60°C的300mL水中，冷卻，然后將硫酸溶液緩緩滴入鑰酸銨溶液中，再加入IOOmL 0. 5%酒石酸銻鉀溶液[K(SbO)C4H4O6 · 1/2H20，分析純]，最后用水稀釋至1L，盛于棕色瓶中的50mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻。在室溫(20°C -25°C)下放置30min后用分光光度計在波長700nm比色。讀取數值，利用磷標準曲線計算出顯色液中磷的讀數。顏色在8h內可保持穩定。2. I. 2)磷標準曲線的繪制分別吸取5mg/L磷標準溶液(5mg/L磷標準液稱取在105°C烘箱中烘2h后冷卻的磷酸二氫鉀O. 439g溶于200mL水中，加入5mL濃硫酸，轉入IL容量瓶中，用蒸餾水定溶至刻度即為100mg/L磷標準液，可長期保存備用。取此溶液準確稀釋20倍即為5mg/L磷標準液，此溶液不宜久放)0、l、2、3、4、5、6mL于50mL容量瓶中，加水稀釋至約20mL，加入鑰銻抗顯色劑5mL，搖勻定容，即得0,0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6mg/L磷標準系列溶液，用分光光度計上在波長700nm比色分析，得到各溶液的吸光值數值。以吸光值為縱坐標，磷濃度為橫坐標，繪制成磷標準工作曲線，如圖I所示。2. 2檢測細菌對無機磷的解磷指數利用平板檢測(1)分別將PS16、PS21、PS57、PS69、PS81、PS87、PS94、PS123、PS158、PS202、PS214共11株細菌轉接至已滅菌的LB液體培養基，置于30°C培養箱培養24小時。(2)用移液器吸取IOul菌液滴到無機磷細菌固體培養基平板上(無機磷細菌固體培養基的配方為葡萄糖10g，磷酸三鈣5g，硫酸銨O. 5g，氯化鈉O. 2g，硫酸鎂O. lg，氯化鉀`·O. 2g，酵母粉 O. 5g，硫酸錳 O. 002g，0. 4%溴酚藍(ρΗ6· 7) 6mL,瓊脂 18g，蒸餾水 IOOOmL, pH自然；使用常規方法115°C滅菌30min)置于30°C恒溫箱中培養72h，觀察菌落生長情況及透明圈產生情況、測量菌落直徑和透明圈直徑，計算解磷指數HD/CD (溶磷圈/菌落直徑)。2. 3測定結果不同菌株在無機磷細菌篩選平板上的解磷指數和在無機磷細菌液體培養基中的解磷能力測定結果如表I所示。不同標號的解磷菌解磷能力的測量，是將該號菌液與其經高溫高壓滅活的死菌液同時進行比色分析(以滅活菌液為參照)得出的。結果確定PS57為一株高效解磷細菌，該解磷菌株發酵液中的可溶無機磷含量為55. 8mg/L，較空白對照樣品(可溶無機磷含量28. 6mg/L，是將培養基在121°滅菌20min，作為空白對照)提聞95. I %。表I解磷菌PS57和其他解磷菌株的解磷指數和解磷能力測定結果
權利要求
1.一株解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) PS57 CGMCC No. 6473。
2.根據權利要求I所述的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)PS57 CGMCCNo. 6473，其特征在于其為是革蘭氏陽性桿菌，頂端生芽孢；在YPD培養基上生長良好，48h形成直徑2-3mm大小的圓形菌落，有運動性，好氧，菌落呈白色有光澤，表面濕潤、平坦，邊緣整齊；生長溫度范圍25°C _37°C，最適生長溫度30°C _37°C;生長酸堿度范圍pH2_9，最適pH值為7.0。
3.一種高效解磷微生物菌劑，其活性成分為權利要求I或2所述的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) PS57 CGMCC No. 6473。
4.根據權利要求3所述高效解磷微生物菌劑，其特征在于，為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) PS57 CGMCC No. 6473 的發酵液。
5.根據權利要求4所述高效解磷微生物菌劑，其特征在于，為所述發酵液與草炭、輕質碳酸鈣經混合、粉碎得到的，三者混合比例為1:3-5:0. 03-0. 05，優選1:4:0. 04 (重量比)。
6.一種得到權利要求4所述解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) PS57CGMCC No. 6473的發酵液的方法，包括以下步驟 1)制備一級種子液將所述PS57接種于LB液體培養基中，37°C培養18_20h，得到一級種子液； 2)制備二級種子液將步驟I)中的一級種子液按照總體積5-8%的接種量接入LB液體培養基中，于37°C培養22-26h (優選24h)，得到二級種子液； 3)發酵培養將步驟2)中的二級種子液按照總體積5-8%的接種量接入發酵培養基(發酵培養基配方葡萄糖10g，豆柏粉10g，玉米淀粉5g，酵母粉lg，磷酸二氫鉀I. lg，氯化鈣0. lg，硫酸鎂1.58，硫酸錳0. lg，蒸餾水lOOOmL，pH7. O ;使用前用常規方法115°C滅菌30min)中，37°C培養24h，得到PS57的發酵液。
7.一種制備權利要求5所述高效解磷微生物菌劑的方法，將權利要求4所述發酵液與高溫滅菌后的草炭、輕質碳酸鈣按照的比例在攪拌機內攪拌均勻，粉碎后得到。
8.一種活化磷肥，其特征在于，包括磷肥和按磷肥質量的1-50%添加的權利要求5所述高效解磷微生物菌劑。
9.解淀粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) PS57CGMCC No. 6473 在溶解土壤難溶磷中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于所述土壤難溶磷為包括磷酸鈣、磷灰石和磷鐵礦中的磷酸三鈣等的無機磷，或包括卵磷脂等在內的有機磷。
全文摘要
本發明公開了一株高效解磷菌—解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)PS57 CGMCC No.6473。冬小白菜D49生長試驗顯示，土壤中摻有該菌體后，葉片中的磷含量提高了36.8%％，根系土壤中的磷含量提高了80.1％，說明該菌株具有很強的解磷作用。本發明將對提高磷肥的利用率，節約磷礦資源，改善生態環境，提高作物產量，以及為制備解磷細菌肥料(如微生物解磷菌劑等)提供優良高效的菌株資源等方面起到重要作用，應用前景廣闊。
文檔編號C12N1/20GK102876608SQ20121036408
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月26日 優先權日2012年9月26日
發明者許仁杰, 伍樹明, 伍洲, 左麗娟, 張思 申請人:中國醫藥研究開發中心有限公司