專利名稱：雙峰駝酪氨酶、編碼基因及其獲取方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，特別是涉及一種在雙峰駝酪氨酸酶、編碼基因及其獲取方法。
背景技術：
酪氨酸酶(Tyrosinase，TYR)是一種75kD含銅酶，來源于胚胎神經峭細胞，是黑素代謝和兒茶酚胺的關鍵酶。Spritz等證實人TYR是一種銅結合蛋白，有銅A和銅B位點。離子銅特異性能與人TYR結合，一個位點的銅結合可以促進另一個位點的銅結合。酪氨酸酶在黑色素生物合成過程中，起著重要的催化作用，是迄今已知唯一參與黑色素生物合成的酶。研究發現，酪氨酸酶是一種具有多種生物學功能的蛋白質。主要存在于黑素細胞 中的黑素體內，絕大部分與黑素體膜相結合，只有極少數以游離的狀態存在。TYR的多肽鏈的適當折疊對銅結合及其催化活性是關鍵性的，TYR突變可中斷銅結合使其催化活性喪失。酪氨酸酶是一種獨特的具有雙重催化功能的酶。在黑色素生物合成過程中，它首先將酪氨酸羥化產生L-多巴(鄰位二羥基苯丙氨酸)；然后再將L-多巴氧化成多巴醌，多巴醌經一系列復雜反應，最后形成黑色素。酪氨酸酶的研究，在1991年，Chen，Js.用實驗證實曲酸主要通過干擾酪氨酸酶反應時所需要的氧來抑制黑色素的生成。2007年，王建新等人進行了酪氨酸酶抑制劑和激活劑的研究，表明酪氨酸酶是產生黑色素的主要限速酶，通過激活或抑制酪氨酸酶的活性可促進毛發和皮膚黑素的生成或抑制，達到烏發或皮膚增白的目的。2009年，何學民等人對黑色素與酪氨酸酶進行了研究，結果表明在體內黑色素生成過程中酪氨酸酶起了重要的催化作用，抑制酪氨酸酶活性便能達到減少色素生成的目的。在雙峰駝中，酪氨酸酶是駱駝黑素細胞中重要的蛋白，具有催化活性，又是多種物質及生物的受體，與生物醫學有著密切的關系。因此，對駱駝酪氨酸酶的研究將有助于細胞生物學和醫學的發展。

發明內容
本發明提供了一種雙峰駝酪氨酸酶雙峰駝酪氨酸酶，該酶與體內黑素細胞密切相關，其氨基酸序列如下述(a)或(b)所示(a) SEQ ID NO. 2 所示序列；(b)在(a)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或/和疊加一個或多個氨基酸衍生得到的，且與(a)編碼蛋白質具有相同功能的保守性變異多肽、活性片段或活性衍生物的氨基酸序列。本發明還提供了一種雙峰駝酪氨酸酶編碼基因，其核苷酸序列如下述(a)或(b)所示(a) SEQ ID NO. I 所示序列；
(b)由堿基簡并或/和替代衍生的與(a)所述核苷酸序列90%以上同源性，且與(a)編碼相同功能蛋白質的序列。本發明還提供了一種雙峰駝酪氨酸酶編碼基因的獲取方法，該方法包括步驟(I)組織分離(Isolation) ； (2)總RNA的分離(Total RNA isolation):包括①提取RNA的準備工作組織總RNA提取組織總RNA的鑒定。(3)全長cDNA的克隆(Cloning ofFull-length cDNA)包括①引物設計及合成RT-PCR擴增；③克隆和測序，其中PCR引物的正向引物為SEQ ID NO. 3和反向引物為SEQ ID NO. 4， 其序列信息如下SEQ ID NO. 3 :5’ -ATGCTCCTGGCTGCTTTGTAC-3’，SEQ ID NO. 4 :Oligo dT。上述總RNA的分離是將雙峰駝耳部組織液放入裝有Trizol的勻漿器管中勻漿，離心分離，吸取上清液，在15-30°C溫育5分鐘，加氯仿，劇烈震蕩，繼續在15-30°C溫育2_3分鐘，再次離心分離，吸取上清液，加異丙醇混合均勻，后15-30°C溫育10分鐘，離心分離，所得沉淀物加75%乙醇洗滌，離心分離后自然干燥或真空干燥得到總RNA。分離提取后的總RNA用分光光度計測定RNA含量和用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的質量。上述反轉錄PCR按照大連寶生物反轉錄試劑盒的要求進行反轉錄。