專利名稱：基因突變型重組蛋白酶k及其工業化生產方法
技術領域：
本發明涉及一種基因突變型重組蛋白酶K及其工業化生產方法。更具體而言，本發明涉及一種經過基因改造和蛋白質工程化得到的酶活性為同種天然蛋白酶活性2倍以上的基因突變型重組蛋白酶K;以及利用酵母細胞大規模培養表達外源蛋白，制備所述基因突變型重組蛋白酶K的工業化生產方法和工藝過程。
背景技術：
蛋白酶K是一種絲氨酸蛋白酶，于1974年首次在林伯氏白色念球菌(Tritirachium album limber)的提取物中發現(Ebeling W 等，Eur J Biochem. 1974 Aug15;47(1) :91-7)。由于該酶能夠消化富含二硫鍵的天然角蛋白，林伯氏白色念球菌能夠以角蛋白作為唯一的碳源/氮源生長，蛋白酶K也由此得名。
蛋白酶K最大的特點在于對天然蛋白質具有廣譜高效的切割能力，是現有蛋白酶中活性最高的一種。該酶偏好于切割脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸，特別是丙氨酸的羧基端妝鍵。此外，蛋白酶K還是一種穩定性非常出色的酶，在pH 4、H 12、20°C 60°C的條件下均有活性，在多種能夠使蛋白質變性的化學試劑(如SDS、尿素、螯合劑(如EDTA)及巰基試劑(如胰蛋白酶抑制劑或糜蛋白酶抑制劑))中也具有切割蛋白質的能力。由于細胞裂解過程中通常使用SDS溶液，而蛋白酶K在O. 5% (w/v)的SDS溶液中依然能夠維持完全的活性，使得其可應用于核酸提取中，通過快速降解細胞裂解釋放出的胞內核酸酶，分離得到完整的核酸片段。在先研究還表明，蛋白酶K在去污劑(如TritonX-100)中也具有出色的穩定性，因而還被廣泛用于膜蛋白及跨膜蛋白的研究中。近年來，蛋白酶K的應用并不僅僅局限在醫療診斷及科研領域，在工業制革、造紙、飼料等領域中也可以替代傳統的可能存在污染的化學方法處理原材料。因此，得到高活性、低造價的蛋白酶K具有實際意義。然而，天然蛋白酶K依靠傳統發酵提取，產量很低，成本較高，不適合今后該產品的大規模運用。因此，目前本領域的研究焦點集中在利用基因工程技術和蛋白質工程技術，改造蛋白質的分子結構，期望得到活性更高、成本更低的蛋白酶K。迄今為止，現有工業化生產的基因重組蛋白酶K是以原核細胞為宿主，譬如大腸桿菌表達系統，其優點是簡便、經濟。然而，該系統表達得到的蛋白酶K活性不高或者沒有活性，達不到天然蛋白酶K的水平，這可能是由于蛋白酶K需要轉錄或翻譯后處理過程，原核系統無法實現這個功能。此外，利用原核細胞進行外源蛋白表達的產量過低，因而難以滿足市場需求。此外，若想獲得商品化的蛋白酶K產品，下游純化和凍干技術非常重要，目前在這方面并沒有可以借鑒的資料。例如，利用已經報道的純化方法均不能得到大批量、高產率的蛋白酶K。經過本發明人的測試，這些純化方法在規模化生產中實用價值不高。為解決上述問題，本發明人進行了深入的研究，結合了基因突變和真核細胞-酵母外分泌表達技術，從改造蛋白酶K分子結構入手，得到活性提高的基因突變型重組蛋白酶K ;優化表達系統,利用酵母細胞外分泌表達技術,大規模發酵高效表達基因突變型重組蛋白酶K，進一步提高蛋白酶K的活性及產量；采用新型蛋白純化方式，提高蛋白酶K純化過程中的收率，從而實現了規模化和連續化生產，完成了本發明。目前在專利文件和非專利文件中均未發現關于基因突變型重組蛋白酶K在酵母中工業化生產的報道。

發明內容
野生型蛋白酶K前體由384個氨基酸組成(SEQ ID NO. 1，UniProtKB/Swiss-Prot:P06873. 2)，包括15個氨基酸長度的信號肽、90個氨基酸長度的前肽及279個氨基酸長度的成熟蛋白酶K。經過國外科學家研究，相比于野生型蛋白酶K，基因突變型重組蛋白酶K可以具有較高的活性。本發明人從野生型蛋白酶K的氨基酸序列(SEQ ID NO. 2，由369個氨基酸組成，包括90個氨基酸長度的前肽及279個氨基酸長度的成熟蛋白酶K)中挑選了八個關鍵 位點，合成基因并在真核系統表達成功，得到了酶活大大提高的基因突變型重組蛋白酶K。