專利名稱：芘標記的單鏈dna熒光探針及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種水溶性熒光聚電解質的合成方法以及利用這種聚電解質制備檢測寡核酸序列的熒光探針的方法，屬于功能高分子技術、分析化學和生物分析化學領域。
背景技術：
功能高分子是在其大分子鏈中結合了特定的功能基團，或大分子與具有特定功能的其他材料進行了復合，或者二者兼而有之而形成的具有某種特定功能的高分子材料，其在生物分析化學領域，尤其是在生物大分子檢測方面的應用已經引起國內外學者的密切關注。核酸堿基序列的特異性識別是當前國際研究熱點，而利用具有熒光特性的功能高分子作為熒光探針對核酸進行特異性識別已經取得了一些不錯的效果。日本Saito教授將熒光基團芘標記到一個線性單鏈核酸上形成核酸探針，當與堿基互補配對的單鏈靶核酸雜化時表現出較強熒光光譜，當與堿基不互補配對的單鏈靶核酸雜化時表現出相對較弱的熒光光譜，由此來特異性識別核酸序列(J. Am. Chem. Soc., 2004, 126，4820)。王國杰教授曾經報道過芘標記HNA和RNA的線性RNA探針，當與互補鏈雜化時，在熒光光譜上會出 現芘單體峰的增強及激基締合物峰的消失，根據這種明顯的熒光變化來特異識別核酸序列(ChemBioChem. , 2009, 10，1175)。另外一種熒光基團標記的探針是非線性的探針稱為分子信標，其核酸結構為發卡式且莖端兩端分別接有熒光基團和淬滅基團，它可以提高錯配目標的熱識別及降低假陽性信號的風險，且在基因篩檢、生物傳感器的發展、生物芯片結構及單核苷酸多態性的檢測方面都有很好的應用，所以受到很多學者的廣泛關注(Angew.Chem. Int. Ed. 2009，48，856; Analyst. 2005，130，350; Langmuir. 2008，24，12138)。但是所有像以上說介紹的標記型熒光探針都是通過共價鍵將熒光基團連接到核酸分子鏈上，其合成操作比較復雜。近些年許多學者開始將目光轉向用接有熒光基團的共軛聚電解質制備熒光探針來特異性檢測核酸序列。He教授等人報道過用一種共軛聚電解質作為檢測傳感器來檢測多鏈DNA的雜化(J. Am. Chem. Soc. , 2009, 131，3432)。Gaylord等報道了一種生物傳感器，它是由含有一種共軛聚電解質和一種單鏈DNA的水溶液構成，當檢測到特征波長的發射光線時標明含有特定序列的核酸鏈(J. Am. Chem. Soc. 2003,125， 896)。

發明內容
本發明的目的在于合成一種水溶性的陽離子聚電解質芘功能化的聚4-乙烯基吡啶，并用該聚電解質和兩種類型的單鏈寡聚核苷酸制備復合探針來檢測目標DNA特定的堿基序列。
本發明特點在于共軛聚電解質聚4-乙烯基吡啶的合成方法容易操作，用其制備DNA復合探針的原理也很簡單，且探針的檢測原理與其他報道過的探針原理有所創新，是根據熒光基團芘嵌插到核酸雙鏈結構與否的熒光變化來檢測DNA的。本發明是通過以下技術方案來實現的本發明利用芘甲醇和三溴化磷的置換反應來制備芘甲溴，并將之按1:10的單體摩爾比接枝到聚4-乙烯基吡啶上，再用溴代正丁烷質子化，得到具有水溶性的陽離子聚電解質目標產物。該產物分別于直鏈和發卡式結構的單鏈DNA作用形成新型的復合DNA熒光探針。本發明的芘標記的聚4-乙烯基吡啶聚電解質的合成及其在DNA探針制備中的應用的具體步驟包括
(1)熒光基團芘甲溴分子的制備
冰點溫度下將芘甲醇溶于三氯甲烷中，將摩爾量是芘甲醇的1/2倍的三溴化磷加入 該溶液，冰浴攪拌12個小時，然后加入飽和碳酸氫鈉水溶液至中性，分層，取有機層進行蒸餾，重結晶，并干燥得到芘甲溴；
(2)將芘甲溴接枝到聚4-乙烯基吡啶上
將聚4-乙烯基吡啶溶于三氯甲烷中，再加入適當摩爾量的芘甲溴，68°C下攪拌、回流24小時，然后將反應液緩慢滴加入四氫呋喃中得到沉淀，過濾，洗滌，干燥后得到中間產物；