上述克隆和測序包括PCR擴增片段的回收、回收片段同T載體的連接、質粒的轉化、轉化菌落的PCR鑒定與培養、質粒的回收、質粒的酶切鑒定和重組質粒的測序。上述PCR擴增片段的回收按照上海華舜小量膠回收試劑盒的要求進行。上述回收片段同T載體的連接用TaKaRa pMD18_T Vector試劑盒。上述質粒的轉化為將感受態細胞加入到回收片段同T載體的連接產物中，冰浴30分鐘，然后在42°C水浴熱應激90秒鐘，立即置入冰浴中2分鐘，加液體LB培養基，37°C復活50分鐘，后涂布于含有氨芐青霉的LB平板上，37°C恒溫培養10-15小時。上述轉化菌落的PCR鑒定與培養為挑選轉化培養的單菌落，放入到加有PCR反應液的EP管中晃動，使單菌落充當模板；用獲得該片段的PCR條件進行擴增，PCR產物同Marker 一起進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒別T載體上是否含有目的片段；若得到目的片段，可挑取在LB平板上的與之對應的單菌落，放入含有的青霉素鈉LB液體培養基中，37°C過夜搖菌培養，用于質粒回收。上述質粒的回收用上海華舜小量質粒抽提純化試劑盒實現。上述質粒的酶切鑒定采用雙酶切法鑒定，選擇內切酶Bam H I和Hin d III。本發明在提供了雙峰駝酪氨酸酶基因的cDNA序列和蛋白編碼序列基礎上，將人、鼠、牛等不同物種酪氨酸酶基因的CDS序列和氨基酸序列進行同源性比較；對包括雙峰駝在內的10個物種的十個酪氨酸酶基因的CDS序列構建了系統發生樹。本發明中的雙峰駝酪氨酸酶基因的cDNA序列是通過以雙峰駝組織中總RNA為模板，參考人、鼠、牛等物種的酪氨酸酶基因的同源序列設計引物，進行反轉錄PCR而獲得的新基因序列。獲得的雙峰駝酪氨酸酶基因cDNA序列見SEQ ID NO. I。將雙峰駝酪氨酸酶基因cDNA序列中的編碼序列(⑶S)按通用密碼子翻譯成的蛋白質編碼序列見SEQ ID NO. 2。在SEQ ID NO. I中，RT-PCR產物長度為1806bp，電泳結果見圖1，其中31-33位為起始密碼子ATG，1621-1623位為終止密碼子TAA，31-1623位為編碼蛋白質區域(⑶S)。在SEQ ID NO. 1，雙峰駝酪氨酸酶基因編碼530個氨基酸。雙峰駝與牛(AAL02331. 2)、綿羊(NP_001123499. I)的酪氨酸酶核酸序列具有89%的相似性。雙峰駝和人、鼠、牛等動物用Clustal X中對齊的酪氨酸酶基因編碼氨基酸序列同源性比較結果見圖2。對包括SEQ ID NO. I在內的10個物種的十條酪氨酸酶基因的⑶S序列構建了系統發生樹，結果發現雙峰駝酪氨酸酶同牛和綿羊的進化距離最近，間接證明了所得到的序列確為雙峰駝酪氨酸酶基因。本發明所得到的酪氨酸酶蛋白的基因序列和該蛋白結構的數據可用于研究其在黑素合成的下游途徑中的重要作用，為闡明雙峰駝毛色生成機理和未來產生人為控制的商用價值的毛色提供理論基礎和依據，并能夠為其它哺乳動物的皮膚與毛發色素形成機理研究奠定一定的生物學基礎。


圖I為雙峰駝酪氨酸酶基因RT-PCR產物電泳圖；
圖2為構建系統發生樹所用酪氨酸酶氨基酸同源性比較；圖3為不同物種酪氨酸酶氨基酸序列系統進化樹。
具體實施例方式下面實施例用于對本發明的進一步說明，但不用來限制本發明的保護范圍。實施例I :雙峰駝酪氨酸酶基因cDNA序列的克隆I.組織分離(Isolation)從內蒙古阿拉善盟雙峰駝，快速采得樣品，將耳部組織樣迅速放入液氮中冷凍后于-70°C保存，拿回實驗室準備提取組織總RNA。2.總 RNA 的分離(Total RNA isolation)(I)提取RNA的準備工作玻璃制品用0. IM的NaOH浸泡過夜，用自來水反復沖洗，再用蒸餾水沖洗2遍，180°C烘烤4小時。勻漿器、電泳槽用3%的雙氧水浸泡20-30分鐘，再用0. I %的DEPC水沖洗，由于未滅活的DEPC對PCR反應有影響，可用0. 5%的SDS處理。