專利名稱：殺菌通透性增強蛋白基因作為豬一般抗病力遺傳標記的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于豬遺傳育種及分子標記輔助選擇技術領域，具體涉及豬一般抗病力遺傳標記的篩選和應用。
背景技術：
隨著集約化飼養管理方式的普及，在養豬業生產中，疾病的危害極易給畜牧業生產帶來重大損失。在美國，每年由于豬病而付出的費用超出15億美元。這一巨大的經濟損失主要是由于豬只死亡、生產效率降低、醫藥費用增加以及產品損失造成的。在應激的生產條件下，對重要經濟性狀施加的選擇壓，也會導致疾病發生率的增加。疾病會使選擇的效率降低，影響生產性狀的遺傳改進。目前，對畜禽疾病的控制措施，主要是采用疫苗接種和抗菌素類藥物治療，然而，由于病菌類型繁多且變化快，疫苗的使用并不總是有效，同時濫用抗菌素會導致畜產品攜帶大量殘留藥物，成為藥物食品(Drug-food)，對人類的健康產生不良影響，現在許多國家紛紛開始禁止進口藥物食品和限制抗菌素在畜禽治療中的應用，因此在培育高產品種的同時，尋找一條安全可靠且經濟可行的畜禽疾病防治途徑，己是科學家和畜牧生產者共同 關心的緊迫問題。為了獲得更多的疾病防治方法，必須清楚地了解動物的免疫抗病系統及致病機理。疾病的發生一般是動物的遺傳背景與其所處環境之間相互作用的結果。若某一動物在遺傳上對一種疾病易感，則環境條件(包括常規疾病防治方法)可能僅對疾病的防治部分有效。一個可取代疾病常規防治法是針對提高家畜抗病力進行選擇性育種。遺傳性抗病力包括了機體免疫抗病系統及其相互作用的許多方面，因而極為復雜。目前從根本上開展豬的抗性遺傳機制研究，進行抗病育種，已引起了國內外學者的高度重視。病原體在傳染過程中，會遇到3道防御機制，即上皮防御機制、非特異性防御機制和特異性防御機制。當個體受到病原體侵染時，會調動這3方面的防御機制加以抵抗。豬是否發病取決于侵染和防御機能相互作用的結果，防御機能加強的豬便表現出自然抗病力。抗病力按遺傳基礎的不同可分為特殊抗病力和一般抗病力。特殊抗病力是指豬對某種特定疾病或病原體的抗性，這種抗性主要受一個主基因位點控制，同時也可不同程度地受其它位點(包括調控子)及環境因素影響。現有的研究結果表明，特殊抗病力的內在機理在于宿主體內存在或缺少某種分子或其變體，這不僅能決定異體識別及特異性異體反應，還能決定病原體的特殊附著力，病原體進入體內后在體內增殖，能否導致宿主發病。一般抗病力不限于抗某一種病原體，它受多基因和環境的綜合影響，病原體的抗原性差異對一般抗病力影響極小，甚至根本沒有影響，這種抗病力體現了機體對疾病的整體防御功能。研究發現，不少豬病的發病機制與豬本身的遺傳背景有關，即豬可能對一些疾病存在完全或部分抗性。廣義上講，任何疾病的發生都是遺傳與環境因素共同作用的結果，幾乎所有疾病都與遺傳有關。狹義上講，遺傳病是由于生殖細胞或受精卵中遺傳物質發生了結構或功能上的變異所致。因此，從長遠角度來看，采用遺傳學方法從遺傳基礎上提高豬對疾病的一般抗性具有治本的功效。而一般抗性是維持豬在不良環境中生存和生產的必要條件，因此培育具有一般抗性的豬種成為育種領域的主要課題之一，篩選和確定豬一般抗病力的遺傳標記已成為培育具有一般抗性豬種的當務之急和關鍵所在。細胞因子在機體免疫應答過程中發揮了重要的輔助性作用，IL-2能夠促進T、B細胞的增殖，在抗腫瘤、抗毒素及免疫調節方面發揮了重要的作用；IL_4能夠誘導MHC-1I類抗原的表達，并增強其對腫瘤細胞和寄生蟲的殺傷性；IL-6能夠促進IL-2及其受體的表達，在免疫應答調節及造血過程中起到重要作用；IL-10是一個抗炎性因子，參與機體天然免疫的調節；IL_12主要在細胞免疫和I型細胞介導的抗腫瘤免疫中起作用；IFN-Beta能夠抑制病毒蛋白的合成，誘導MHC-1類抗原的增加，從而調劑機體的免疫功能。