專利名稱：一種篩查alk融合基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥和生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及ALK融合基因的篩查方法，尤其是ALK融合基因篩查的多片段引物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
據(jù)研究報道，對于非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，針對特定的靶點(diǎn)開展個體化治療已成為現(xiàn)實(shí)，例如通過檢測表皮生長因子受體(EGFR)基因突變，篩選適合EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)治療的患者亞群。據(jù)美國麻省總醫(yī)院研究人員發(fā)表研究論文稱，檢測一種間變淋巴瘤激酶(ALK)融合基因如(EML4-ALK)，可對NSCLC患者作進(jìn)一步細(xì)分。ALK融合基因于2007年開始見諸NSCLC相關(guān)研究報告。在此之前，研究者已經(jīng)在多種腫瘤中識別了涉及ALK的基因變異，例如間變性大細(xì)胞淋巴瘤、炎性成肌纖維細(xì)胞瘤 和成神經(jīng)細(xì)胞瘤等，但不包括肺癌。現(xiàn)有技術(shù)公開了 ALK融合基因迄今已發(fā)現(xiàn)多種變異類型。分析這些融合基因的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，其ALK部分均包括開始于第20外顯子的編碼細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的基因片段。經(jīng)檢測，所有這些融合基因均有生物學(xué)功能，其表達(dá)產(chǎn)物為一種嵌合酪氨酸激酶。傳統(tǒng)上對ALK融合基因的篩查包括兩種主要形式1、普通PCR，通過設(shè)計引物，對某一種具體的融合形式進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳判斷結(jié)果；2、熒光原位雜交(FISH)，通過熒光標(biāo)記的DNA探針特異性地與腫瘤組織DNA中ALK基因5’端和3’端進(jìn)行雜交，結(jié)果在突光顯微鏡下判讀。對于普通PCR篩查方法，實(shí)踐顯示其具有以下明顯缺陷由于ALK融合基因的具體形式眾多，所以至少需要設(shè)計多對PCR引物，分別進(jìn)行多次PCR反應(yīng)，費(fèi)時費(fèi)力；并且如果樣本是一種新的ALK融合形式(具有未知的“伙伴基因”)，則使用此方法則無法有效地進(jìn)行檢測，而出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。對于熒光原位雜交(FISH)，雖然目前被認(rèn)為是診斷融合基因的金標(biāo)準(zhǔn)，但是其價格高昂，實(shí)驗(yàn)步驟復(fù)雜，對操作人員的技術(shù)水平要求極高，致使其亦無法進(jìn)行推廣。因此，目前臨床實(shí)踐中需要提出更加簡單、方便、靈敏的ALK融合基因的篩查工具和篩查方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為克服現(xiàn)有技術(shù)所存在的缺陷與不足，提供一種新的篩查ALK融合基因的方法，尤其涉及ALK融合基因的real-time PCR聯(lián)合引物及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了篩選ALK融合基因的real-time PCR聯(lián)合引物。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供上述real-time PCR聯(lián)合引物在篩查ALK融合基因方法中的應(yīng)用，本發(fā)明方法能準(zhǔn)確、簡捷、經(jīng)濟(jì)、直觀地判斷ALK融合基因存在與否。本發(fā)明的篩查ALK融合基因方法，以樣本中的總RNA反轉(zhuǎn)的cDNA為模板，加入real-time PCR聯(lián)合引物，進(jìn)行實(shí)時熒光聚合酶鏈反應(yīng)，并通過檢測反應(yīng)產(chǎn)物中反應(yīng)單位間Ct值的差值檢驗(yàn)是否具有ALK融合基因。本方法具有操作簡捷，節(jié)約時間，結(jié)果判斷直觀、明確，成本較低，污染減少的特點(diǎn)。具體而言，本發(fā)明提供的一種篩選ALK融合基因的方法，其特征在于，其包括如下步驟(I)設(shè)計篩查ALK融合基因的7對real-time PCR聯(lián)合引物或探針；(2)提取樣本中的總RNA ；(3)以樣本中的總RNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄方法合成cDNA ；(4)在7個real-timePCR反應(yīng)單位中，以(3)中所得的cDNA為模板，分別加入(I)中設(shè)計的7對引物或探針，以及包括熒光染料在內(nèi)的反應(yīng)預(yù)混液；