(3)用溴代正丁烷進一步接枝到中間產物
將中間產物溶于乙醇，并加入5倍于聚4-乙烯基吡啶單體摩爾量的溴代正丁烷，85°C下攪拌、回流24個小時，然后將反應液緩慢滴加入四氫呋喃中得到沉淀，過濾，洗滌，干燥得到產物陽離子聚電解質。(4) DNA復合探針的制備
用緩沖溶液PBS (10 mM, pH = 7. 4)溶解適量步驟(3)中聚電解質，再用相同緩沖溶液分別溶解適量單鏈DNAl和單鏈DNA3溶液，將聚電解質溶液和兩種DNA溶液分別混配成兩種DNA探針，直鏈型和發卡型探針。(5) DNA雜交樣品的配制
用緩沖溶液PBS (10 mM, pH = 7. 4)溶解單鏈DNA2和DNAt，分別取一定量的DNA2和DNAt加入兩種探針溶液中配成雜交樣品，將樣品先90°C熱處理15min，再在40°C條件下保溫 30min。所述步驟(3)所合成的聚電解質的結構式為
十 H2—Cj^CH2-C^
Q O
Nr-Nr-
IorI Br
CH2O
II
ch2
WAJ CH3
其中m/n的值可以在1/100到1/10之間的任意數值。
所述步驟(4)和(5)中所用DNA序列分別為DNA1 5 ' -GCA CATACA TTC TAC TTG-3 ' , DNA2 5 ' -CGT GTA TGT AAG ATG AAC-3 ' , DNA3 5’-GCACAAACAAGTAGAATGTATGTGC-3' , DNAt 5/ -TTT TTT TTT TTT TTT TTT-3'。其中DNA3是發卡式結構，其余均為直鏈結構，且DNA2與DNAl完全互補，DNA2與DNA3部分互補，DNAt不與任何其他DNA互補。所述步驟(4)和(5)中所有探針及雜交樣品最終的聚電解質濃度均為2. O X 10 7M，所有DNA濃度均為I. O X 1(Γ6 M，而實際上DNA 的濃度在1.0 X 1(T7 M到I. O X 1(Γ5M之間都可以實現對目標DNA的檢測。本發明的主要特點如下
聚電解質芘標記的聚4-乙烯基吡啶的合成方法簡單，其與直鏈或發卡式DNA通過親疏水作用及靜電作用結合形成復合探針，此時堿基對芘分子的熒光產生一定的淬滅作用。當加入互補的目標單鏈DNA時，會產生進一步的明顯熒光淬滅；而當加入不互補的目標單鏈DNA時，熒光強度不會發生相當的降低，我們可以由此來檢測相應的DNA堿基序列。本發明的方法較之很多報道過的方法相對更簡單，且不失靈敏性，且相對比較快速，準確度高，在功能高分子領域及生物傳感方面都具有很好的參考價值。


圖I為芘標記的聚4-乙烯基吡啶聚電解質的合成路線。圖2為芘標記的聚4-乙烯基吡啶聚電解質的1H NMR。圖3為發明實例2所制備樣品的熒光光譜。a.直鏈探針系列熒光譜圖。b.直鏈探針系列在377nm處熒光強度柱狀圖。c.發卡式探針系列熒光譜圖。d.發卡式探針系列在377nm處熒光強度柱狀圖。圖4為DNA探針的制備及檢測原理示意圖。a.直鏈探針原理圖。b.發卡式探針原理圖。圖5為發明實例3所制備樣品的圓二色譜圖。a.直鏈結構的圓二色譜圖。b.發卡式結構的圓二色譜圖
圖6為發明實例4所制備樣品的KI熒光淬滅圖。a.直鏈探針系列熒光淬滅圖。b.直鏈探針系列在377nm處熒光強度柱狀圖。c.發卡式探針系列熒光淬滅圖。d.發卡式探針系列在377nm處熒光強度柱狀圖。
具體實施方式
實施例I :
冰點溫度下將6mmol花甲醇溶于150mL三氯甲燒中，將3mmol三溴化磷加入該溶液，冰浴攪拌12個小時，然后加入飽和碳酸氫鈉水溶液至中性，分層，取有機層進行蒸餾，重結晶，并干燥得到花甲溴。將12mmol聚4-乙烯基卩比唳溶于IOmL三氯甲燒中，再加入I. 2mmol芘甲溴，68°C下攪拌、回流24小時，然后將反應液緩慢滴加入四氫呋喃中得到沉淀，過濾，洗滌，干燥后得到中間產物。將5mmol中間產物溶于SmL乙醇中，并加入14mol溴代正丁烷，85°C下攪拌、回流24個小時，然后將反應液緩慢滴加入四氫呋喃中得到沉淀，過濾，洗滌，干燥得到產物陽離子聚電解質(P4VP-Py-Bu)。實施例2
