專利名稱：山羊葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體4基因及其重組表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及山羊葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體4基因及其重組表達(dá)載體和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
葡萄糖是一種極性分子，需要借助于胞膜上的運(yùn)載蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。在哺乳類細(xì)胞內(nèi)有兩類葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體Na+葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和易化葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Glut)。參與人體葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的主要的是易化葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。至今在哺乳類動(dòng)物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)13種Glut，其中Glut4是一個(gè)主要的研究熱點(diǎn)。由于葡萄糖是乳腺上皮細(xì)胞合成乳糖的主要前體，所以給泌乳動(dòng)物的乳腺提供葡萄糖是新陳代謝的重點(diǎn)。因?yàn)槿樘蔷S持著乳的滲透壓，所以乳糖合成速率是影響產(chǎn)奶量的 主要原因。另外，葡萄糖除了是重要的乳糖合成前體，還可以產(chǎn)生ATP、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，也是合成蛋白質(zhì)、脂肪和核苷酸的前體。一頭泌乳牛每產(chǎn)Ikg牛奶需要72g葡萄糖。因此，一頭日產(chǎn)奶量40kg的奶牛，它的乳腺每天需要攝入3kg的葡萄糖。事實(shí)如此，乳腺攝入的葡萄糖是血糖總量的60 85%。Glut4是胰島素依賴型蛋白，主要存在于胰島素敏感的組織中骨骼肌，心肌和脂肪組織，Glut4是這些組織中的主要的葡萄糖運(yùn)載體。近年來(lái)由于葡萄糖鉗夾技術(shù)的應(yīng)用，已經(jīng)證實(shí)細(xì)胞外膜上葡萄糖載體的含量與細(xì)胞葡萄糖最大轉(zhuǎn)運(yùn)能力呈正相關(guān)關(guān)系，葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是骨骼肌利用葡萄糖的主要限速過(guò)程。基礎(chǔ)狀態(tài)和胰島素刺激狀態(tài)下，葡萄糖利用分別占全身的20 %和70 % 85 %。Glut4在促進(jìn)葡萄糖的吸收和利用上起了關(guān)鍵限速的作用。尤其是在胰島素狀態(tài)下，Glut4起決定性作用。通過(guò)增加細(xì)胞GLUT4的表達(dá)，可以達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞吸收葡萄糖，增加細(xì)胞能量代謝和合成代謝的目的。本發(fā)明提供了山羊葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體4基因GLUT4序列及其相應(yīng)的氨基酸序列。提供了含有山羊葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體4基因的真核表達(dá)載體P⑶NA3. 1-GLUT4和含有這種載體的大腸桿菌(E. coli)細(xì)胞JMI09/pCDNA3. 1-GLUT4以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的山羊乳腺上皮細(xì)胞株GMGE/p⑶NA3. 1-GLUT4。利用本發(fā)明成果，可以用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因整合載體，提高山羊乳腺對(duì)葡萄糖的攝取能力，增加產(chǎn)奶量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種山羊葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體4基因。本發(fā)明的另一目的是提供含有該基因的重組表達(dá)載體。本發(fā)明的又一目的是提供該基因的應(yīng)用。本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因GLUTl，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
所述的基因GLUT4，該基因的編碼序列如序列表SEQ ID NO : I中第144-1673位所
