專利名稱：一種檢測PML-RARa融合基因mRNA表達量的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域的熒光定量PCR技術，具體涉及一種檢測PML-RARa融合基因mRNA表達量的試劑盒。
背景技術：
急性早幼粒細胞性白血病(Acute Promyelocytic Leukemia, APL)是急性髓性白血病(Acute myeloid leukemia, AML)中的一種亞型，約占成人AML患者的10% 15%，病人常較年輕，年齡多在3(Γ38歲之間，10歲以下者比較罕見。據統計，國內APL發病率高于西方國家的10%左右，占AML的18. 7%，部分地區比如東北油田的發病率則高達20°/Γ30%。因此， APL存在年齡、種族與地域的差異。
近十余年來，由于全反式維甲酸和三氧化二砷的應用，采用雙誘導治療能夠使得 APL的初期誘導緩解率達到90%以上。藥物誘導治療之后，給予短程化療和結合以維甲酸和三氧化二砷的藥物進行維持治療，可以使病人在2年左右的時間結束治療并且臨床治愈率聞達90%ο
目前，APL的病因尚不明確，但是隨著分子生物學、細胞遺傳學等學科的快速發展， 人們對于APL分子生物學發病機制有了比較深入的了解。超過90%的APL發病的關鍵機制為t (15 ；17) (q22 ;q21)，導致15號染色體上PML基因和17號染色體上的RARa基因形成 PML-RARa融合基因。易位使15q22上的PML基因與17q21上的維甲酸受體α基因發生交互性重排，分別在15號染色體上形成PML-RARa融合基因和RARa-PML融合基因。研究表明， 患者的白血病細胞均有PML-RARa融合基因的表達，僅有70% 80%的患者同時表達PML-RARa 融合基因，說明PML-RARa融合基因是致病的關鍵。根據PML斷裂點的位置不同，PML-RARa 融合基因有三種亞型bcrl、bcr2和bcr3，分別稱為長型(L型)、變異型(V型)和短型(S型)， 發生的概率則依次為55%、5%和40%。PML-RARa融合蛋白作為一種變異的維甲酸受體，相較于野生型RARa蛋白具有不同的DNA特性,是維甲酸(retinoic acid,RA)信號的抑制物,通過不同的途徑稱為內在而有效的RARa靶基因轉錄因子抑制物。
因此，當患者檢測出PML-RARa融合基因突變時，可作為急性早幼粒細胞性白血病的診斷依據，也可作為對全反式維甲酸和砷劑治療療效預測的分子標志。
目前可用于PML-RARa融合基因的方法有探針雜交法、基因芯片法、質譜法、基因測序法及免疫熒光法等。探針雜交法假陽性率較高；基因芯片法成本高、制備方法繁瑣；質譜法難以在普通醫療機構開展；基因測序法雖敏感性和特異性高，但價格比較昂貴，而且操作較繁瑣，耗時較長。免疫熒光法檢測PML-RARa融合基因定量表達可高通量完成臨床樣品檢測，且特異性和敏感性都很高，其敏感性和特異性均高于直接免疫熒光檢測等方法。實時熒光定量PCR (Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈式反應)與免疫熒光法相比具有特異性增強、靈敏度提高和檢測快速、降低了污染等特點，且目前尚未有實時熒光定量PCR方法檢測PML-RARa融合基因。CN 102925558 A書明說2/11 頁發明內容
為了解決現有技術的問題，本發明實施例提供了一種采用熒光定量PCR技術檢測 PML-RARa融合基因mRNA表達量的試劑盒。所述技術方案如下
一種檢測PML-RARa融合基因mRNA表達量的試劑盒，包括檢測用引物、熒光探針、 cDNA第一鏈合成試劑、熒光定量PCR混合液、陰性對照和陽性對照，所述檢測用引物、熒光探針包括PML-RARaL融合基因引物、PML-RARaV融合基因弓丨物和PML-RARa S融合基因引物中的至少一種和內參基因ABL引物及Taqman熒光探針，其中
PML-RARa L融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: I所示；
PML-RARa L融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；
PML-RARa L融合基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO:3所示；
PML-RARa V融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所示；
PML-RARa V融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:5所示；
PML-RARa V融合基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO:6所示；
PML-RARa S融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:7所示；
PML-RARa S融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:8所示；
PML-RARa S融合基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO:9所示；
ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:10所不；
ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 11所示；
ABL基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO: 12所示；
所述cDNA第一鏈合成試劑含有MgCl2、逆轉錄酶緩沖液、dNTPs、RNA酶抑制劑、 Oligo (dT) 15、AMV逆轉錄酶和無RNase去離子水；所述熒光定量PCR混合液含有PCR預混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和無 RNase 去離子水。
進一步地，所述試劑盒還包括內部陽性控制序列、內部陽性控制序列的引物和 Taqman熒光探針，其中內部陽性控制序列如序列表中SEQ ID NO: 13所示；內部陽性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID NO: 14所示；內部陽性控制序列的下游引物如序列表中 SEQ ID NO: 15所示；內部陽性控制序列Taqman突光探針如序列表中SEQ ID NO: 16所示。
進一步地，所述PML-RARa L融合基因Taqman熒光探針、PML-RARa V融合基因 Taqman熒光探針、PML-RARa S融合基因Taqman熒光探針和ABL基因的Taqman熒光探針的 5’端連接有熒光報告基團FAM，3’端均連接有熒光淬滅基團TAMRA ;所述內部陽性控制序列的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團TET，3’端連接有熒光淬滅基團TAMRA。
具體地，所述內參基因ABL的核酸序列如序列表中SEQ ID NO: 17所示。
具體地，所述陰性對照為去離子水；所述陽性對照為含有PML-RARa L融合基因、 PML-RARa V融合基因和PML-RARa S融合基因的總RNA樣品。
具體地，所述第一鏈cDNA合成試劑為25mmol/L MgCl2 4 μ L，10 X逆轉錄酶緩沖液 2 μ L，IOmmoI/L dNTP2 μ L, RNA 酶抑制劑 O. 5 μ L，Oligo (dT) 15 O. 5ug, AMV 逆轉錄酶 I. 5U 和無RNase去離子水,總體積11 μ L。
具體地，所述熒光定量PCR的混合液(以反應體系終濃度表示)為I X的PCR預混合液(原液為 2 XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、。· 2-0. 4mM 的 dNTPs,O. 3-0. 6mM 的 dUTP、O.2U/ μ L的Taq酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶以及無RNase去離子水。4
本發明試劑盒的優點和效果如下
(I)敏感性高可重復敏感度為O. 01%，即10000個細胞中有一個含PML-RARa融合基因就可以被檢測出。
(2)特異性強使用特異性探針對定量分子進行識別，準確性高。同時，靶序列由弓I物和探針雙重控制，特異性好、假陽性低。
(3)簡便安全操作簡單、安全、自動化程度高而且防止污染。擴增和檢測可以在同一管內檢測，不需要開蓋，不易被污染；同時擴增和檢測一步完成，不需要后期處理，無需要擔心放射性污染。
(4)全程監控本發明實施例提供的試劑盒引入了內部陽性控制質量控制體系，對檢測過程進行全程質量監控，有效避免假陽性或者假陰性。
(5)快速速度快、高通量，可在3-4小時完成。
本發明的試劑盒能快速、準確、定量檢測PML-RARa融合基因mRNA水平，有效杜絕了假陽性和假陰性的發生，用于急性早幼粒細胞性白血病的診斷及治療過程中微小殘留病的監測，為急性早幼粒細胞性白血病的診斷、制定治療方案及療效評價和預后提供了重要的檢測手段。


為了更清楚地說明本發明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。·
圖IA是本發明實施例2提供的試劑盒的熒光實時定量PCR反應體系擴增 I. OxlO6-L OxlO3拷貝的內部陽性控制序列標準品的熒光曲線圖IB是由本發明實施例2提供的試劑盒的熒光實時定量PCR反應體系擴增 I. OxlO6-L OxlO3拷貝的內部陽性控制序列標準品的熒光曲線圖得到的標準曲線圖2A是本發明實施例2提供的試劑盒的熒光實時定量PCR反應體系擴增 I. OxlO6-L OxlO3拷貝的ABL標準品的熒光曲線圖2B是由本發明實施例2提供的試劑盒的熒光實時定量PCR反應體系擴增I.OxlO6-L OxlO3拷貝的ABL標準品熒光曲線圖得到的標準曲線圖。
具體實施方式
為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面結合附圖對本發明實施方式作進一步地詳細描述。
實施例I.試劑盒的制備
I、特異性的引物和熒光探針的設計
