專利名稱：一種檢測AML1-ETO融合基因mRNA表達量的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域的熒光定量PCR技術，具體涉及一種檢測AMLl-ETO融合基因mRNA表達量的試劑盒。
背景技術：
急性髓系白血病常見于60歲以下的病人，也可見于大約8%兒童和青少年，通常主要表現為多能干細胞或者已輕度分化的前體細胞核型發生突變。t(8;21)(q22;q22)易位是急性髓系白血病最常見的一種染色體異常，主要見于急性粒細胞白血病部分分化型 (AML-M2)，亦可發生于急性粒細胞白血病未分化型(AML-Ml)、急性粒-單核細胞白血病 (AML-M4)及骨髓增生異常綜合征(MDS)-RAEB-T中。其主要特征表現為位于21號染色體 q22 的 AMLl 基因(acute myeloblastic leukemia one gene)與 8 號染色體 q22 的 ETO 基因(eight twenty one gene,也稱為MTG8基因)發生融合,從而生成AML1-ET0融合基因。 AMLl-ETO融合基因一方面阻止CBF結合區域的反式激活，從而抑制AMLl的功能；另一方面 ETO與核抑制子異常結合，形成具有組蛋白脫乙酰基酶活性的復合物，進而抑制目標基因的表達，導致髓系前體細胞分化停滯，增殖異常。
AMLl-ETO融合基因陽性是預后好的標志，其完全緩解率可達90%，5年長期無病生存率可達50%_70%，因此，t(8 ；21) (q22 ；q22)的存在是白血病預后良好的標志，美國國立綜合癌癥網絡急性髓系白血病診療指南明確指出急性髓系白血病需要進行骨髓或者外周血中AMLl-ETO融合基因的檢測，并定期進行監測。大部分病人經化療或BMT后可在短期內轉為陰性，但仍有轉陽性的可能，及時治療可再次轉陰性。在老年AML患者中，t(8;21)易位伴隨正常核型被認為其預后屬于中等；而在AML伴隨t (8; 21)易位的高齡患者中異常細胞核型的檢測率不到2%，且此類患者完全緩解率可高達87%，但是5年內復發率也可高達84%。 t(8;21)對不同年齡患者的預后存在差別。
AMLl-ETO融合基因mRNA表達的AML患者通過前期誘導加上緩解后的繼續治療能夠達到較高的完全緩解率和較長的生存率。因此，AMLl-ETO融合基因表達的檢測適應了急性髓系白血病的診斷需要，對其預后的預測具有指導意義。而熒光定量PCR檢測AMLl-ETO 融合基因的mRNA水平比應用免疫組化定量檢測AMLl-ETO融合蛋白含量其敏感性及特異性均較高。但實時熒光定量PCR (Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈式反應)技術與免疫組化法相比有更強的特異性、更高的靈敏度而且檢測快速、降低了污染，但目前尚未有用實時熒光定量PCR方法檢測急性髓性白血病中AML1-ET0融合基因的相關報道。發明內容
為解決上述技術問題，本發明提供了一種實時熒光定量RT-PCR方法檢測 AML1-ET0融合基因mRNA表達量的試劑盒。
本發明所提供的檢測AML1-ET0融合基因mRNA表達量的試劑盒，包括檢測用引物、 熒光探針、cDNA第一鏈合成試劑、熒光定量PCR混合液、陰性對照和陽性對照，所述檢測用引物、熒光探針包括AMLl-ETO融合基因引物、內參基因ABL引物及Taqman熒光探針，其中AMLl-ETO融合基因上游引物如序列表中SEQ ID NO: I所示；AMLl-ETO融合基因下游引物如序列表中SEQ ID NO:2所示；AMLl-ETO融合基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO:3所示；ABL基因上游引物如序列表中SEQ ID N0:4所示；ABL基因下游引物如序列表中SEQ ID NO: 5所示；ABL基因Taqman突光探針如序列表中SEQ ID NO:6所示；所述cDNA第一鏈合成試劑含有MgCl2、逆轉錄酶緩沖液、dNTPs、RNA酶抑制劑、Oligo (dT) 15、AMV逆轉錄酶和無RNase去離子水；所述熒光定量PCR混合液含有PCR預混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和無 RNase 去離子水。進一步地，所述試劑盒還包括內部陽性控制序列和內部陽性控制序列的引物和Taqman熒光探針，其中內部陽性控制序列如序列表中SEQ ID NO:7所示；內部陽性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID N0:8所示；內部陽性控制序列的下游引物如序列表中SEQID NO:9所示；內部陽性控制序列的Taqman突光探針如序列表中SEQ ID NO: 10所示。