上述重要細胞因子的水平是機體免疫應答能力和一般抗病力的重要標志。殺菌通透性增強蛋白(bactericidal/permeability-1ncreasingprotein, BPI)是人和哺乳動物的內源性陽離子蛋白質，主要存在于多形核白細胞(Ploymorphneclearleukocytes, PMNs)的嗜苯胺藍顆粒中。BPI除了能殺滅G-菌，中和內毒素或脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)的活性外，還有調理功能、促進補體活化，增強吞卩遼的調理功能、抑制血管生成、抑制炎性介質釋放、抗真菌和原蟲等一系列生物學功能，在動物機體天然防御中起到了很重要的作用。具有生物活性的BPI是LPS的天然抑制物，而LPS可以激活單核吞噬細胞系統釋放細胞因子(如TNFa、IL6、IL2等)，引起全身炎癥反應，故BPI基因可以間接影響部分免疫指標水平，是研究動物抗病育種的重要候選基因。國內外關于豬BPI基因的多態性及其對疾病的抗性/易感性相關的研究鮮見報道，在美國專利網中有一段關于豬BPI基因的序列，長1452bp，沒有清楚的注釋，現將其命名為專利 BPI 序列(United States, Kind Code:Al, Patent Application:20040234980)。在此專利的公開信息中，Christopher等在約克、漢普夏、杜洛克、長白、大白、野豬和眉山豬中，檢測到BPI基因外顯子4和10分別存 在Ava II和HpaII酶切多態性，通過攻毒試驗表明其基因型與豬沙門氏菌的易感性有關，并把BPI基因確立為抗沙門氏菌病育種候選基因。

發明內容
本發明是用BPI基因外顯子4和10多態位點組合基因型作為豬一般抗病力的分子標記及其檢測方法與應用。檢測該分子標記的方法包括待測樣品的豬基因組DNA的提取及其PCR擴增，外顯子4的PCR產物經SSCP分析和外顯子10的PCR產物經限制性內切酶Hpa II的酶切，當待測豬個體基因型為CDAB型(外顯子4的PCR產物經SSCP分析出現4條帶且外顯子10的PCR產物經限制性內切酶Hpa II酶切出現445bp/304bp/ 142bp條帶)，則為一般抗病力強的個體。其中，外顯子4的引物A如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示；外顯子10的引物B如 SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4 所示。本發明為從遺傳素質上永久性地提高仔豬一般抗病力和免疫應答能力提供了有效的分子標記。本發明的優點體現在:I)本發明為豬抗病育種工作的分子標記輔助選擇提供一個更加高效準確的分子遺傳標記，為提高仔豬一般抗病力提供了一種有效的分子標記育種手段。用該遺傳標記對豬一般抗病力進行標記輔助選擇，豬抗逆性入手開展抗病育種，提高豬的免疫應答能力，可以更有效地解決豬很多疾病如呼吸道疾病與環境相互作用的問題，從根本上降低諸多疾病的發病率。2)使用2個變異位點的組合基因型作為標記，基因聚合效應并不是各個位點效應的簡單相加，合并基因型效應高于單個基因型效應，為加速改善仔豬抗病能力的分子育種奠定了基礎，將加快育種進程。3)本發明的檢測方法操作簡單，費用較為低廉，準確度高，并可實現自動化的直接檢測，本發明將在豬的育種中發揮巨大作用。