(5)在real-time PCR反應(yīng)儀上進(jìn)行real-time PCR反應(yīng),并分別記錄每個樣本的7個反應(yīng)單位的熒光閾值(Ct值)；(6)分別計算引物或探針I(yè) IV所在反應(yīng)體系的Ct值的均值Ctiffip，和引物或探針V VII所在反應(yīng)體系的CT值的均值CtBBP ；(7)計算相對表達(dá)量值2_'CT，其中-ACT = -(Ct^p-CtBBp);如2_'CT大于12，則認(rèn)為該樣本具有ALK融合基因。本發(fā)明中，篩選ALK融合基因的real-time PCR聯(lián)合引物或探針由7對上游引物、下游引物組成，所述7對引物其核苷酸編碼序列如SEQ ID NO 1-14所示，其中第I對SEQID NO 1-2，第 II 對 SEQ ID N03-4，第 III 對 SEQ ID N05-6，第 IV 對 SEQ ID N07-8，第 V 對SEQ ID N09-10，第 VI 對 SEQ ID N011-12，第 VII 對 SEQ ID N013-14。上述引物和探針可以從特定組織中克隆，也可以用化學(xué)合成的方法人工合成。本發(fā)明中，real-time PCR即實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)。聚合酶鏈反應(yīng)簡稱為PCR,其基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程。PCR由變性一退火一延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成①模板DNA的變性模板DNA經(jīng)加熱使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降低，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；③引物的延伸=DNA模板一引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性一退火一延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板，將待擴(kuò)目的基因不斷擴(kuò)增放大。實(shí)時熒光定量PCR，是在PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。real-time PCR以Ct值為重要的計量單位，反應(yīng)每個反應(yīng)單位內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。本發(fā)明中，反應(yīng)單位指一個real-time PCR反應(yīng)單位,例如384孔板或96孔板的一個孔。反應(yīng)一起可以使用如ABI公司的7900HT Fast、Roche公司的Lightcycler480等。本發(fā)明中，包括突光染料在內(nèi)的反應(yīng)預(yù)混液,可以使用商品化產(chǎn)品如Invitrogen公司的 PowerSYBR Green PCR Master Mix、TaKaRa 公司的SYBR Premix DimerEraser 、BIOTIUM公司的Fast Plus EvaGreen qPCR Master Mix ;也可以使用含有類似熒光染料的具有想盡功能的自制預(yù)混物。本發(fā)明中，未及詳述的操作均參考冷泉港實(shí)驗(yàn)室的《分子克隆》，10-50bp的寡聚核苷酸序列采用人工合成方法，也可以從上海生工公司購買；生物試劑從美國Invitrogen公司或北京天根公司的生物制劑公司購買。本發(fā)明進(jìn)行了非小細(xì)胞肺癌體外樣本的ALK融合基因篩檢并驗(yàn)證，結(jié)果顯示，本發(fā)明方法的準(zhǔn)確性達(dá)到100%，敏感性高于普通PCR方法，特異性與金標(biāo)準(zhǔn)FISH相同，通過本方法檢測的結(jié)果未出現(xiàn)假陽性或假陰性本發(fā)明的篩查ALK融合基因方法，法以樣本中的總RNA反轉(zhuǎn)的cDNA為模板，加入real-time PCR聯(lián)合引物對，進(jìn)行實(shí)時熒光聚合酶鏈反應(yīng)，并通過檢測反應(yīng)產(chǎn)物中反應(yīng)單位間Ct值的差值檢驗(yàn)是否具有ALK融合基因。本方法與現(xiàn)有技術(shù)比較，具有操作簡捷，節(jié)約時間，結(jié)果判斷直觀、明確，成本較低，污染減少的特點(diǎn)。而現(xiàn)有技術(shù)中，需經(jīng)PCR反應(yīng)、瓊脂糖凝膠電泳、紫外燈下觀察目標(biāo)片段情況；或者需要經(jīng)石蠟切片、脫蠟、雜交、封片再通過熒光顯微鏡觀察等繁雜的人工分析等過程才能得到結(jié)果，操作步驟繁多，對人員技術(shù)要求高，需要使用較多的儀器設(shè)備和實(shí)驗(yàn)耗材，成本高，耗時多。而且在操作過程中容易造成實(shí)驗(yàn)室污染。 本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)在于本方法設(shè)計了 real-time PCR聯(lián)合引物，以引物對的聯(lián)合分析進(jìn)行識別，僅通過一次real-time PCR反應(yīng)，即可快捷地完成實(shí)驗(yàn)全過程，并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以快速、直觀的判讀，能夠方便地得到準(zhǔn)確明晰的結(jié)果。