進一步地，所述AMLl-ETO融合基因的Taqman熒光探針和ABL基因的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團FAM，3’端均連接有熒光淬滅基團TAMRA ;所述內部陽性控制序列的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團TET，3’端連接有熒光淬滅基團TAMRA0具體地，所述內參基因ABL的核酸序列如序列表中SEQ ID NO: 11所示。具體地，所述陰性對照為去離子水；所述陽性對照為含有AMLl-ETO融合基因的總RNA樣品。具體地，所述cDNA第一鏈合成試劑為25mmol/L MgCl24yL, IOX逆轉錄酶緩沖液2 μ L，IOmmoI/L dNTPs 2 μ L, RNA 酶抑制劑(RNasin) O. 5 μ L, Oligo (dT) 150· 5 μ g, AMV 逆轉錄酶I. 5U和無RNase去離子水,總體積11 μ L。具體地，所述熒光定量PCR的混合液(以反應體系終濃度表示)為1Χ的PCR預混合液(原液為 2 XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、。· 2-0. 4mM 的 dNTPs,O. 3-0. 6mM 的 dUTP、
O.2U/ μ L的Taq酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶以及無RNase去離子水。本發明試劑盒的優點和效果如下(I)敏感度高可重復敏感度為O. 01%，即10000個細胞中有一個含AMLl-ETO融合基因就可以被檢測出。(2)特異性強使用特異性探針對定量分子進行識別，準確性高。同時，靶序列由弓I物和探針雙重控制，特異性好、假陽性低。(3)簡便安全操作簡單、安全、自動化程度高而且防止污染。擴增和檢測可以在同一管內檢測，不需要開蓋，不易被污染；同時擴增和檢測一步完成，不需要后期處理，無需要擔心放射性污染。(4)全程監控本發明實施例提供的試劑盒引入了內部陽性控制質量控制體系，對檢測過程進行全程質量監控，有效避免假陽性或者假陰性。(5)快速速度快、高通量，可在3-4小時完成。本發明的試劑盒能快速、準確、定量檢測AMLl-ETO融合基因mRNA水平，有效杜絕了假陽性和假陰性的發生，用于急性髓性白血病的診斷及治療過程中微小殘留病的監測，為急性髓性白血病的診斷、制定治療方案及療效評價和預后提供了重要的檢測手段。


為了更清楚地說明本發明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。圖IA是本發明實施例2提供的試劑盒的熒光實時定量PCR反應體系擴增I. OxlO6-L OxlO3拷貝的內部陽性控制序列標準品的熒光曲線圖；圖IB是由本發明實施例2提供的試劑盒的熒光實時定量PCR反應體系擴增I. OxlO6-L OxlO3拷貝的內部陽性控制序列標準品的熒光曲線圖得到的標準曲線圖；圖2A是本發明實施例2提供的試劑盒的熒光實時定量PCR反應體系擴增I. OxlO6-L OxlO3拷貝的ABL標準品的熒光曲線圖；圖2B是由本發明實施例2提供的試劑盒的熒光實時定量PCR反應體系擴增
I.OxlO6-L OxlO3拷貝的ABL標準品熒光曲線圖得到的標準曲線圖。
具體實施例方式為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面結合附圖對本發明實施方式作進一步地詳細描述。實施例I.本發明試劑盒的制備I、特異性的引物和熒光探針的設計根據基因序列(ABL基因序列、AMLl基因序列和ETO基因序列來源于美國國家生物技術信息中心核酸數據庫，其中ABL基因ID為25，核酸參考序列號為NM_005157.4 ;AML1基因ID為861，核酸參考序列號為NM_001001890. 2 ;ΕΤ0基因ID為862，核酸參考序列號為NM_001198625. I)分別設計對上述各基因序列特異的引物和熒光探針。2、按照下列試劑盒的組成配制試劑盒的各組分本發明試劑盒組成如下①RNA 提取試劑=Trizol 試劑(Invitrogen 公司，產品貨號15596-026/100ml),每Iml骨髓組織加入Iml Trizol試劑快速提取急性髓系白血病患者骨髓組織RNA。②cDNA 第一鏈合成試劑盒(RT-PCR)(Fermentas 公司，產品貨號K1622):25mmol/LMgCl24 μ L，IOX 逆轉錄酶緩沖液 2 μ L，IOmmoI/L dNTPs 2 μ L, RNA 酶抑制劑(RNasin，一種酸性糖蛋白)O. 5 μ L, Oligo (dT) 150. 5 μ g, AMV逆轉錄酶I. 5U和無RNase去離子水,總體積 11 μ L0③引物、探針和標準品包括AMLl-ETO融合基因引物、內部陽性控制序列引物、內參基因ABL引物以及與引物對應的Taqman熒光探針，具體如下AMLl-ETO融合基因上游引物為5’ -GCCCCGAGAACCTCGAAA-3’(序列表中序列I);AMLl-ETO融合基因下游引物為5’ -TCCACAGGTGAGTCTGGCATT-3’(序列表中序列2)；