示核昔酸。含有本發(fā)明所述的GLUT4基因的真核表達(dá)載體pCDNA3. 1-GLUT4。含有真核表達(dá)載體pCDNA3. 1-GLUT4的大腸桿菌(E. coli)受體細(xì)胞JM109/pCDNA3. 1-GLUT4。 本發(fā)明所述真核表達(dá)載體P⑶NA3. 1-GLUT4穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的山羊乳腺上皮細(xì)胞株GMGE/pCDNA3. 1-GLUT4。本發(fā)明所述的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因GLUT4在提高哺乳動(dòng)物乳腺細(xì)胞葡萄糖吸收和/或乳糖合成中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的真核表達(dá)載體P⑶NA3. 1-GLUT4在提高哺乳動(dòng)物乳腺細(xì)胞葡萄糖吸收和/或乳糖合成中的應(yīng)用。有益效果葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因可以提高山羊乳腺上皮細(xì)胞的葡萄糖的吸收和乳糖的合成。體外轉(zhuǎn)染山羊乳腺上皮細(xì)胞的熒光定量PCR結(jié)果顯示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組(只轉(zhuǎn)染P⑶NA3. 1-GLUT4)的GLUT4表達(dá)量高于對(duì)照組(正常培養(yǎng)的山羊乳腺上皮細(xì)胞)接近55倍。通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)24h和48h的培養(yǎng)基中葡萄糖的含量，24h轉(zhuǎn)染組葡萄糖的吸收量達(dá)到1.990±0. 0141yg/yg蛋白，顯著高于對(duì)照組的1.771±0. 00346 yg/yg蛋白；48h轉(zhuǎn)染組葡萄糖的吸收量達(dá)到9. 287±0. 278μ g/μ g蛋白，極顯著的高于對(duì)照組細(xì)胞(I. 99±0· 014μ g/μ g蛋白)。48h轉(zhuǎn)染組乳糖合成量達(dá)到178. 679±32· 968ng/y g蛋白顯著高于對(duì)照組細(xì)胞(49. 926±4. 192ng/yg蛋白)。


圖I :真核表達(dá)載體pCDNA3. 1-GLUT4的質(zhì)粒圖譜圖2 :GLUT4基因的克隆圖片圖3 NheI/HindIII 雙酶切 pCDNA3. 1-GLUT4 鑒定4 :轉(zhuǎn)染GLUT4基因的山羊乳腺上皮細(xì)胞GLUT4基因相對(duì)表達(dá)量圖5 :轉(zhuǎn)染GLUT4基因的山羊乳腺上皮細(xì)胞對(duì)葡萄糖吸收的變化圖6 :轉(zhuǎn)染GLUT4基因的山羊乳腺上皮細(xì)胞乳糖合成量的變化
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。具體涉及的材料和試劑如下羊肌肉組織來(lái)自于無(wú)感染病史的薩能奶山羊(購(gòu)自南京溧水種山羊養(yǎng)殖場(chǎng))，將組織于液氮冷凍，骨架載體 pCDNA3. I ( + ) (Company Invitrogen ；Catalog Number V79020 ；Product pCDNA3. I ( + ) Vector);山羊乳腺上皮細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)室分離);E. coli JM109 (購(gòu)自大連寶生物，Takara )。試劑TRizol, MLV-反轉(zhuǎn)錄酶，rTaq 酶，pMD19_T 載體，Agarose Gel DNAPurification Kit, TaKaRa DNA Ligation Kit 內(nèi)切酶 Xho I, Not I, KpnI, Cla I等均購(gòu)自TAKARA公司；0MEGA無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；脂質(zhì)體Lipofectamine2000,胎牛血清購(gòu)自 Invitrogen 公司；DMEM/F12 培養(yǎng)基(貨號(hào)C12430)購(gòu)自Gibco公司；青鏈雙抗(購(gòu)自碧云天)；胰島素、催乳素、氫化可的松(購(gòu)自南京生興生物有限公司)；進(jìn)口葡萄糖檢測(cè)試劑盒(Company :Biovisin Catalog Number K606-100Product Glucose Assay Kit)乳糖檢測(cè)試劑盒(Company :Biovisin CatalogNumber :K624_100Product Lactose Assay Kit),其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純級(jí)。實(shí)施例I載體pCDNA3. 1-GLUT4的構(gòu)建及酶切驗(yàn)證I. 1GLUT4基因的克隆首先勻漿器勻漿肌肉組織樣品，然后TRizol法提取總RNA。以薩能奶山羊肌肉織的總RNA為模板，以oligod(T)18引物采用invirtrogen公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA
第一鏈。引物設(shè)計(jì)和合成參照NCBI上的牛GLUT4基因全序列(Bos taurus solute carrier family2 (facilitated glucose transporter)，member4 (SLC2A4)，mRNA)登錄號(hào)NM174604。用DNASTAR做限制性內(nèi)切酶分析，用primer5. O設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增GLUT4基因的CDS區(qū)。引物設(shè)計(jì)如下GLUT4引物上游引物GLUT4-F :5’ -TCTCGCCAGACTCGCACTC-3’ (SEQ ID NO. 3)；下游引物GLUT4-R :5，-TGCTCAGACCACCGTTCCCT-3’ (SEQ ID NO. 4)反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，55°C復(fù)性30s，72°C延伸2min，共30個(gè)循環(huán)；然后72°C延伸10min，4°C終止。I. 2將GLUT4基因克隆到pMD19_T載體上將PCR擴(kuò)增的目的條帶經(jīng)膠回收純化后，與PMD19-T載體連接得到質(zhì)粒PMD19-T-GLUT4，轉(zhuǎn)化E. coli JM109感受態(tài)，挑取菌落做菌落PCR鑒定篩選陽(yáng)性克隆；篩選出陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒PMD19-T-GLUT4，酶切、PCR鑒定，送交上海生工測(cè)序。測(cè)序結(jié)果生物信息學(xué)分析顯示1837bp的序列包含了 GLUT4中的⑶S部分。I. 3將GLUT4插入到骨架載體pCDNA3. I ( + )的Nhe I和HindIII之間GLUT4基因酶切連接引物上游引物F :5’ -GCTAGCATGCCGTCGGGCTTCCAACA-3’ (SEQ ID NO. 5)下游引物R :5’ -AAGCTTTCAGTCATTCTCATCCGGCCCT-3’ (SEQ ID NO. 6)提取步驟I. 3中含有質(zhì)粒PMD19-T-GLUT4的大腸桿菌的質(zhì)粒，使用Nhe I和HindIII內(nèi)切酶分別酶切質(zhì)粒pMD19-T-GLUT4和pCDNA3. I ( + )。經(jīng)切膠回收后，將GLUT4片段與骨架載體P⑶NA3. I ( + )用T4連接酶相連接，如(圖2)。I. 4 重組質(zhì)粒 pCDNA3. 1-GLUT4 的鑒定用克隆GLUT4基因CDS區(qū)的引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢驗(yàn)。同時(shí)使用內(nèi)切酶Nhe I和HindIII對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。由圖可知載體pCDNA3. 1-GLUT4經(jīng)Nhe I和HindIII酶切后，切出大小1539p和5428bp的片段，與預(yù)期結(jié)果一致(圖3)。同時(shí)進(jìn)行PCR驗(yàn)證。以上鑒定證實(shí)pCDNA3. 1-GLUT4載體構(gòu)建成功。I. 5轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCDNA3. 1-GLUT4的提取和純化將重組質(zhì)粒P⑶NA3. 1-GLUT4用OMIGA無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取和純化質(zhì)粒，_20°C保存，用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
實(shí)施例2.山羊乳腺上皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)(I)準(zhǔn)備材料高壓后的眼科剪刀(一大一小)，刮毛刀，鑷子各兩把，小的術(shù)齒鑷一把，無(wú)菌培養(yǎng)皿2個(gè)，小青瓶?jī)蓚€(gè)。2%的碘酊I瓶，75%的酒精I(xiàn)瓶，加雙抗的PBS兩瓶。DMEM/F12培養(yǎng)基，添加15%的胎牛血清，EGF10ng/ml, 200ug/ml的雙抗。(2)實(shí)驗(yàn)步驟①、取材選取兩個(gè)月左右的小羊，盡量挑選耳組織上血管組織較少的部位用刮毛刀刮毛，先用2%的碘酊棉球擦拭要切取部位，I分鐘后用75%的酒精擦拭，用高壓消毒后的眼科剪刀，剪取Icm2左右的耳部組織，放人含250u/ml的青鏈雙抗的PBS中，4度浸泡，立即帶回實(shí)驗(yàn)室(四小時(shí)之內(nèi))。②、處理將樣品移入超凈臺(tái)中，將山羊的皮膚置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用含500IU · mL-1雙抗的PBS洗滌2次，剪除毛茬，輕輕刮去表皮組織和皮下組織，保留真皮層，將剩余組織在70%乙醇中浸泡30s，再含200ug/ml的雙抗PBS洗滌組織3 5次，然后剪·成Imm3大小的組織塊，移入組織培養(yǎng)瓶的底壁上，用吸管將組織塊均勻地鋪開(kāi)，小心翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，置于37度、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置4 6h。