因此，本發明的第一方面在于提供一種基因突變型重組蛋白酶K，其特征在于(I)將野生型蛋白酶K氨基酸序列(SEQ ID NO. 2)中第151位的Y突變為A、第208位的K突變為H、第273位的S突變為T、第293位的G突變為A、第332位的K突變為R、第337位的S突變為N ;任選地，還進行下述任意I種以上的突變(2)將第123位的S突變為A ;(3)將第180位的L突變為I。本發明另一方面在于提供編碼上述基因突變型重組蛋白酶K的DNA。本發明另一方面在于提供包含上述DNA的表達載體。本發明又一方面在于提供導入上述表達載體的轉化細胞。本發明再一方面在于提供含有上述基因突變型重組蛋白酶K、DNA、表達載體和/或轉化細胞的試劑盒。本發明另一方面在于提供利用真核細胞制備上述基因突變型重組蛋白酶K的方法，該方法包含如下步驟在培養基中培養含有本發明的基因突變型重組蛋白酶K的轉化細胞；以及收集所述培養基中的所述基因突變型重組蛋白酶K，其特征在于，所述轉化細胞是酵母細胞。此外，本發明人通過選擇不同樹脂材料脫色、不同層析介質純化、不同保護劑和凍干工藝冷凍干燥，得到了商品化的基因突變型重組蛋白酶K產品。因此，本發明另一方面提供了發酵生產蛋白酶K后，采用新型純化方式處理提高得率及批量冷凍干燥的技術。


從與附圖結合的下列詳細描述中，將更清楚地理解本發明的上述和其它目的、特征和其它優點，其中圖I表示顯示本發明的基因突變型重組蛋白酶K mutProK6、mutProK7_l、mutProK7-2及mutProK8氨基酸序列中突變位點的概要圖。
圖2表示酵母表達載體PPIC9K的載體圖譜。圖3表示利用SDS-PAGE檢測本發明的基因突變型重組蛋白酶K mutProK8在GS115酵母細胞中的表達的結果(實驗室規模；搖瓶發酵)。圖4表示利用Western印跡檢測本發明的基因突變型重組蛋白酶K mutProK8在GSl 15酵母細胞中的表達的結果(實驗室規模；搖瓶發酵及30L發酵罐發酵)。圖5表示基因突變型蛋白酶K mutProK8和野生型蛋白酶K的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的結果(實驗室規模；搖瓶發酵)。圖6表示基因突變型蛋白酶K mutProK8消化牛血清白蛋白(BSA)的定性實驗結
果O 圖7表示利用F-C分析法對本發明的基因突變型重組蛋白酶K的酶活性進行定性檢測時所得到的酪氨酸標準曲線。圖8表示利用SDS-PAGE檢測2噸發酵罐培養畢赤酵母不同時間產酶量的結果。圖9表示利用電泳對經純化凍干后的基因突變型重組蛋白酶K的純度進行檢測的結果圖9A :變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；圖9B :非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。圖10表示本發明的基因突變型重組蛋白酶K的穩定性結果。
具體實施例方式下文將詳細闡述本發明。一 .本發明的基因突變型重組蛋白酶K以及活性測定本發明的基因突變型重組蛋白酶K，其特征在于(I)將野生型蛋白酶K氨基酸序列(SEQ ID NO. 2)中第151位的Y突變為A、第208位的K突變為H、第273位的S突變為T、第293位的G突變為A、第332位的K突變為R、第337位的S突變為N ;任選地還進行下述任意I種以上的突變(2)將第123位的S突變為A ;(3)將第180位的L突變為I。在本發明中，“123位”、“151 位”、“180 位”、“208 位'“273 位”、“293 位'“332 位”及“337位”并不是必然表示從所述蛋白酶K的N端起的絕對位置，而是表示與SEQ ID NO. 2的氨基酸序列相比的相對位置。例如，在含有SEQ ID NO. 2的氨基酸序列的蛋白酶中，當該蛋白酶123位的N端某一位置缺失了一個氨基酸，上述的123位即變為122位。即使在這一情況下，所述從N端殘基起計數為122位的氨基酸在本發明中仍為“123位”的氨基酸。通過將感興趣的蛋白酶的氨基酸序列與SEQ ID NO. 2的氨基酸序列進行比對而確定所述氨基酸的相對位置。