AMLl-ETO 融合基因 Taqman 熒光探針FAM 5’ -CGTACTGAGAAGCACTC-3’ TAMRA (序列表中序列3)；內部陽性控制序列為5’ -UGCUGAGCGUGCGACCGCUCUCGUACUGAGCUGCACUCCACGUCCAGCUGUCACUGAGCCG-3，(序列表中序列 7)；內部陽性控制序列上游引物為5’-TGCTGAGCGTGCGACCGCTC-3’(序列表中序列8);內部陽性控制序列下游引物為5’ -CGGCTCAGTGACAGGAC-3’(序列表中序列9)；內部陽性控制序列Taqman 熒光探針為TET 5’-CGTACTGAGCTGCACTC-3’TAMRA (序列表中序列10)。ABL 基因序列為5，-CAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCACGCCAGTCAACAGTCTGGAGAAACACTCCTGGTACCATGGGCCTGTGTCCCGCAATGCCGCTGAGTATCTGCTGAGCAGCGGGATCAATGGCAGCTTCTTGGTGCGTGAGAGTGAGAGCAGTCCTGGC-3’(序列表中序列11);ABL 基因上游引物為5’ -CCGGGTCTTAGGCTATAATCACA-3’(序列表中序列 4)；ABL基因下游引物為5’ -GCCTTGGCCATTTTTGGTT-3’(序列表中序列5)；ABL 基因 Taqman 熒光探針FAM 5’ -TGGTGTGAAGCCC-3’ TAMRA (序列表中序列 6);其中，內部陽性控制序列為人工合成序列，包含一部分已知的AMLl-ETO融合基因序列和一部分人工合成序列；內部陽性控制序列和ABL基因序列分別用作標準品。上述引物序列、控制序列、基因序列和探針序列均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。④陰性對照和陽性對照以去離子水為陰性對照，以含有AMLl-ETO融合基因的總RNA樣品為陽性對照，采用上述實施例I中提供的本發明試劑盒組成①RNA提取試劑Trizol試劑(Invitrogen公司，產品貨號15596-026/100ml),按每Iml骨髓組織加入ImlTrizol試劑的比例，快速提取已經確診的含有AMLl-ETO融合基因的急性髓系白血病患者的骨髓組織RNA，作為陽性對照。⑤AMLl-ETO融合基因熒光定量PCR反應液由熒光定量PCR混合液和檢測AMLl-ETO融合基因的引物、探針組成1X的PCR預混合液(Qiagen公司，產品貨號210212，2XPCRPremix)、2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、O. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶、O. 25pmol/μ L 的 AMLl-ETO 融合基因上游引物(序列表中序列1)、0· 25pmol/yL的AMLl-ETO融合基因下游引物(序列表中序列2)、O. 3pmol/ μ L的AMLl-ETO融合基因Taqman突光探針(序列表中序列3)、0· 25pmol/ μ L的內部陽性控制序列上游引物(序列表中序列8)、0. 25pmol/yL的內部陽性控制序列下游引物(序列表中序列9)、0. 3pmol/yL的內部陽性控制序列Taqman熒光探針(序列表中序列10)(以上所有的濃度都是指PCR反應體系的終濃度)。通常取1-2 μ L的模板(包括被測樣品RNA反轉錄合成的cDNA和內部陽性控制序列RNA反轉錄合成的cDNA),其余為無RNase去離子水，反應總體積通常為20 μ L。