(I)配制樣品用PBS (10 mM, pH = 7. 4)緩沖液去配制各個樣品溶液，分別為如圖 3 中所標注的 l)P4VP-Py-Bu，2)P4VP-Py-Bu/ssDNAl，3)P4VP-Py-Bu/ssDNA2，
4)P4VP-Py-Bu/ssDNAl + ssDNA2, 5)P4VP-Py-Bu/ssDNAl + ssDNAt, 6)P4VP-Py-Bu/ ssDNA2+ssDNAt，3’)P4VP_Py-Bu/ssDNA3，4’)P4VP_Py-Bu/ssDNA2+ssDNA3，6’)P4VP-Py-Bu/ssDNA3+ssDNAt共9個樣品，每個樣品溶液中的聚電解質最終濃度為2. OX 10_7M，每種DNA濃度都為I. OXlO-6M0(2)熱處理樣品將(I)中所配好的樣品放入90°C烘干箱中熱處理15分鐘，然后迅速移至到40°C的烘干箱熱處理30分鐘。(3)對樣品做熒光檢測在344nm激發波長條件下，通過圖3的曲線圖及377nm處熒光強度柱狀圖可以明顯看出，當DNAl或DNA3與聚電解質作用形成熒光探針時，熒光強度較聚電解質本身有所下降，而當熒光探針中加入互補的目標DNA單鏈時，熒光強度會進一步出現明顯的下降，而加入不互補的DNA單鏈時，熒光強度變化相對較小，其原理如圖4所示，當加入互補鏈時，目標DNA與探針DNA形成雙螺旋結構,此時聚電解質P4VP-Py-Bu中的芘分子嵌插到雙螺旋結構的堿基對中，使得堿基對芘熒光的淬滅進一步加劇，而加入不互補的DNA單鏈不會形成雙螺旋結構，這樣也就沒有嵌插作用的產生，所以淬滅作用不會發生太大變化，由此，我們可以對目標單鏈DNA進行檢測。實施例3
(O配制樣品用PBS (10 mM, pH = 7. 4)緩沖液去配制各個樣品溶液，分別為如圖5中所標注的 I) DNA1/DNA2，2) P4VP-Py-Bu + DNA1/DNA2，I’)DNA1/DNA3，2) P4VP-Py-Bu +DNA1/DNA3共4個樣品。每個樣品溶液中的聚電解質最終濃度為2. O X 10_5M，每種DNA濃度都為 I. OXlO-4Mo(2)熱處理樣品將(I)中所配好的樣品放入90°C烘干箱中熱處理15分鐘，然后迅速移至到40°C的烘干箱熱處理30分鐘。(3)對樣品做圓二色譜測試做圓二色譜測試是為了證實芘分子確實嵌插到了DNA雙螺旋結構中去。如圖5所示的譜圖，加入聚電解質P4VP-Py-Bu后的圓二色譜強度都明顯下降，且正譜帶出現藍移，負譜帶出現紅移，導致這種結果的唯一可能就是嵌插作用，因為剩下的兩種可能相互作用靜電和溝壑作用都不會對雙鏈結構產生如此大的作用使其圓二色譜有這樣的變化。實施例4
(O配制樣品用PBS緩沖液(10 mM, pH = 7. 4)去配制各個樣品溶液，分別為如圖3中所標注的 I) P4VP-Py-Bu, 2 ) P4VP-Py-Bu/ssDNAl，3 ) P4VP-Py-Bu/ssDNA2，4) P4VP-Py-Bu/ssDNAl+ssDNA2，5) P4VP_Py-Bu/ssDNAl+ssDNAt，6) P4VP_Py-Bu/ssDNA2+ssDNAt，3’)P4VP-Py-Bu/ssDNA3，4’)P4VP_Py-Bu/ssDNA2+ssDNA3，6’)P4VP-Py-Bu/ssDNA3+ssDNAt 共 9個樣品，每個樣品溶液中的聚電解質最終濃度為2. 0X10_7M，每種DNA濃度都為I. 0X10_6M。(2)熱處理樣品將(I)中所配好的樣品放入90°C烘干箱中熱處理15分鐘，然后迅速移至到40°C的烘干箱熱處理30分鐘。(3)KI淬滅實驗用PBS緩沖液(10 mM，pH = 7. 4)配備KI溶液，濃度為O. 2M，每次取IOPL逐次加入每個樣品中，分別測其熒光強度(如圖6)，并由此根據依據如下公式計算淬滅常數(Ksv)