與對應的野生型蛋白酶(SEQ IDN0. 2)的酶活性相比，本發明的基因突變型重組蛋白酶K的酶活性更高。根據本發明一個優選的實施方式，可通過下述方法測定本發明的重組蛋白酶的活性。將干酪素溶于磷酸鉀溶液中并調節pH值制備底物溶液。將試樣加入上述底物溶液中。使該混合物在37°C下反應，然后加入反應終止液終止反應。通過離心得到上清，力口入無水碳酸鈉，然后加入酹試劑(Folin-Ciocalteu試劑)。反應后在660nm下測定吸光度。將用試樣的吸光度值減去空白的吸光度值得到的值轉化為游離酪氨酸的含量，以計算出蛋白活性值。蛋白活性的單位為U/mL (單位/毫升)。該I單位是指在上述方法中，在I分鐘(min)內使得相當于I μ mo I酪氨酸的酚試劑顯色物增加的酶的量。通過制作酪氨酸的校準曲線得到酪氨酸和酚試劑顯色物的關聯方程。二.編碼本發明的基因突變型重組蛋白酶K的DNA本發明的DNA是編碼本發明的基因突變型重組蛋白酶K的DNA。根據本發明一個優選的實施方式，本發明的DNA可通過以下方式獲得例如采用PCR等方法獲得野生型蛋白酶K基因(例如，如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列)，通過定點突變法等將目的突變導入，制備編碼各基因突變型重組蛋白酶K的DNA。對于定點突變法并沒有特別限定，例如，可以使用市售的QuikChangeSite-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene公司制造)等進行。作為引入定點突變的方法，例如，Gapped duplex法和Kunkel法都是已知的。 根據本發明另一個優選的實施方式，也可以通過化學合成得到本發明的DNA。根據本發明一個特別優選的實施方式，為提高重組蛋白在宿主細胞內的表達效率，可將野生型蛋白酶K的編碼序列(SEQ ID NO. 3)替換為宿主細胞偏愛密碼子組成的DNA序列，引入目的突變后，再通過化學合成的方式制備本發明的DNA。根據本發明一個最優選的實施方式，所述宿主細胞偏愛密碼子為酵母偏愛密碼子。優選地，作為編碼本發明的基因突變型重組蛋白酶K的DNA，例如為具有SEQ IDNO. 6-9所表示的第7-1113位的核苷酸序列的DNA。但是，只要編碼本發明的基因突變型重組蛋白酶K，則并不限于這些。另外，編碼本發明的基因突變型重組蛋白酶K的多核苷酸，也可以是編碼下述基因突變型重組蛋白酶K的多核苷酸與SEQ ID NO. 6-9所表示的第7-1113位的核苷酸序列的互補序列在嚴格條件下進行雜交、且編碼具有上述特定的突變并具有上述所希望的活性的基因突變型重組蛋白酶K。嚴格條件是指形成所謂的特異性雜交而不形成非特異性雜交的條件。盡管該條件因核苷酸序列或其長度而不同，其實例包括具有高同源性(例如，具有不低于75%、優選不低于90%、進一步優選不低于95%的同源性)的DNA相互雜交，而同源性低于上述標準的DNA不雜交的條件；或Southern雜交中用于漂洗的常用條件的雜交條件(60°C和1XSSC、
O.1%SDS,優選O. I X SSC和相當于O. 1%SDS的鹽濃度)。三.本發明的表達載體本發明的表達載體是用于表達本發明的基因突變型重組蛋白酶K的表達載體。根據本發明一個優選的實施方式，所述表達載體可具有如下的結構控制所述DNA表達的啟動子序列連接到編碼本發明的基因突變型重組蛋白酶K的DNA的上游。此外，還可以將終止子連接到所述DNA的下游。作為酵母細胞中的表達載體，可使用pPICZ、pPICZ α、pGAPZ、pGAPZ α、pGAPZ a A和pPIC9K中的任何類型。從拷貝數和穩定性的角度來看，優選PPIC9K。根據本發明一個優選的實施方式，用于挑選重組體的選擇標記基因或用于檢測導入基因表達的報告基因也可插入本發明的表達載體中。選擇標記基因的實例包括但不限于潮霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因。報告基因的實例包括但不限于β -葡糖醛酸酶(⑶S)基因、氯霉素乙酰轉移酶(CAT)基因、熒光素酶(LUC)基因和綠色熒光蛋白(GFP)基因。