⑥ABL內參基因熒光定量PCR反應液由熒光定量PCR混合液和檢測ABL內參基因的引物、探針組成=IX的PCR預混合液(Qiagen公司，產品貨號210212, 2XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/μ L 的 Taq 酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶、O. 25pmol/μ L的ABL基因上游引物(序列表中序列4)、O. 25pmol/ μ L的ABL基因下游引物(序列表中序列5)、0· 3pmol/ μ L的ABL基因Taqman突光探針(序列表中序列6)(以上所有的濃度都是指PCR反應體系的終濃度)。檢測時，加入ABL基因標準品模板2 μ L,其余為無RNase去離子水,反應總體積通常為20 μ L。⑦內部陽性控制序列熒光定量PCR反應液由熒光定量PCR混合液和檢測內部陽性控制序列的引物、探針組成ix的PCR預混合液(Qiagen公司，產品貨號=210212,
2XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的Taq酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶、O. 25pmol/yL的內部陽性控制序列上游引物(序列表中序列8),0. 25pmol/yL的內部陽性控制序列下游引物(序列表中序列9),0. 3pmol/yL的內部陽性控制序列Taqman熒光探針(序列表中序列10)(以上所有的濃度都是指PCR反應體系的終濃度)。檢測時，通常取1-2 μ L的模板(內部陽性控制序列RNA反轉錄合成的cDNA)，其余為無RNase去離子水,反應總體積通常為20 μ L。3、PCR擴增程序的設定在Iightcycler儀器上先經過50°C 10s, 95°C IOmin,然后再經過95°C 15s，60°C lmin，共40個循環。實施例2.用實施例I制備的試劑盒檢測AMLl-ETO mRNA的表達量以檢測30例急性髓系白血病骨髓組織標本結果為例。用實施例I提供的本發明的試劑盒檢測AMLl-ETO融合基因mRNA表達量的檢測流程為首先獲取臨床急性髓系白血病患者骨髓組織樣本，快速提取組織RNA，進行逆轉錄PCR合成cDNA第一鏈；先配制ABL內參基因和內部陽性控制序列的熒光定量PCR反應液，將內部陽性控制序列標準品和ABL標準品分別稀釋至拷貝數/mL為I. OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和I. OxlO6，分別制作內部陽性控制序列標準品的標準曲線(如圖IA和圖IB所示)和ABL標準品的標準曲線(如圖2A和圖2B所示)，然后再配制AMLl-ETO融合基因熒光定量PCR反應液，進行熒光定量PCR檢測樣品，在熒光定量PCR儀數據分析系統中讀出CT值結果。PCR擴增結束后，首先分析內部陽性控制序列擴增結果，如果其Ct值小于33，提示整個檢測過程有效，如果其Ct值大于35，提示檢測失敗，則需要重新進行檢測，如果其Ct值位于33 35之間，需要重復檢測。當內部陽性控制序列Ct值小于33時，將實時熒光定量PCR所得數據進行計算，分別計算AMLl-ETO融合基因及ABL基因的Ct值，兩者之差即為ACt值。最后，熒光定量PCR結果采用軟件分析，并標化計算樣本數據。具體步驟如下①急性髓系白血病骨髓組織總RNA的抽提按RNA抽提純化的方法抽提急性髓系白血病骨髓組織樣品的總RNA。提取的RNA經瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，通過紫外分光光度計測定260nm與280nm光密度值計算RNA的純度與濃度，用0.1% DEPC處理的水調節抽提的各樣品RNA至相同濃度。②反轉錄合成cDNA :取2111^上述1 應提取液，在701保溫101^11，隨后加入實施例I提供的本發明試劑盒組成②cDNA第一鏈合成試劑盒，即25mmol/L MgCl24 μ L，IOX逆轉錄酶緩沖液 2 μ L，IOmmoI/L dNTPs 2 μ L, RNA 酶抑制劑 O. 5 μ L, Oligo (dT) 150· 5 μ g 和 AMV逆轉錄酶I. 5U,補加無RNase去離子水至總體積20 μ L,于42°C保溫15min,進行逆轉錄反應，合成cDNA第一鏈。反應結束后，加熱至99°C，5min以滅活逆轉錄酶，加20 μ L無菌水混勻置冰箱_20°C保存。取I μ L濃度為2 μ g/ml的內部陽性控制序列RNA (序列表中序列7)，在70°C保溫IOmin,隨后加入實施例I提供的本發明試劑盒組成②cDNA第一鏈合成試劑盒，即25mmol/L MgCl24y L，IOX 逆轉錄酶緩沖液 2μ L，10mmol/L dNTPs 2 μ L，RNA 酶抑制劑 O. 5 μ L，Oligo (dT) 150· 5 μ g和AMV逆轉錄酶I. 