Tip頭、EP管用0. I %的DEPC水浸泡過夜，高壓滅菌使DEPC失活。雙蒸水和溶液用DEPC處理，即每IOOml水或溶液加0. ImlDEPC液，室溫放置過夜，高壓滅菌30分鐘DEPC失活。(2)組織總RNA提取取IOOmg在液氮中凍存的組織樣放入有Iml Trizol (trizal reagent,invitrogenBRL, USA)的勻衆器管中勻衆。4 °C 12000rpm離心10分鐘。吸取上清液，15-30°C溫育5分鐘。加0. 2ml氯仿，蓋上蓋子，用手劇烈震蕩15秒。15_30°C溫育2_3分鐘。4°C 12000rpm離心15分鐘。吸取上清液，加0. 8ml異丙醇，混合均勻。15_30°C溫育10分鐘，4°C 12000rpm離心10分鐘，離心管底部白色沉淀即為RNA。倒掉上清，加lml75%乙醇洗滌RNA，4°C 7500rpm離心10分鐘。自然干燥或真空干燥RNA.溶于水(RNase free)中分裝，-70°C保存。(3)組織總RNA的鑒定
通過分光光度計上測定RNA含量并且用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的質量，具體方法如下電泳槽用RNA清洗液(IOOmM NaOH, ImM EDTA)浸泡4_5小時，再用DEPC處理過的水反復沖洗數次后倒入I X TBE待用。瓊脂糖凝膠用IXTBE配制。在IOul上樣緩沖液(2 X TBE, 13%菲可，O. 1%溴酚蘭，7M尿素)中加入Iul以上組織總RNA，65°C變性10分鐘后立即放入冰水中2-3分鐘。點樣于瓊脂糖凝膠中電泳。3.全長 cDNA 的克隆(Cloning of Full-length cDNA)(I)引物設計及合成根據GenBanK發表的人(AAA52625. I)、鼠(EDK97062. I)等物種的酪氨酸酶基因mRNA序列ORF側翼同源序列，設計如下引物用于以雙峰駝酪氨酸酶cDNA為模版的PCR擴增，以獲得雙峰駝酪氨酸酶基因cDNA序列。引物用PrimerPremier5.0自行設計，由上海桑尼生物科技有限公司合成，該引物對的核苷酸序列分別為SEQ ID NO :3(正向)和SEQ IDN0:4(反向)，序列信息如下 SEQ ID NO :3 :5，-ATGCTCCTGGCTGCTTTGTAC-3，SEQ ID N0:4(反向)01igo dT(2) RT-PCR 擴增按大連寶生物反轉錄試劑盒(BcaBEST RNA PCR Kit Ver. I. I)要求進行反轉錄。反轉錄反應液組成10ul2XBca 1st Buffer,4ul 25Mm MgS04, Iul dNTPMixture,0. 5ulRnase Inhibitor(40U/ul),Iul BcaBEST Polymerase(22U/ul), Iul OligodT Primer,IulRNA Sample, I. 5ul Rnase Free dH20,總體系為 20ul。反轉錄反應條件65°C I 分鐘，30°C 5分鐘(15分鐘-30分鐘內勻速升溫)，65°C 25分鐘，98°C 5分鐘，5°C 5分鐘。PCR擴增條件97°C變性5分鐘；95°C 30秒一55°C 30秒一72°C I分鐘，如此進行30次循環；72°C延伸10分鐘，4 °C保存。(3)克隆和測序PCR擴增片段的回收。片段回收按上海華舜小量膠回收試劑盒說明進行，操作過程如下盡可能小的割下含DNA的瓊脂糖塊，放入I. 5mlEP管中。按每IOOmg瓊脂糖加入300ulSl液的比例加SI液，50°C水浴10分鐘。將溶化的瓊脂糖液移入吸附柱，IOOOOrpm離心I分鐘，倒掉管中液體。在吸附柱中加入500ul Wl液，IOOOOrpm離心15秒，倒掉管中液體。在吸附柱中加入500ul Wl液，靜置I分鐘后，IOOOOrpm離心15秒，倒掉管中液體。離心I分鐘。將吸附柱放入一個干凈的I. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入30ulTl液，靜置I分鐘后，IOOOOrpm離心I分鐘，EP管中液體即為回收的DNA?；厥掌瓮琓載體的連接。連接用TaKaRa pMD18_T Vector試劑盒，操作過程如下在 EP 管中制備下列連接反應pMD 18-T Vector (50ng/ul)0. 5ul, DNA20_40ng，Solution I 5ul，加dH20至10ul。將上述反應液在16°C反應30分鐘(過夜也可以)，產物用于轉化感受態細胞。質粒的轉化。從_70°C冰箱中取出保存的感受態細胞，冰浴助溶。IOOul感受態細胞加入IOul連接產物，冰浴30分鐘。42°C水浴熱應激90秒鐘，立即置入冰浴中2分鐘。加400ul液體LB培養基，37°C復活50分鐘。取IOOul鋪于LB平板上，平板含0. I % (V/V)的氨節青霉Amp (100mg/ml)。37°C恒溫培養10-15小時。轉化菌落的PCR鑒定與培養。用記號筆標記轉化培養的單菌落，用滅菌的牙簽蘸取單菌落。將牙簽頭放入在加有PCR反應液(不含模板，即引物、DNA聚合酶、dNTP、緩沖液及水加上剛才的單菌落就成了 PCR反應體系))的EP管中晃動，使單菌落充當模板。用獲得該片段的PCR條件進行擴增。PCR產物同Marker —起進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒別T載體上是否含有目的片段。若得到目的片段，可用滅菌槍頭挑取在平板上的與之對應的單菌落，放入40ml LB液體培養基中，先在液體中加入O. I % (V/V)的青霉素鈉(100mg/ml)，37°C過夜搖菌培養，用于質?；厥铡?質粒的回收。質粒回收用上海華舜小量質粒抽提純化試劑盒，操作步驟如下將轉化培養的菌液加入I. 5mlEP管中，4000rpm離心，倒掉液體獲細菌沉淀。細菌沉淀不夠時可再加一次菌液離心。在細菌沉淀中加入250ulPl液，振蕩懸浮。加入250ulP2液，溫和搖勻，室溫靜置4分鐘。加入350ulP3液，溫和搖勻。離心10分鐘，將上清液小心移入吸附柱，離心15秒，倒掉液體。在吸附柱中加入500ulWl，離心15秒，倒掉液體。在吸附柱中加入500ulWl，靜置I分鐘，離心15秒，倒掉液體。離心I分鐘。將吸附柱放入一個干凈的I. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入25-30ulTl液，靜置I分鐘后，離心I分鐘，EP管中液體即為回收的質粒。質粒的酶切鑒定。為了證明回收質粒確為插入目的片段的重組質粒，采用雙酶切法鑒定，研究具體操作如下根據TaKaRa pMD18_T Vector圖，選擇內切酶Bam H I和Hind III，保證目的片段中無這兩種酶的切點。組成如下酶切反應體系Bam H I lul,Hin d IIIlul, IOXK Buffer 2ul，DNA彡lul，加dH20至20ul。30°C反應3小時。瓊脂糖凝膠電泳檢測。重組質粒的測序。取20ul重組質粒于EP管中，封口膜密封，交生物技術公司測序。實施例2 :雙峰駝酪氨酸酶基因編碼序列同源性比較和系統發生樹構建
I、雙峰駝酪氨酸酶基因編碼序列同源性比較在GenBank上搜索并獲得人、鼠、牛等九種動物的酪氨酸酶基因編碼蛋白序列，將其同克隆測序獲得的本發明獲得的SEQ ID NO. I序列一起，在分子生物學軟件MEGA4上進行序列同源性比較(見附圖2)。比較結果顯示SEQ ID NO. 2序列與牛和綿羊的酪氨酸酶氨基酸序列同源性為89. 00%。2、酪氨酸酶基因編碼序列系統發生樹構建在GenBank上搜索并獲得人、鼠、牛等9種物種的九條酪氨酸酶基因的編碼蛋白序列，加上本發明獲得的SEQ ID NO. 2序列，利用分子生物學軟件MEGA4構建了系統發生樹(見圖3)。結果顯示雙峰駝酪氨酸酶基因同牛和綿羊的親緣關系最近；間接證明了所得到的序列確為雙峰駝酪氨酸酶基因。序列表序列表<110>內蒙古農業大學〈120〉雙峰駝酪氨酸酶的蛋白編碼序列<160>4<170>PatentIn version3. 3<210>1〈211>1806