根據本發明另一個優選的實施方式，為了分泌表達本發明的基因突變型重組蛋白酶K、或為了便于純化所表達的蛋白酶K，本發明的表達載體中可包含附加序列。在這種情況下，本發明的蛋白酶K以融合蛋白(與附加序列編碼的蛋白或肽融合)的形式表達。所述附加序列的實例包括但不限于編碼信號肽或前肽的核苷酸序列；以及編碼HiS標簽或GST標簽的核苷酸序列。四.本發明的轉化細胞本發明的轉化細胞是導入本發明的表達載體的細胞，該細胞能生產本發明的基因突變型重組蛋白酶K。盡管該轉化細胞可以是原核細胞或可以是真核細胞，優選為真核細胞。
所述真核細胞的實例包括但不限于酵母細胞。根據本發明一個優選的實施方式，所述真核細胞為酵母細胞。根據本發明再一個優選的實施方式，所述酵母細胞為畢赤酵母(Pichia)細胞、假絲酵母(Candida)細胞、多型漢遜酵母(Hansenula poIymorpha)細胞、球擬酵母(Torulopsis)細胞、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)細胞和克魯維酵母(Kluyveromyces)細胞。根據本發明一個尤其優選的實施方式，所述酵母細胞為畢赤酵母細胞。由于目前對畢赤酵母的發酵條件有著更深入的研究，且所述畢赤酵母細胞在發酵制備中成本最低，能夠滿足技術需求和產品市場化的需求，因而畢赤酵母細胞被認為是基因突變型重組蛋白酶K生產中最為優選的轉化細胞。根據本發明一個優選的實施方式，所述畢赤酵母細胞是GS115酵母細胞(美國Gproan Protein Engineering, Inc.贈送)。可根據轉化細胞的類型適當選擇將表達載體導入轉化細胞的方法。這些方法都是本領域技術人員已知的。根據本發明一個優選的實施方式，可通過以下方法獲得畢赤酵母的轉化體采用電擊轉化的方法，將線性化表達載體轉化到酵母感受態細胞中。隨后將菌體懸液涂布于平板上，并培養平板直至出現單個菌落。五.本發明的試劑盒本發明的試劑盒是包含本發明的基因突變型重組蛋白酶K、編碼本發明的基因突變型重組蛋白酶K的DNA、本發明的表達載體及本發明的轉化細胞中的一種或多種的試劑盒。通常，所述試劑盒包含容器和在該容器上或與該容器相關聯的標簽或包裝說明書。合適的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器等。該容器可由多種材料形成，如玻璃或塑料。所述標簽和包裝說明書指示了該試劑盒的使用方法及用途。任選地，本發明的試劑盒還可另外包括一種或多種組分，所述組分選自于由試管、反應緩沖液、PCR引物、dNTP、Taq聚合酶、逆轉錄酶、DNA酶、RNA酶抑制劑、DEPC水和無菌水構成的組，但不總限于此。六.本發明的基因突變型重組蛋白酶K的制備方法(實驗室規模)通過培養本發明的轉化細胞，可生產本發明的基因突變型重組蛋白酶K，通過與信號肽融合的融合蛋白的形式表達本發明的基因突變型重組蛋白酶K以用于分泌，本發明的蛋白酶可在培養基中積累。當使用誘導型啟動子時，優選在培養期間進行誘導。盡管培養所述轉化細胞的方法隨細胞的類型而不同，但可以使用傳統方法。根據本發明一個優選的實施方式，培養所述畢赤酵母轉化體的方法的實例如下所述挑取酵母單菌落至Yro培養基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)中培養。離心收集菌體。用MM培養基(13.4g/L YNB，4X10_4g/L生物素，5mL/L甲醇)重懸菌體后振蕩培養，開始誘導表達。每24小時向誘導表達的發酵液中補加終濃度為1%(ν/ν)的甲醇。七.本發明的基因突變型重組蛋白酶K的制備方法(工業規模)從挑取的轉化子中得到基因突變型重組蛋白酶K表達量最高的3個菌株。搖瓶培 養三株工程菌株，離心收獲發酵上清液進行酶活、表達產量、消化BSA等試驗，進一步選取一株最好菌株進行中試放大試驗。在30升發酵罐水平進行基因工程菌株最佳培養條件探索，包括培養基配方、溶氧量、誘導時間和誘導劑甲醇的用量等。