5U，補加無RNase去離子水至總體積20 μ L，于42°C保溫15min,進行逆轉錄反應,合成cDNA。反應結束后,加熱至99°C, 5min以滅活逆轉錄酶，加20 μ L無菌水混勻置冰箱_20°C保存。取I μ L濃度為2 μ g/ml的陽性對照RNA，在70°C保溫lOmin，隨后加入實施例I提供的本發明試劑盒組成②cDNA第一鏈合成試劑盒，即25mmol/L MgCl24yL,10X逆轉錄酶緩沖液 2 μ L，IOmmoI/L dNTPs 2 μ L, RNA 酶抑制劑 O. 5 μ L, Oligo (dT) 150· 5 μ g 和 AMV逆轉錄酶I. 5U,補加無RNase去離子水至總體積20 μ L,于42°C保溫15min,進行逆轉錄反應，合成cDNA。反應結束后，加熱至99°C，5min以滅活逆轉錄酶，加20 μ L無菌水混勻置冰箱-20°C保存。③將內部陽性控制基因序列標準品和ABL標準品分別稀釋至拷貝數/mL為I. OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和l.OxlO6，用實施例I提供的內部陽性控制序列和ABL內參基因的熒光定量PCR反應液，分別制作內部陽性控制序列標準品標準曲線(如圖IA和圖IB所示)和ABL標準品標準曲線(如圖2A和圖2B所示)。④AML1-ET0融合基因熒光定量PCR擴增PCR反應體系為20yL:含IXPCR預混合液(Qiagen 公司，產品貨號210212, 2 X PCR Premix) 10. O μ L, 2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG酶，AMLI-ETO融合基因引物終濃度0. 2 μ mo I /L，AMLI-ETO融合基因Taqman熒光探針終濃度0. 3 μ mol/L,被測樣品RNA反轉錄合成的cDNA l.OyL,同時加入終濃度為0. 2 μ mo I/L的內部陽性控制序列的引物、終濃度為0. 3 μ mol/L的內部陽性控制序列的探針和終濃度為0. 2 μ mol/L的內部陽性控制序列RNA反轉錄合成的cDNA (②中反轉錄合成的cDNA)，加入超純水補至總體積20 μ L。在Iightcycler熒光定量PCR儀上反應擴增條件為95°C IOmin預變性，然后95°C 15s,60°C Imin擴增40個循環，擴增過程中儀器自動收集熒光信號。⑤ABL內參基因熒光定量PCR擴增PCR反應體系為20 μ L :含2XPCR混合液(Qiagen公司，產品貨號:210212, 2XPCR Premix)10. O μ L, 2. 5-4. OmM的Mg2+、0. 2-0. 4mM的dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，ABL 基因引物終濃度0. 2 μ mol/L,探針終濃度0. 2 μ mol/L, ABL基因cDNA l.OyL,加入無RNase去離子水補至總體積20 μ L。在Iightcycler熒光定量PCR儀上反應擴增條件為95°C IOmin預變性，然后95°C 15s,60°C Imin擴增40個循環，擴增過程中儀器自動收集熒光信號。⑥陽性對照、陰性對照熒光定量PCR擴增PCR反應體系為20 μ L :含2XPCR混合液(Qiagen公司，產品貨號:210212, 2XPCR Premix)10. O μ L, 2. 5-4. OmM的Mg2+、0. 2-0. 4mM的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，AML 1-ΕΤ0融合基因引物終濃度0. 2 μ mol/L,探針終濃度0. 3 μ mol/L,陽性對照RNA反轉錄合成的cDNAl. 0μ L或者陰性對照去離子水I. O μ L，加入無RNase去離子水補至總體積20 μ L。在Iightcycler熒光定量PCR儀上反應擴增條件為95°C IOmin預變性，然后95°C 15s,60°C Imin擴增40個循環，擴增過程中儀器自動收集熒光信號。
⑦數據收集處理和分析PCR擴增結束后，首先分析內部陽性控制序列擴增結果，如果其Ct值小于33，提示整個檢測過程有效，如果其Ct值大于35，則需要重新進行檢測。當內部陽性控制序列Ct值小于33時，將實時熒光定量PCR所得數據進行計算，得出AMLl-ETO融合基因相對于ABL基因的相對表達量后再進行統計分析，以比值大于或等于
O.0001為陽性表達，小于O. 0001為陰性表達(具體參見表I)表I熒光定量PCR分析融合基因AMLl-ETO在急性髓系白血病中的表達
權利要求