圖1為BPI基因 第4外顯子PCR擴增產物的SSCP分析圖；其中第I泳道為DD基因型；2-3泳道為CC基因型；4-5泳道為⑶基因型。圖2為BPI基因第10外顯子酶切后3種基因型的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；其中M為 pUC19DNA/MSp I (HapII)marker，第 2、6、8、11、12 泳道為 AA 基因型；第 4、10 泳道為 BB基因型，第1、3、5、7、10泳道為AB基因型。
具體實施例方式一、利用BPI基因第4外顯子和第10外顯子變異位點標記對蘇太豬核心群全面檢測基因型。每個個體采耳組織塊約1.0g,放入1.5mL的Eppendoff管內于冰盒中取回揚州大學動物遺傳育種與繁殖重點學科實驗室備用。按常規酚-氯仿法提取DNA。提取的DNA用核酸蛋白測定儀測定其含量和純度，-20°C保存備用。通過NCBI的 BLAST 找到豬的 21 條染色體的mapview,經過blast search againstpig sequences,找一段refseq序列(非冗余的)BPI mRNA序列EF436278并選擇高通量測試數據庫(HTGS)，從而找到一條同源性達到99%的序列，這一段是包含BPI全序列的高通量測試序列，序列號為FP339579.2，但并未注釋。然后通過NCBI上的spidey進行非冗余的mRNA與此高通量結果比對就可以得出BPI共有15個外顯子的全部信息，然后選取外顯子4和10等序列,利用Primer Premier5.0軟件進行引物設計(表I)。表IBPI基因外顯子4和10引物設計
權利要求
1.殺菌通透性增強蛋白基因作為豬一般抗病力遺傳標記的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于具體包括以下步驟: (I)提取待測樣本的耳組織DNA，備用； (2 ) PCR擴增:以步驟(I)的DNA為模板，用下述引物A和引物B分別進行PCR擴增， 引物A: 上游引物為:5’ -TCAGGTTGGTTACCGCAGAG -3’ 下游引物為:5’ -ACCCTGTTGATGTGGCTTCT -3’ 引物B: 上游引物為:5、CCCAACATGGAGATGCAGTTC -3^ 下游引物為:5'CAATGAATCAATGAGCACACC -3λ ； (3)引物A的PCR擴增產物用SSCP方法進行分析，引物B的PCR擴增產物用限制性內切酶//酶切后經聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染分析，選擇引物A擴增產物出現4條帶且同時引物B擴增產物出 現445 bp/304 bp/142 bp條帶的樣本為一般抗病力強的個體。
全文摘要
本發明涉及篩選一種豬一般抗病力BPI基因第4和10外顯子變異位點組合基因型的遺傳標記，屬于豬遺傳育種及分子標記輔助選擇技術領域。本發明方法包括待測樣品的豬基因組DNA的提取及其PCR擴增，外顯子4的PCR產物經SSCP分析和外顯子10的PCR產物經限制性內切酶HpaII的酶切，當待測豬個體基因型為CDAB型，則為一般抗病力強的個體。本發明為豬抗病育種工作的分子標記輔助選擇提供一個更加高效準確的分子遺傳標記，為提高仔豬一般抗病力和免疫應答能力提供了一種有效的分子標記育種手段，本發明的檢測方法操作簡單，費用較為低廉，準確度高，并可實現自動化的直接檢測，本發明將在豬的育種中發揮巨大作用。
文檔編號C12Q1/68GK103173531SQ20121036986
公開日2013年6月26日 申請日期2012年9月27日 優先權日2012年9月27日
發明者包文斌, 吳圣龍, 潘章源, 吳正常, 霍永久, 朱國強, 黃小國, 黃雪根, 陳洪青, 孫壽永 申請人:揚州大學