根據本發明一個優選的實施方式，所述中試放大實驗可在如下條件下進行采用與搖瓶發酵中相同的培養基，甲醇誘導時間為48 168小時，溶氧量為20°/Γ40%，誘導劑甲醇的用量為O. 5% 3% (ν/ν)0將30升發酵罐得到的技術方案，移植到2噸罐生產規模試驗，完全復制中試發酵條件，連續發酵培養48 168小時，隨時在線監控各項發酵指標和電泳測定蛋白表達水平。根據本發明一個最為優選的實施方式，甲醇誘導時間為72小時。下罐離心分離菌體和發酵液，當所述基因突變型重組蛋白酶K (分泌到培養基中的蛋白酶)處在存在于發酵液上清中的狀態時，可被使用；也可通過濃縮所述發酵液上清使用所述蛋白酶。可純化或部分純化所述基因突變型重組蛋白酶K (分泌到培養基中的蛋白酶)。利用蛋白純化的一般方法，可實現純化或部分純化。例如，可以使用包括色譜(如離子交換或凝膠過濾)、硫酸銨鹽析或有機溶劑沉析技術。還可通過凍干、超濾膜和有機溶劑沉析等濃縮所述純化后的酶。根據本發明一個優選的實施方式，利用在本發明基因突變型重組蛋白酶K的C端添加的六聚組氨酸標簽，發酵液首先經過離心分離，上清液經過金屬離子螯合親和層析純化，然后再經過弱陽離子交換層析純化，再凍干成為成品酶，避免了傳統純化方法中采用超濾-陽離子柱-超濾-陰離子柱進行純化時蛋白在超濾時大部分沉淀出來而導致收率降低的缺陷，從而使得綜合收率相比現有技術提聞了 80%。實施例 借助于下述實施例可更好地理解本發明，這些實施例僅用于舉例說明本發明，不應被解釋為對本發明的限制。此外，所有的基因操作可按MolecularCloningCCold Spring Harbor LaboratoryPress (1989))所記載的進行。實施例I蛋白酶K表達載體pPIC9K-ProK和pPIC9K_mutProK的構建將野生型蛋白酶K的編碼序列(SEQ ID NO. 3)替換為畢赤酵母偏愛密碼子組成的DNA序列，在其5’端添加SnaB I酶切位點TACGTA，3’端順次添加六聚組氨酸標簽CACCATCACCACCATCAC (SEQ ID NO. 4)、終止密碼子 TAA 及 NotI 酶切位點 GCGGCCGC，利用化學方法合成所得的序列(SEQ ID NO. 5)。將5’端添加的SnaB I酶切位點TACGTA替換為EcoR I酶切位點GAATTC，并進一步引入相應突變后(如圖I所示)，利用化學方法合成所得的序列(SEQ ID NO. 6-9)(加拿大基因合成技術服務公司BioBasic Inc.)。上述化學合成的序列均已克隆至pUC57質粒中(加拿大基因合成技術服務公司BioBasic Inc.)。擴增pUC57/ProK質粒和pUC57/mutProK質粒，分別用限制性內切酶SnaB I、Not I和EcoR I、Not I將ProK和mutProK編碼序列切下，與進行同樣雙酶切的pPIC9K載體(美國Invitrogen公司)連接，將連接產物轉化DH5a感受態細胞，挑取克隆，擴增質粒，分別用限制性內切酶SnaB I、Not I或EcoR I、Not I鑒定質粒。通過上述方法，將編碼野生型蛋白酶K和本發明的基因突變型重組蛋白酶K的DNA片段亞克隆至酵母表達載體PPIC9K中(如圖2所示)，從而構建出野生型蛋白酶K表達載體pPIC9K-ProK及本發明的基因突變型重組蛋白酶K表達載體pPIC9K_mutProK pPIC9K-mutProK6(Y151A、K208H、S273T、G293A、K332R、S337N)、pPIC9K-mutProK7-l(S123A、 Y151A、K208H、S273T、G293A、K332R、S337N)、pPIC9K-mutProK7-2 (Y151A、L180I、K208H、S273T、G293A、K332R、S337N)及 pPIC9K_mutProK8 (S123A、Y151A、L180I、K208H、S273T、G293A、K332R、S337N)(如圖 I 所示)。測序結果表明，目標片段均正確插入上述表達載體中。實施例2蛋白酶K表達載體 pPIC9K-ProK 和 pPIC9K_mutProK 的轉化利用限制性內切酶Sal I酶切實施例I中所構建的重組質粒，使之線性化，然后用TE緩沖液(pH 8. O)溶解至I μ g/μ L的濃度，取20 μ L溶解的質粒與GS115酵母感受態細胞混勻，轉移至冰預冷的電轉杯(兩極間隙O. Icm)中，冰浴5min。采用電擊轉化的方法，利用電轉化儀內置的畢赤酵母轉化參數進行電擊，將上述表達載體轉化到GS115酵母感受態細胞中。電擊完畢后，迅速向電轉杯中加入ImL冰預冷的IM山梨醇溶液，輕輕混勻，轉至