1.一種檢測AMLl-ETO融合基因mRNA表達量的試劑盒，包括檢測用引物、熒光探針、cDNA第一鏈合成試劑、熒光定量PCR混合液、陰性對照和陽性對照，其特征在于，所述檢測用引物、熒光探針包括AMLl-ETO融合基因引物、內參基因ABL引物及Taqman熒光探針，其中 AMLl-ETO融合基因上游引物如序列表中SEQ ID NO: I所示； AMLl-ETO融合基因下游引物如序列表中SEQ ID N0:2所示； AMLl-ETO融合基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO:3所示； ABL基因上游引物如序列表中SEQ ID N0:4所示； ABL基因下游引物如序列表中SEQ ID N0:5所示； ABL基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO:6所示； 所述cDNA第一鏈合成試劑含有MgCl2、逆轉錄酶緩沖液、dNTPs、RNA酶抑制劑、Oligo (dT) 15、AMV逆轉錄酶和無RNase去離子水；所述熒光定量PCR混合液含有PCR預混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和無 RNase 去離子水。
2.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，還包括內部陽性控制序列、內部陽性控制序列的引物和Taqman熒光探針，其中內部陽性控制序列如序列表中SEQ ID N0:7所示；內部陽性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID N0:8所示；內部陽性控制序列的下游引物如序列表中SEQ ID N0:9所示；內部陽性控制序列的Taqman熒光探針如序列表中SEQ IDNO: 10所示。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述AMLl-ETO融合基因的Taqman熒光探針和ABL基因的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團FAM，3’端均連接有熒光淬滅基團TAMRA ;所述內部陽性控制序列的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團TET，3’端連接有熒光淬滅基團TAMRA。
4.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述內參基因ABL的核酸序列如序列表中 SEQ ID NO: 11 所示。
5.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述陰性對照為去離子水；所述陽性對照為含有AMLl-ETO融合基因的總RNA樣品。
6.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述cDNA第一鏈合成試劑為25mmol/LMgCl24y L，IOX 逆轉錄酶緩沖液 2μ 1，10mmol/L dNTPs 2 μ L，RNA 酶抑制劑 O. 5 μ L，Oligo (dT) 150. 5 μ g, AMV逆轉錄酶I. 5U和無RNase去離子水,總體積11 μ L。
7.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光定量PCR的混合液為1X的PCR 預混合液、2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq酶、O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶和無RNase去離子水。
全文摘要
本發明涉及一種檢測AML1-ETO融合基因mRNA表達量的試劑盒，屬于生物技術領域。所述試劑盒包括AML1-ETO融合基因引物、內參基因ABL引物及Taqman熒光探針。AML1-ETO融合基因是急性髓系白血病最常見易位之一，其與CBFβ作用，干擾AML1介導的髓系特異性基因的正常表達。采用敏感性及特異性均較高的熒光定量PCR檢測AML1-ETO融合基因mRNA水平，其檢測結果的特異性和敏感度均顯著提高。本發明試劑盒為預測急性髓系白血病的預后以及化療方案的確定提供了一種全新的快速簡便的基因診斷技術。
文檔編號C12Q1/68GK102925573SQ20121044110
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月8日 優先權日2012年9月29日
發明者李艷, 童永清 申請人:李艷, 童永清