根據基因序列(ABL基因序列、PML基因序列和RARa基因序列來源于美國國家生物技術信息中心核酸數據庫，其中ABL基因ID分別為25，參考序列號為NM_005157. 4 ；PML 基因ID分別為5371，參考序列號為NG_029036. I ;RARa基因ID分別為5914，參考序列號為 NG_027701. I)分別設計對上述各基因序列特異的引物和熒光探針。
2、按照下列試劑盒的組成配制試劑盒的各組分
本發明試劑盒組成如下
①RNA 提取試劑=Trizol 試劑(Invitrogen 公司，產品貨號15596-026/100ml), 每Iml骨髓組織加入ImlTrizol快速提取急性早幼粒細胞性白血病患者骨髓組織RNA。
②cDNA 第一鏈合成試劑盒(RTPCR) (Fermentas 公司，產品貨號K1622):25mmol/ L MgCl2 4 μ L，IOX 逆轉錄酶緩沖液 2 μ L，IOmmoI/L dNTP2 μ L, RNA 酶抑制劑(RNasin，一種酸性糖蛋白)O. 5 μ L, Oligo (dT) 15 O. 5 μ g, AMV逆轉錄酶I. 5U和無RNase去離子水。
③引物、探針和標準品包括PML-RARa融合基因引物、內部陽性控制序列、內部陽性控制序列引物、內參基因ABL引物以及與引物對應的Taqman熒光探針，具體如下
PML-RARa L融合基因上游引物序列5’-TCTTCCTGCCCAACAGCAA-3’(序列表中序列I);
PML-RARa L 融合基因下游引物序列5’-GCTGGGCACTATCTCTTCAGAAC-3’(序列表中序列2)；
PML-RARa L 融合基因 Taqman 熒光探針FAM5’-CAGCCATGAGACCCA_3’TAMRA (序列表中序列3)；
PML-RARa V 融合基因上游引物序列5’-GGACCTCAGCTCTTGCATCAC-3’(序列表中序列4)；
PML-RARaV 融合基因下游引物序列5’-GCTGGGCACTATCTCTTCAGAAC-3’(序列表中序列5)；
PML-RARa V 融合基因 Taqman 熒光探針FAM5’-AAGCCATTGAGACCCAG_3’TAMRA (序列表中序列6)；
PML-RARa S 融合基因上游引物序列5’-GAAGGTCATCAAGATGGAGTCTGA_3’(序列表中序列7)；
PML-RARa S融合基因下游引物序列5’-TGCTGCTCTGGGTCTCAATG_3’(序列表中序列8)；
PML-RARa S 融合基因 Taqman 熒光探針FAM5’ -AAGGAGGCAAGGTTGG-3’ TAMRA (序列表中序列9)；
內部陽性控制序列為5’ -UCUUCCUGCCGAACAGCUACCACGUGGCCAGUGGCGCCGGGGAGGCA GCGAUUCAGACCCAGAGCAGCACUUGUGAAGAGAUAGUGCCCAGC-3’(序列表中序列 13)；
內部陽性控制序列上游引物序列為5’-TCTTCCTGCCGAACAGCTA-3’(序列表中序列 14)；
內部陽性控制序列下游引物序列為5’-GCTGGGCACTATCTCTTCACAAG-3’(序列表中序列15)；
內部陽性控制序列Taqman 熒光探針TET5’ -CAGCGATTCAGACCCA-3’ TAMRA (序列表中序列16)。
ABL 基因序列為5’ -CAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCT GGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCAT AACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCC AAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCACGCCAGTCAACAGTCTGGAGAAACACTCCTGGTACCATGGGCCTGTGTCC6CGCAATGCCGCTGAGTATCTGCTGAGCAGCGGGATCAATGGCAGCTTCTTGGTGCGTGAGAGTGAGAGCAGTCCTGG C-3’(序列表中序列17)；
ABL基因上游引物序列為5’-CCGGGTCTTAGGCTATAATCACA-3’(序列表中序列10);
ABL基因下游引物序列為5’ -GCCTTGGCCATTTTTGGTT-3’(序列表中序列11)；
ABL 基因 Taqman 熒光探針FAM5’ -TGGTGTGAAGCCC-3’ TAMRA (序列表中序列 12);
其中，內部陽性控制序列為人工合成序列，包含一部分已知的PML-RARa融合基因序列和一部分人工合成序列；內部陽性控制序列和ABL基因序列分別用作標準品。
上述引物序列、控制序列、基因序列和Taqman熒光探針序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
④陰性對照和陽性對照以去離子水為陰性對照，以含有PML-RARa融合基因總RNA樣品為陽性對照，采用上述實施例I中提供的本發明試劑盒組成①RNA提取試劑 Trizol試劑(Invitrogen公司，產品貨號15596-026/100ml),按每Iml骨髓組織加入Iml Trizol試劑的比例，快速提取已經確診的含有PML-RARa融合基因的急性早幼粒細胞性白血病患者的骨髓組織RNA，作為陽性對照。