I.5mL EP管中。將菌體懸液涂布于MD平板(13. 4g/L酵母基礎氮源；0. 4mg/L生物素；20g/L葡萄糖，I. 5%瓊脂)上，每500 μ L涂布一塊平板。將平板置于30°C環境培養，直至出現單個菌落，得到 GS115/pPIC9K-ProK 和 GS115/pPIC9K_mutProK。實施例3 高拷貝數和 Mut+ 表型的 GS115/pPIC9K-ProK 和 GS115/pPIC9K_mutProK的篩選分別配制四個G418 濃度梯度(O. 75mg/mL、lmg/mL、I. 75mg/mL、2. Omg/mL)的 YPD篩選平板(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，I. 5%瓊脂)。對于在實施例2中進行培養的MD平板，用無菌牙簽各挑取70個酵母單菌落，點在上述四個G418濃度梯度的YPD篩選平板中，并作相應編號。每個克隆均做4個梯度的篩選。pPIC9K表達載體能夠賦予畢赤酵母遺傳霉素抗性,其抗性水平主要依賴于整合的kan基因的拷貝數。單拷貝的pPIC9K整合到畢赤酵母基因組后，可賦予畢赤酵母約O. 25mg/mL的遺傳霉素抗性水平。由于kan基因與表達盒(pAOXl及目的基因)之間存在遺傳連鎖，因而可根據遺傳霉素的抗性水平來大致推斷該克隆所包含的目標蛋白編碼基因拷貝數。通過觀察上述篩選平板，初步判定GS115/pPIC9K-ProK和GS115/pPIC9K_mutProK酵母克隆是否含有高拷貝數的目標蛋白編碼基因。篩選平板中G418的含量越高，且酵母菌落生長外形越大，表明該酵母單克隆中含有較多目標蛋白基因的拷貝，能夠耐受較高濃度的 G418。同時，對上述單克隆進行PCR鑒定。引物為5’AOXl (SEQ ID NO. 10)、3’AOXl (SEQID NO. 11)。5’ AOXl GACTGGTTCCAATTGACAAGC3’ AOXl GCAAATGGCATTCTGACATCCPCR 體系(20 μ L):
成分使用濃度體積(|xL)
滅菌超純水13.6·
IOxPCR 緩沖液IOx2
PCR染料25 ΟΧI IO μΜ 0.4 3 ΟΧI 10 μΜ 0.4 模板(菌液) I dNTP Mix 各OmM 0.4 Tag DNA 聚合醃_5 U/f.iL_0.2PCR 程序94°C 5min ；94°C 30s, 55°C lmin,72°C 2min 15s，30 個循環；72 °C 6min。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的大小。用Sal I線性化質粒轉化GS115后，大多在HIS4位點上發生重組，大多數轉化子是Mut+表型；然而由于質粒含有AOXl基因序列，有可能在AOXl位點發生重組，破壞野生型AOXl基因，產生Muts轉化子。因此，理論上，若目的片段插入成功且表型為Mut+，應有2200bp左右、1632bp左右的兩條條帶；若只有1632bp一條條帶，則表型可能為Muts。PCR結果顯示可以擴增出2200bp左右的條帶，表明目的片段均插入成功，且表型為 Mut+。實施例4基因突變型重組蛋白酶K在酵母細胞中的表達及檢測(實驗室規模)將實施例3中篩選得到的高拷貝數和Mut+表型的GS115/pPIC9K-ProK和GS115/PPIC9K-mutProK的酵母單菌落接種至20mL YPD培養基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)中，30°C，250rpm培養24h。1500g離心收集菌體。用IOmL MM培養基(13. 4g/LYNB，4X10_4g/L生物素，5mL/L甲醇)重懸菌體。隨后在30°C，250rpm下搖瓶(2L)誘導表達。每4小時從發酵液中取樣以備檢測，并向誘導表達的發酵液中補加終濃度為1% (v/v)的甲醇。連續5天，共培養120小時。進而,利用30升發酵罐進行中試放大試驗,參考美國Invitrogen公司的畢赤酵母培養方案(www. invitrogen. com),采用與搖瓶發酵中相同的培養基,將甲醇誘導時間設定為120小時，溶氧量控制在30%，誘導劑甲醇的用量為1% (v/v)，每4小時從發酵液中取樣以備檢測。