<212>DNA〈213〉阿拉善盟雙峰駝〈400〉Icaaacagaccttgtgagaac tagaggaaga atgctcctgg ctgctttgta ctgcctgctg60tggagtttccagacctccgc tggccatttc cctcgagcct gtgcctcctc caagaacctg120atggagaaggaatgctgccc gccgtgggag ggtgacggga gtccctgtgg ccagctctca180ggcaggggttcctgtcagga catcaatctg tccaaggcac cacctggacc tcagttcccc240ttcacaggggtggatgaccg ggaatcttgg ccctctgtct tttataacag gacctgccag 300tgctttgacaacttcatggg attcaactgt ggaaattgca agtttggctt ccggggaccc360aactgcagagagaggcgact tttggtgaga agaaacatct ttgatttgag tgtcccagag420aagaacaaatttcttgccta cctcacttta gccaaacata ctaccagccc agactacgtc480atccccacgggcacctatgg ccaaatgaat aatggatcaa cacccatgtt caatgacatc540aacgtttatgacctctttgt atggatgcat tattatgtgt caagggacac gctgcttggg600gggtctgaaatctggaaaga cattgatttt gctcatgaag caccaggctt cctgccttgg660catagactcttcttgttgct gtgggaacaa gaaatccaga agctgacagg ggatgagaac720ttcactattccatactggga ctggcgagat gcagacaact gtgaaatttg tacagatgag780tacatgggagggcgcgaccc agtaaaccct aatctactca gcccagcatc cttcttctcc840tcttggcagatcatctgcag ccggctggag gagtacaacc gccggcaggt tctgtgcgac900ggcacgtccgaggggccctt actgcgcaat cccgggaacc acgacccagc gcggaccccg960cggctcccctcctcggctga cgtggagttc tgcctgagtc tgacccagta tgattcgggc1020gccatggataaagccgccaa tttcagcttt agaaacaccc tggaaggatt tgctagtcca1080cttactgggatagcagatgc ctctcaaagc agcatgcaca atgccttgca catcttcatg1140aatggaacaatgtcccaggt gcagggatct gccaacgatc ccattttcct tcttcatcat1200gcatttgttgacagtatttt tgaacagtgg cttcgaaggc accatcctct tcaagaagtc1260taccctgaagccaatgcacc cattgggcac aaccgcgaat cctacatggt tccttttata1320cctctctacagaaatggtga tttctttatt tcatccagag atctgggcta tgactatagc1380tacctacaagattcagaccc ggactttttt caagattaca ttaagccgta