⑤PML-RARa L融合基因熒光定量PCR反應液由熒光定量PCR混合液和檢測MPL 基因W515L位點突變特異性的引物、探針組成1X的PCR預混合液(Qiagen公司，產品貨號210212，2XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、 O. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶、O. 25pmol/μ L 的 PML-RARa L 融合基因上游引物(序列表中序列1)、0. 25pmol/yL的PML-RARa L融合基因下游引物(序列表中序列2)、0· 3pmol/ μ L的PML-RARa L融合基因Taqman突光探針(序列表中序列3)、0· 25pmol/ μ L的內部陽性控制序列上游引物(序列表中序列14)、0. 25pmol/yL的內部陽性控制序列下游引物(序列表中序列15)、0. 3pmol/yL的內部陽性控制序列Taqman熒光探針(序列表中序列16)(以上所有的濃度都是指PCR反應體系的終濃度)。通常取1-2 μ L的模板(包括被測樣品RNA反轉錄合成的cDNA和內部陽性控制序列RNA反轉錄合成的cDNA)，其余為無 RNase去離子水,反應總體積通常為20 μ L。
⑥PML-RARa V融合基因熒光定量PCR反應液由熒光定量PCR混合液和檢測MPL 基因W515L位點突變特異性的引物、探針組成1Χ的PCR預混合液(Qiagen公司，產品貨號210212，2XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、O.2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶、O. 25pmol/μ L 的 PML-RARa V 融合基因上游引物(序列表中序列4)、0. 25pmol/yL的PML-RARaV融合基因下游引物(序列表中序列 5)、0· 3pmol/ μ L的PML-RARa V融合基因Taqman突光探針(序列表中序列6)、0· 25pmol/ μ L的內部陽性控制序列上游引物(序列表中序列14)、0. 25pmol/yL的內部陽性控制序列下游引物(序列表中序列15)、0. 3pmol/yL的內部陽性控制序列Taqman熒光探針(序列表中序列16)、0. 3pmol/yL的內部陽性控制序列Taqman熒光探針(序列表中序列13)(以上所有的濃度都是指PCR反應體系的終濃度)。通常取1-2 μ L的模板(包括被測樣品RNA反轉錄合成的cDNA和內部陽性控制序列RNA反轉錄合成的cDNA),其余為無RNase去離子水， 反應總體積通常為20 μ L0
⑦PML-RARa S融合基因熒光定量PCR反應液由熒光定量PCR混合液和檢測MPL 基因W515L位點突變特異性的引物、探針組成1Χ的PCR預混合液(Qiagen公司，產品貨CN 102925558 A書明說6/11 頁號210212，2XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、 O. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶、O. 25pmol/μ L 的 PML-RARa S 融合基因上游引物(序列表中序列7)、0. 25pmol/yL的PML-RARa S融合基因下游引物(序列表中序列 8)、0· 3pmol/ μ L的PML-RARa S融合基因Taqman突光探針(序列表中序列9)、0· 25pmol/ μ L的內部陽性控制序列上游引物(序列表中序列14)、0. 25pmol/yL的內部陽性控制序列下游引物(序列表中序列15)、0. 3pmol/yL的內部陽性控制序列Taqman熒光探針(序列表中序列16)(以上所有的濃度都是指PCR反應體系的終濃度)。通常取1-2 μ L的模板(包括被測樣品RNA反轉錄合成的cDNA和內部陽性控制序列RNA反轉錄合成的cDNA)，其余為無 RNase去離子水,反應總體積通常為20 μ L。
⑧ABL內參基因熒光定量PCR反應液由熒光定量PCR混合液和檢測ABL內參基因的引物、探針組成=IX的PCR預混合液(Qiagen公司，產品貨號210212，2XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/μ L 的 Taq 酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶、O. 25pmol/y L的ABL內參基因上游引物(序列表中序列 10 )、0· 25pmol/ μ L的ABL內參基因下游引物(序列表中序列11 )、0· 3pmol/ μ L的ABL基因 Taqman熒光探針(序列表中序列12)(以上所有的濃度都是指PCR反應體系的終濃度)。檢測時，加入ABL基因標準品模板2 μ L,反應總體積通常為20 μ L。·