在組織塊周圍開(kāi)始變干以前加入DMEM培養(yǎng)液，浸沒(méi)組織塊，過(guò)夜，第2天補(bǔ)加入2 3mL DMEM培養(yǎng)液，每隔2 3d觀察并換液。原代細(xì)胞采用DMEM添加15%胎牛血清進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層后，用O. 25%胰酶消化，待大部分細(xì)胞變圓時(shí)，加培養(yǎng)液終止消化，并反復(fù)吹打。因?yàn)槌衫w維細(xì)胞消化脫壁比上皮細(xì)胞快，在前3代傳代經(jīng)酶消化，待細(xì)胞剛變圓即終止消化，只收集脫壁細(xì)胞，這樣便可得到純化的成纖維細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70% 80%匯合狀態(tài)時(shí)即可冷凍保存，以備細(xì)胞特性分析以及基因轉(zhuǎn)染使用。實(shí)施例3.山羊乳腺上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選將山羊乳腺上皮細(xì)胞接種于60mm孔培養(yǎng)板中，每個(gè)板用5ml培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前1山待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底的70% 80%時(shí)，改用無(wú)血清、無(wú)抗生素的DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，用不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后轉(zhuǎn)染。次日轉(zhuǎn)染按Lipofectamine2000說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染,脂質(zhì)體(uL)與質(zhì)粒(ug)的比例為3 : 2。細(xì)胞培養(yǎng)6h后棄去混合液，加入體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、不含抗生素的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。第2天，想培養(yǎng)基中加入700 μ g/ml的G418藥物，篩選14天。挑去單克隆匯集到24孔培養(yǎng)板中，將G418的濃度降至400 μ g/ml，繼續(xù)培養(yǎng)和傳代，直至6孔培養(yǎng)板。乳腺上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率比較低，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后檢測(cè)葡萄糖和乳糖的變化不明顯，并且受轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的影響較大。所以我們篩選了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的山羊乳腺上皮細(xì)胞用于檢測(cè)培養(yǎng)上清中葡萄糖和乳糖的變化。實(shí)施例4. pCDNA3. 1-GLUT4穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的山羊乳腺上皮細(xì)胞GLUT4基因的表達(dá)檢測(cè)細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)及樣品處理山羊乳腺上皮細(xì)胞和P⑶NA3. 1-GLUT4穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的山羊乳腺上皮細(xì)胞分別大量繁殖后，以IXio5的密度接種6孔培養(yǎng)板，分別培養(yǎng)，在細(xì)胞漲至50%時(shí)加誘導(dǎo)培養(yǎng)基。誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分DMEM+10%胎牛血清、胰島素(10μ g/mL)、催乳素(I μ g/mL)、氫化可的松(20μ g/mL)和1%青鏈雙抗。在誘導(dǎo)后4天,用TRizol提取每孔細(xì)胞的總RNA，用MLV-反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)GLUT4基因表達(dá)量的變化，使用的熒光定量PCR儀為ABI7500，使用的試劑為TAKARA公司的SYBR Premix ExTaq II (TlRNaseH Plus)。熒光定量PCR結(jié)果顯示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組(只轉(zhuǎn)染pCDNA3. 