cttagaacaa1440gcaagccagatctggccgtg gctcgtcggg gcagccctgg tggggtctgt cctcacggct1500gtgctgggcggactcactcg ccgtttatgt cgtcgaaaga gaaagcagct tcctgaagaa1560aaggagccacttctcatgga aaaggaggat taccacagcc tgctgtacca gagccattta1620taacaggctttggccataga ggaggacctg acctcactct agcttaatgg tgttcaagtc1680cccagaaggtgtcccagcag aaacacagca gatgatcagc actgtaatga aaggcaaagc1740ggactcctccttcaactcag gtagacccca cctgtgcttg ctttgtttgt attctgatca1800tccctt1806<210>2<211>530<212>PRT〈213〉阿拉善盟雙峰駝<400>2Oz 102876639 A 0. S !/!矧
212U MLLMLYCLL WSFQTSAGHF PRACASSKNL MEKECCPPWE GDGSPCGQLS GRGSCQDINL 60〔0113〕 SKAPPGPQFP FTGVDDRESW PSVFYNRTCQ CFDNFMGFNC GNCKFGFRGP NCRERRLLVR 120〔0114〕 RNIFDLSVPE KMFLAYLTL AKHTTSPDYV IPTGTYGQMN NGSTPMFNDI NVYDLFVWMH 180I--10115U YYVSRDTLLG GSEIWKDIDF AHEAPGFLPW HRLFLLLWEQ EIQKLTGDEN FTIPYWDWRD 240〔0112 ADNCEICTDE YMGGRDPVNP NLLSPASFFS SWQIICSRLE EYNRRQVLCD GTSEGPLLRN 300〔0117〕 p§p>^p RLPSSADVEF CLSLTQYDSG AMDKMNFSF RNTLEGFASP LTGIADASQS 360〔oils SiALHIFM NGTMSQVQGS ANDPIFLLHH AFVDSIFEQW LRRHHPLQEV YPEANAPIGH §I--10119U PLYRNGDFFI SSRDLGYDYS YLQDSDPDFF QDYIKPYLEQ ASQIWPWLVG 辦 80〔012s MLVGSVLTA VLSLTRRLC RRKRKQLPEE SPLLMESD YHSLLYQSHL 530〔0121〕 <210>3〔0122U <211>21〔0123U <212>DNA〔0124〕 <213〉AH〔0125U <400>3
〔0122 ATGCTCCTGGCTGCTTTGTAC 21〔0127U <210>4
〔012s <211〉
〔0129U <212>DNA〔0130〕 <213〉AH
H·1
O
權利要求
1.一種雙峰駝酪氨酸酶，其氨基酸序列如下述(a)或(b)所示(a)SEQ ID NO. 2 所示序列； (b)在(a)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或/和疊加一個或多個氨基酸衍生得到的，且與(a)編碼蛋白質具有相同功能的保守性變異多肽、活性片段或活性衍生物的氨基酸序列。
2.一種雙峰駝酪氨酸酶編碼基因，其核苷酸序列如下述(a)或(b)所示(a)SEQ ID NO. I 所示序列； (b)由堿基簡并或/和替代衍生的與(a)所述核苷酸序列90%以上同源性，且與(a)編碼相同功能蛋白質的序列。
3.—種雙峰駝酪氨酸酶編碼基因的獲取方法，該方法包括如下步驟 (1)從雙峰駝耳部組織中分離提取總RNA； (2)根據人、鼠及牛不同物種的酪氨酸酶基因的同源序列設計引物，進行反轉錄PCR，其中 引物的正向引物為 SEQ ID NO. 3 :5，-ATGCTCCTGGCTGCTTTGTAC-3，， 反向引物為 SEQ ID NO. 4 =Oligo dT ； (3)克隆和測序。