⑨內部陽性控制序列熒光定量PCR反應液由熒光定量PCR混合液和檢測內部陽性控制序列的引物、探針組成I X的PCR預混合液(Qiagen公司，產品貨號210212，2XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/μ L 的Taq酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶、O. 25pmol/yL的內部陽性控制序列上游引物(序列表中序列11)、0. 25pmol/yL的內部陽性控制序列下游引物(序列表中序列12)、0. 3pmol/ μ L的內部陽性控制序列Taqman熒光探針(序列表中序列13)(以上所有的濃度都是指PCR 反應體系的終濃度)。檢測時，通常取1-2 μ L的模板(內部陽性控制序列RNA反轉錄合成的 cDNA),其余為無RNase去離子水,反應總體積通常為20 μ L。
3、PCR擴增程序的設定在Iightcycler儀器上先經過50°C 10s, 95°C IOmin,然后再經過95°C 15s，60°C lmin，共40個循環。
實施例2.用實施例I制備的試劑盒檢測PML-RARa融合基因mRNA的表達量
以檢測30例急性早幼粒細胞性白血病骨髓組織標本結果為例，其中，患者檢測出 PML-RARa融合基因形式包括PML-RARa L融合基因、PML-RARa V融合基因和PML-RARa S融合基因。用本發明的試劑盒檢測PML-RARa融合基因mRNA表達量的檢測流程為首先根據基因序列設計特異性的引物和熒光探針。其次獲取臨床急性早幼粒細胞性白血病患者骨髓組織樣本，快速提取組織RNA，進行逆轉錄PCR合成cDNA第一鏈；先配制ABL內參基因和內部陽性控制序列的熒光定量PCR反應液，將內部陽性控制序列標準品和ABL標準品分別稀釋至拷貝數/mL為I. OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和I. OxlO6，分別制作內部陽性控制序列標準品標準曲線(如圖IA和圖IB所不)和ABL標準品標準曲線(如圖2A和圖2B所不)，然后再配制PML-RARa融合基因PCR反應液進行熒光定量PCR檢測樣品，在熒光定量PCR儀數據分析系統中讀出CT值結果。PCR擴增結束后，首先分析內部陽性控制序列擴增結果，如果其 Ct值小于33，提示整個檢測過程有效，如果其Ct值大于35，提示檢測失敗，則需要重新進行檢測，如果其Ct值位于33 35之間，需要重復檢測。當內部陽性控制序列Ct值小于33時，8將實時熒光定量PCR所得數據進行計算，分別計算PML-RARa融合基因及ABL基因的Ct值， 兩者之差即為ACt值。最后，熒光定量PCR結果采用軟件分析，并標化計算樣本數據。
具體步驟如下
①急性早幼粒細胞性白血病患者骨髓組織總RNA的抽提按RNA抽提純化的方法抽提急性早幼粒細胞性白血病患者骨髓組織總RNA。提取的RNA經瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，通過紫外分光光度計測定260nm與280nm光密度值計算RNA的純度與濃度，用0.1% DEPC處理的水調節抽提的RNA至相同濃度。
②反轉錄合成cDNA :取2 μ L上述RNA提取液，在70°C保溫lOmin，隨后加入實施例I提供的本發明試劑盒組成②cDNA第一鏈合成試劑盒，即25mmol/L MgCl2 4 μ L，IOX 逆轉錄酶緩沖液 2 μ L，IOmmoI/L dNTPs2 μ L，RNA 酶抑制劑 O. 5 μ L, Oligo (dT) 15 O. 5 μ g 和 AMV逆轉錄酶I. 5U,補加無RNase去離子水至總體積20 μ L,于42°C保溫15min,進行逆轉錄反應，合成cDNA第一鏈。反應結束后，加熱至99°C，5min以滅活逆轉錄酶，加20 μ L無菌水混勻置冰箱_20°C保存。
取I μ L濃度為2 μ g/ml內部陽性控制序列RNA (序列表中序列13)，在70°C保溫 IOmin隨后加入實施例I提供的本發明試劑盒組成②cDNA第一鏈合成試劑盒，即25mmol/ L MgCl24y L，IOX 逆轉錄酶緩沖液 2μ L，10mmol/L dNTPs2 μ L，RNA 酶抑制劑 O. 5 μ L， Oligo (dT) 15 O. 5 μ g和AMV逆轉錄酶I. 5U，補加無RNase去離子水至總體積20 μ L，于42°C 保溫15min,進行逆轉錄反應,合成cDNA。反應結束后,加熱至99°C, 5min以滅活逆轉錄酶， 加20 μ L無菌水混勻置冰箱_20°C保存。
取I μ L濃度為2 μ g/ml的陽性對照RNA，在70°C保溫lOmin，隨后加入實施例I 提供的本發明試劑盒組成②cDNA第一鏈合成試劑盒，即25mmol/L MgCl2 4yL,10X逆轉錄酶緩沖液 2 μ L，IOmmoI/L dNTPs2 μ L, RNA 酶抑制劑 O. 5 μ L，Oligo (dT) 15 O. 5 μ g 和 AMV 逆轉錄酶I. 5U,補加無RNase去離子水至總體積20 μ L,于42°C保溫15min,進行逆轉錄反應，合成cDNA。反應結束后，加熱至99°C，5min以滅活逆轉錄酶，加20 μ L無菌水混勻置冰箱-20°C保存。