1-GLUT4)的GLUT4表達(dá)量高于對(duì)照組(正常培養(yǎng)的山羊乳腺上皮細(xì)胞)接近55倍(圖4)。實(shí)施例5.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的山羊乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖吸收和乳糖合成的檢測(cè)細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)及樣品處理山羊乳腺上皮細(xì)胞和P⑶NA3. 1-GLUT4穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的山羊乳腺上皮細(xì)胞分別大量繁殖后，以IXio5的密度接種6孔培養(yǎng)板，分別培養(yǎng)，在細(xì)胞漲至50%時(shí)加誘導(dǎo)培養(yǎng)基。誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分DMEM+10%胎牛血清、胰島素(10 μ g/mL)、催乳素(1μ g/mL)、氫化可的松(20μ g/mL)和1%青鏈雙抗。在誘導(dǎo)后4天更換新鮮培養(yǎng)基，并在之后的24h和48h分別收細(xì)胞培養(yǎng)液上清和細(xì)胞蛋白，使用葡萄糖檢測(cè)試劑盒和乳糖檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)培養(yǎng)液上清中的葡萄糖含量和乳糖含量；測(cè)定細(xì)胞蛋白用于矯正細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示，24h轉(zhuǎn)染組葡萄糖的吸收量達(dá)到1.990±0. 0141yg/yg蛋白，顯著高于對(duì)照組的I. 771 ±O. 00346 μ g/ μ g蛋白；48h轉(zhuǎn)染組葡萄糖的吸收量達(dá)到9. 287±0. 278μ g/μ g蛋白，極顯著的高于對(duì)照組細(xì)胞(I. 99+0. 014 μ g/μ g蛋白)(圖 5)。而48h轉(zhuǎn)染組乳糖合成量達(dá)到178. 679±32. 968ng/yg蛋白顯著高于對(duì)照組細(xì)胞(49·926±4· 192ng/yg 蛋白)(圖 6)。
權(quán)利要求
1.一種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因GLUTl，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基因GLUT4，其特征在于該基因的編碼序列如序列表SEQIDNO. I中第144-1673位所示核昔酸。
3.含有權(quán)利要求I所述的GLUT4基因的真核表達(dá)載體pCDNA3.1-GLUT4。
4.含有權(quán)利要求3所述的真核表達(dá)載體P⑶NA3.1-GLUT4的大腸桿菌(E. coli)受體細(xì)胞 JM109/pCDNA3. 1-GLUT4。
5.權(quán)利要求3所述真核表達(dá)載體P⑶NA3.1-GLUT4穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的山羊乳腺上皮細(xì)胞株GMGE/pCDNA3. 1-GLUT4。
6.權(quán)利要求I所述的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因GLUT4在提高哺乳動(dòng)物乳腺細(xì)胞葡萄糖吸收和/或乳糖合成中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求3所述的真核表達(dá)載體pCDNA3.1-GLUT4在提高哺乳動(dòng)物乳腺細(xì)胞葡萄糖吸收和/或乳糖合成中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及山羊葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體4基因及其重組表達(dá)載體和應(yīng)用。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因GLUT1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。含有本發(fā)明所述的GLUT4基因的真核表達(dá)載體pCDNA3.1-GLUT4。本發(fā)明葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因可以提高山羊乳腺上皮細(xì)胞的葡萄糖的吸收和乳糖的合成。因此可在提高哺乳動(dòng)物乳腺細(xì)胞葡萄糖吸收和/或乳糖合成中應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12R1/91GK102899328SQ201210374619
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月28日
發(fā)明者庾慶華, 朱立麒, 楊倩, 林 建 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)