10/1 = I + Ksv [I —]
樣品1)，2)，3)，4)，5)和6)的淬滅常數分別為228，169，143，93，137和 142 Μ—1，其中樣品 4) P4VP-Py-Bu/ssDNAl+ssDNA2 的淬滅常數最小；樣品 I )，2)，3’)，4’)，
5)和 6，)的淬滅常數分別為 228，169，122，53，137，152 M'其中 4’)P4VP_Py-Bu/ssDNA2+ssDNA3的淬滅常數最小。以上結構都是由于芘分子嵌插到了 DNA雙螺旋結構中，I 一對芘的淬滅作用因雙螺旋結構的保護而降低，因此該結果進一步證明了芘分子嵌插到了DNA雙螺旋結構中。
權利要求
1.一種芘標記的單鏈DNA熒光探針，其特征是該探針具有水溶性，可與互補的目標DNA形成雙螺旋結果，不可與不互補的DNA形成雙螺旋結構。
2.如權利要求I所述的單鏈DNA熒光探針，其特征是該探針由單鏈DNA與一種帶有熒光基團的陽離子聚電解質通過靜電作用和疏水作用互相吸附而得到，技術手段簡單。
3.如權利要求2中所述的一種陽離子聚電解質，其特征是所述陽離子聚電解質接枝有熒光基團芘，具有水溶性，且是陽離子性的聚合物。
4.一種如權利要求3中所述的一種陽離子聚電解質的制備方法，其步驟包括 (1)熒光基團芘甲溴分子的制備 冰點溫度下將芘甲醇溶于三氯甲烷中，將摩爾量是芘甲醇的1/2倍的三溴化磷加入該溶液，冰浴攪拌12個小時，然后加入飽和碳酸氫鈉水溶液至中性，分層，取有機層進行蒸餾，重結晶，并干燥得到芘甲溴； (2)將芘甲溴接枝到聚4-乙烯基吡啶上 將聚4-乙烯基吡啶溶于三氯甲烷中，再加入1/10于聚4-乙烯基吡啶單體摩爾量的芘甲溴，68°C下攪拌、回流24小時，然后將反應液緩慢滴加入四氫呋喃中得到沉淀，過濾，洗滌，干燥后得到中間產物； (3)用溴代正丁烷進一步接枝到中間產物 將中間產物溶于乙醇，并加入5倍于聚4-乙烯基吡啶單體摩爾量的溴代正丁烷，85°C下攪拌、回流24個小時，然后將反應液緩慢滴加入四氫呋喃中得到沉淀，過濾，洗滌，干燥得到產物陽離子聚電解質。
5.如權利要求4所述的方法，其特征是所述的步驟(2)是將芘按1:10的比例接枝于吡啶上，比例不能太大。
6.如權利要求4所述的方法，其特征是所述的步驟(3)是用溴代正丁烷將中間產物季銨化，為了得到具有水溶性的聚陽離子產物。
7.—種如權利要求I或2所述的芘標記的單鏈DNA熒光探針的制備方法，其制備步驟是將芘接枝聚4-乙烯基吡啶陽離子和一種DNA單鏈共同溶于緩沖液中，形成復合探針。
8.如權利要求7所述的方法，其特征是陽離子濃度可以在2X10_8M到2X10_6M之間，單鏈DNA濃度在I. OX IQ-7M到I. OX 1(Γ5Μ之間，緩沖液為磷酸鹽緩沖液，pH = 7. 4。
全文摘要
本發明涉及一種熒光基團芘接枝的聚4-乙烯基吡啶陽離子聚電解質的合成，并由此制備單鏈DNA復合熒光探針的方法。芘接枝聚4-乙烯基吡啶陽離子聚電解質的合成步驟(1)用芘甲醇和三溴化磷制備芘甲溴；(2)將芘甲溴按一定的單體摩爾比接枝到聚4-乙烯基吡啶上；(3)將步驟(2)的產物用溴代正丁烷季氨化得到水溶性陽離子聚電解質。該聚電解質與單鏈核酸在緩沖液中通過靜電及疏水作用互相吸附形成復合探針，實驗中通過熒光變化來檢測目標單鏈DNA堿基與探針DNA是否互補。本發明的優點是合成路線簡單，容易操作，成本低，且探針對DNA的特異性識別快速、靈敏。
文檔編號C12N15/10GK102864143SQ20121036385
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月26日 優先權日2012年9月26日
發明者王國杰, 張瑞辰, 楊領葉, 趙敏, 董杰 申請人:北京科技大學