③將內部陽性控制基因序列標準品和ABL標準品分別稀釋至拷貝數/mL為1.OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和l.OxlO6，用實施例I提供的內部陽性控制序列和ABL內參基因的熒光定量PCR反應液，分別制作內部陽性控制序列標準品標準曲線(如圖IA和圖IB所示)和ABL標準品標準曲線(如圖2A和圖2B所示)。
④PML-RARa融合基因熒光定量PCR擴增PCR反應體系為20 μ L :1 XPCR預混合液(Qiagen公司，產品貨號210212, 2XPCR Premix)10. O μ L, 2. 5-4. OmM的Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，PML-RARa L融合基因、PML-RARa V融合基因及PML-RARa S融合基因上、下游引物終濃度各0. 2 μ mol/ L，加入相應的PML-RARa L融合基因、PML-RARa V融合基因及PML-RARa S融合基因各 Taqman熒光探針終濃度0. 3ymol/L，cDNAl. O μ L，同時加入內部陽性控制序列上、下游引物終濃度各0. 2 μ mo I/L和內部陽性控制序列Taqman熒光探針終濃度0. 3 μ mol/L,終濃度為0. 2 μ mol/L的內部陽性控制序列RNA反轉錄合成的cDNA (②中反轉錄合成的cDNA)，加入超純水至總體積20 μ L。在Iightcycler熒光定量PCR儀上反應擴增條件為95°C IOmin 預變性，然后95°C 15s,60°C Imin擴增40個循環，擴增過程中儀器自動收集熒光信號。
⑤ABL內參基因熒光定量PCR擴增PCR反應體系為20 μ L :含2XPCR混合液 (Qiagen公司，產品貨號210212, 2XPCR Premix)10. O μ L, 2. 5-4. OmM的Mg2+、0. 2-0. 4mM的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，ABL 基因引物終濃度0.2 4 11101/1，探針終濃度0.2 4 11101/1，481^基因cDNAl. O μ L，加入無RNase去離子水補至總體積20 μ L。在Iightcycler熒光定量PCR儀上反應擴增條件為95°C IOmin預變性，然后95°C 15s,60°C Imin擴增40個循環，擴增過程中儀器自動收集熒光信號。
⑥陽性對照、陰性對照熒光定量PCR擴增PCR反應體系為20 μ L :含2XPCR混合液(Qiagen公司，產品貨號210212, 2XPCR Premix)10. O μ L, 2. 5-4. OmM的Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，PML-RARa 融合基因引物終濃度O. 2 μ mol/L,探針終濃度O. 3 μ mol/L,陽性對照RNA反轉錄合成的 cDNAl. 0μ L或者陰性對照去離子水I. 0μ L，加入無RNase去離子水補至總體積20 μ L。 在Iightcycler熒光定量PCR儀上反應擴增條件為95°C IOmin預變性，然后95°C 15s, 60°C Imin擴增40個循環，擴增過程中儀器自動收集熒光信號。
⑦數據收集處理和分析PCR擴增結束后，首先分析內部陽性控制序列擴增結果， 如果其Ct值小于33，提示整個檢測過程有效，如果其Ct值大于35，則需要重新進行檢測。當內部陽性控制序列Ct值小于33時，將實時熒光定量PCR所得數據進行計算，得出 PML-RARa融合基因(PML-RARa L融合基因、PML-RARa V融合基因或PML-RARa S融合基因) 相對于ABL內參基因的相對表達量后再進行統計分析，以比值大于或等于O. 0001為陽性表達，小于O. 0001為陰性表達(具體參見表I)
表I為熒光定量PCR分析PML-RARa融合基因在急性早幼粒細胞性白血病中的表達
權利要求
1.一種檢測PML-RARa融合基因mRNA表達量的試劑盒，包括檢測用引物、熒光探針、 cDNA第一鏈合成試劑、熒光定量PCR混合液、陰性對照和陽性對照，其特征在于，所述檢測用引物、熒光探針包括PML-RARaL融合基因引物、PML-RARa V融合基因引物和PML-RARa S 融合基因引物中的至少一種和內參基因ABL引物及Taqman熒光探針，其中PML-RARa L融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: I所示；PML-RARa L融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:2所示；PML-RARa L融合基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO:3所示；PML-RARa V融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所示；PML-RARa V融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:5所示；PML-RARa V融合基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO:6所示；PML-RARa