4.按照權利要求3所述的雙峰駝酪氨酸酶編碼基因的獲取方法，其特征在于從雙峰駝耳部組織液中分離提取總RNA為將雙峰駝耳部組織液放入裝有Trizol的勻漿器管中勻漿，離心分離，吸取上清液，在15-30°C溫育5分鐘，加氯仿，劇烈震蕩，繼續在15-30°C溫育2-3分鐘，再次離心分離，吸取上清液，加異丙醇混合均勻，后15-30°C溫育10分鐘，離心分離，所得沉淀物加75%乙醇洗滌，離心分離后自然干燥或真空干燥得到總RNA。
5.按照權利要求3所述的雙峰駝酪氨酸酶編碼基因的獲取方法，其特征在于分離提取后的總RNA用分光光度計測定RNA含量和用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的質量。
6.按照權利要求3所述的雙峰駝酪氨酸酶編碼基因的獲取方法，其特征在于上述反轉錄PCR按照大連寶生物反轉錄試劑盒的要求進行反轉錄。
7.按照權利要求3所述的雙峰駝酪氨酸酶編碼基因的獲取方法，其特征在于上述克隆和測序包括PCR擴增片段的回收、回收片段同T載體的連接、質粒的轉化、轉化菌落的PCR鑒定與培養、質粒的回收、質粒的酶切鑒定和重組質粒的測序。
8.按照權利要求7所述的雙峰駝酪氨酸酶編碼基因的獲取方法，其特征在于上述PCR擴增片段的回收按照上海華舜小量膠回收試劑盒的要求進行。
9.按照權利要求7所述的雙峰駝酪氨酸酶編碼基因的獲取方法，其特征在于上述回收片段同T載體的連接用TaKaRa pMD18_T Vector試劑盒。
10.按照權利要求7所述的雙峰駝酪氨酸酶編碼基因的獲取方法，其特征在于上述質粒的轉化為將感受態細胞加入到回收片段同T載體的連接產物中，冰浴30分鐘，然后在42°C水浴熱應激90秒鐘，立即置入冰浴中2分鐘，加液體LB培養基，37°C復活50分鐘，后涂布于含有氨芐青霉的LB平板上，37°C恒溫培養10-15小時。
11.按照權利要求7所述的雙峰駝酪氨酸酶編碼基因的獲取方法，其特征在于上述轉化菌落的PCR鑒定與培養為挑選轉化培養的單菌落，放入到加有PCR反應液的EP管中晃動，使單菌落充當模板；用獲得該片段的PCR條件進行擴增，PCR產物同Marker —起進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒別T載體上是否含有目的片段；若得到目的片段，可挑取在LB平板上的與之對應的單菌落，放入含有的青霉素鈉LB液體培養基中，37°C過夜搖菌培養，用于質粒回收。
12.按照權利要求7所述的雙峰駝酪氨酸酶編碼基因的獲取方法，其特征在于上述質粒的回收用上海華舜小量質粒抽提純化試劑盒實現。
13.按照權利要求7所述的雙峰駝酪氨酸酶編碼基因的獲取方法，其特征在于上述質粒的酶切鑒定采用雙酶切法鑒定，選擇內切酶Bam H I和Hin d III。
全文摘要
本發明涉及一種在雙峰駝酪氨酸酶基因、編碼蛋白及其雙峰駝酪氨酸酶基因獲取方法，本發明通過以雙峰駝組織中總RNA為模板，參考人、鼠、牛等物種的酪氨酸酶基因的同源序列設計引物，進行反轉錄PCR而獲得的新基因序列。獲得的雙峰駝酪氨酸酶基因cDNA序列見SEQ ID NO.1。將雙峰駝酪氨酸酶基因cDNA序列中的編碼序列(CDS)按通用密碼子翻譯成的蛋白質編碼序列見SEQ ID NO.2。本發明對包括SEQ ID NO.1在內的10個物種的十條酪氨酸酶基因的CDS序列構建了系統發生樹，結果發現雙峰駝酪氨酸酶同牛和綿羊的進化距離最近，間接證明了所得到的序列確為雙峰駝酪氨酸酶基因。
文檔編號C12N9/02GK102876639SQ201210370079
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月29日 優先權日2012年9月29日
發明者張文彬, 吉日木圖 申請人:張文彬