培養后，離心培養基，從而得到含有上述基因突變型重組蛋白酶K的發酵液上清，并置于-70°C保存。利用SDS-PAGE、Western印跡法及Native-PAGE檢測本發明的基因突變型重組蛋白酶K在酵母細胞中的表達。I. SDS-PAGE 檢測依照如下實驗方案進行SDS-PAGE檢測I. I 制備 SDS-PAGE 凝膠I. I. I分離膠的制備:

權利要求
1.基因突變型重組蛋白酶K，其特征在于將如SEQID NO. 2所示的氨基酸序列第151位的Y突變為A、第208位的K突變為H、第273位的S突變為T、第293位的G突變為A、第332位的K突變為R、第337位的S突變為N。
2.如權利要求I所述的基因突變型重組蛋白酶K，其中，所述基因突變型重組蛋白酶K還具有下述任意一種以上的突變 (1)第123位的S突變為A; (2)第180位的L突變為I。
3.如權利要求I或2所述的基因突變型重組蛋白酶K，其中，所述基因突變型重組蛋白酶K的C端還具有六聚組氨酸標簽。
4.編碼如權利要求1-3中任一項所述的基因突變型重組蛋白酶K的DNA。
5.如權利要求4所述的DNA，其中，所述DNA為SEQID NO. 6-9所表示的核苷酸序列的全部或部分，所述部分至少具有SEQ ID NO. 6-9第7-1113位的核苷酸序列。
6.包含如權利要求4或5所述的DNA的表達載體，其中，所述表達載體優選為pPICZ、pPICZ a、pGAPZ、pGAPZ α、pGAPZ a A 和 pPIC9K。
7.導入權利要求6所述的表達載體的轉化細胞，其特征在于，所述轉化細胞為畢赤酵母(Pichia)細胞、假絲酵母(Candida)細胞、多型漢遜酵母(Hansenula poIymorpha)細胞、球擬酵母(Torulopsis)細胞、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)細胞和克魯維酵母(Kluyveromyces)細胞,其中，所述轉化細胞優選為畢赤酵母細胞。
8.試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含選自于如下物質中的一種或多種權利要求1-3任一項所述的基因突變型重組蛋白酶K ;權利要求4或5所述的DNA ;權利要求6所述的表達載體；及權利要求7所述的轉化細胞。
9.制備如權利要求1-3任一項所述的基因突變型重組蛋白酶K的方法，所述方法包括如下步驟在培養基中培養如權利要求7所述的轉化細胞；以及收集所述培養基中的所述基因突變型重組蛋白酶K。
10.如權利要求9所述的方法，該方法進一步包括所述基因突變型重組蛋白酶K的純化工藝過程，所述純化工藝過程包括離心分離、層析分離、脫色處理和凍干，其中，所述層析分離優選為利用組氨酸標簽進行的金屬離子螯合親和層析。
全文摘要
本發明涉及一種基因突變型重組蛋白酶K及其工業化生產方法。更具體而言，本發明涉及一種經過基因改造和蛋白質工程化得到的酶活性為同種天然蛋白酶活性2倍以上的基因突變型重組蛋白酶K；以及利用酵母細胞大規模培養表達外源蛋白，制備所述基因突變型重組蛋白酶K的工業化生產方法和工藝過程。
文檔編號C12N1/19GK102839165SQ201210363700
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月26日 優先權日2012年9月26日
發明者安海謙, 魯剛偉, 冉波, 任玉珍 申請人:金普諾安生物科技(蘇州)有限公司