S融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 7所示；PML-RARa S融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:8所示；PML-RARa S融合基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO:9所示；ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 10所不；ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 11所不；ABL基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO: 12所示；所述cDNA第一鏈合成試劑含有MgCl2、逆轉錄酶緩沖液、dNTPs、RNA酶抑制劑、 Oligo (dT) 15、AMV逆轉錄酶和無RNase去離子水；所述熒光定量PCR混合液含有PCR預混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和無 RNase 去離子水。
2.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括內部陽性控制序列、 內部陽性控制序列的引物和Taqman熒光探針，其中內部陽性控制序列如序列表中SEQ ID NO: 13所示；內部陽性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID NO: 14所示；內部陽性控制序列的下游引物如序列表中SEQ ID NO: 15所示；內部陽性控制序列Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO: 16所示。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述PML-RARaL融合基因Taqman熒光探針、PML-RARa V融合基因Taqman熒光探針、PML-RARa S融合基因Taqman熒光探針和 ABL基因的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團FAM，3’端均連接有熒光淬滅基團 TAMRA ;所述內部陽性控制序列的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團TET，3’端連接有熒光淬滅基團TAMRA。
4.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述內參基因ABL的核酸序列如序列表中 SEQ ID NO: 17 所示。
5.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述陰性對照為去離子水；所述陽性對照為含有PML-RARa L融合基因、PML-RARa V融合基因和PML-RARa S融合基因的總RNA樣品。
6.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述cDNA第一鏈合成試劑為25mmol/ L MgCl2 4μ L，IOX 逆轉錄酶緩沖液 2μ L，10mmol/L dNTP2 μ L，RNA 酶抑制劑 O. 5 μ L， Oligo (dT) 15 O. 5 μ g, AMV逆轉錄酶I. 5U和無RNase去離子水，總體積IluL0
7.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光定量PCR的混合液為1X的 PCR 預混合液、2. 5-4. OmM 的 Mg2+、。· 2-0. 4mM 的 dNTPs,O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶、O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶和無RNase去離子水。
全文摘要
本發明涉及一種檢測PML-RARa融合基因mRNA表達量的試劑盒，屬于生物技術領域，所述試劑盒包括PML-RARa L融合基因體系、PML-RARa V融合基因體系和PML-RARa S融合基因體系中的至少一種體系以及內參基因ABL體系，所述體系均包括上游引物、下游引物和Taqman熒光探針。PML-RARa融合蛋白作為一種變異的維甲酸受體，相較于野生型RARa蛋白具有不同的DNA特性，是RA信號的抑制物，通過不同的途徑成為內在而有效的RARa靶基因轉錄因子抑制物。因此，采用敏感性及特異性均較高的熒光定量PCR檢測PML-RARa融合基因mRNA水平，其檢測結果的特異性和敏感度均顯著提高，為預測急性早幼粒細胞性白血病的預后以及化療方案的確定提供了一種全新的快速簡便的基因診斷技術。
文檔編號C12Q1/68GK102925558SQ20121037470
公開日2013年2月13日 申請日期2012年9月29日 優先權日2012年9月29日
發明者童永清, 李艷 申請人:童永清, 李艷