本發(fā)明方法既適合于大規(guī)模的體外樣本篩查，又適合于對臨床對可疑具有ALK融合基因腫瘤的初步檢測，因此具有較高的科研和臨床使用價值。為了便于理解，以下將通過具體的實(shí)施例對本發(fā)明的進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，具體實(shí)例僅是為了說明，顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I實(shí)時熒光定量雙標(biāo)記探針PCR法I、提取樣本中的總RNA，并反轉(zhuǎn)為cDNA。2、引物及探針設(shè)計引物對I上游引物TCTGTGCTGGGCATCTTCAAC(SEQID NO I)下游引物CATGCACGCTTCTGTTCACAC(SEQID NO 2)引物對II上游引物TGTGAACAGAAGCGTGCATGA(SEQID NO 3)下游引物TCTCTCTGGGTGGAACGTGT(SEQID NO 4)引物對III上游引物CAGACACGTTCCACCCAGAGA(SEQID NO 5)下游引物GTGGCACCCTCCTGCAAAGAT(SEQID NO 6)引物對IV上游引物CCGAAATGGATGGGGAAGATGG(SEQID NO 7)
下游引物TCAGGGTCCATGTGACATTCGTC(SEQID NO 8)引物對V上游引物TGTGCTCTGAACAGGACGAACT(SEQID NO 9)下游引物TGAGCTCCAGCAGGATGAACC(SEQID NO 10)引物對VI上游引物TGCCTGTGGCTGTCAGTATTTGG(SEQID NO 11)下游引物GGCACAGCCTCCCTTTCTATAGTAG(SEQID NO 12)引物對VII上游引物CCAGAGGCCTTCATGGAAGGA(SEQID NO 13)下游引物GCCTCCACTGGTGACAAACTC(SEQID NO 14)3、反應(yīng)體系(IOul)
權(quán)利要求
1.一種篩查ALK融合基因的方法，其特征在于，其包括如下步驟 (1)設(shè)計篩查ALK融合基因的7對real-timePCR聯(lián)合引物或探針； (2)提取樣本中的總RNA； (3)以樣本中的總RNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄方法合成cDNA； (4)在7個real-timePCR反應(yīng)單位中，以(3)中所得的cDNA為模板，分別加入(I)中設(shè)計的7對引物，以及包括熒光染料在內(nèi)的反應(yīng)預(yù)混液； (5)在real-timePCR反應(yīng)儀上進(jìn)行real-time PCR反應(yīng),并分別記錄每個樣本的7個反應(yīng)單位的熒光閾值Ct值； (6)分別計算引物I IV所在反應(yīng)體系的Ct值的均值CtABP，和引物V VII所在反應(yīng)體系的CT值的均值CtBBP ； (7)計算f，判定樣本中是否具有ALK融合基因。
2.按權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的聯(lián)合引物對或探針的核苷酸編碼序列如SEQ ID NO 1-14所示。
3.按權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的步驟(7)中，結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)為 相對表達(dá)量值 2_Δα，其中- ACT = -(CtABP-CtBBP)； 有ALK融合基因2_Δα彡12 ； 無ALK融合基因2_Δετ < 12。
4.按權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的ALK融合基因是非小細(xì)胞肺癌相關(guān)的ALK融合基因。
5.SEQ ID NO 1-14的real-time PCR聯(lián)合引物對或探針在制備篩查ALK融合基因突變的制劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥和生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及篩查ALK融合基因的方法，尤其是ALK融合基因篩查的多片段引物及其應(yīng)用。本發(fā)明的篩查ALK融合基因的方法，以樣本中的總RNA反轉(zhuǎn)的cDNA為模板，加入加入核苷酸編碼序列如SEQ IDNO 1-14所示的real-time PCR聯(lián)合引物，進(jìn)行實(shí)時熒光聚合酶鏈反應(yīng)，并通過檢測反應(yīng)產(chǎn)物中反應(yīng)單位間Ct值的差值檢驗(yàn)是否具有ALK融合基因。本發(fā)明方法具有操作簡捷，節(jié)約時間，結(jié)果判斷直觀、明確，成本較低，污染減少的特點(diǎn)。
文檔編號C12N15/11GK102888452SQ20121015841
公開日2013年1月23日 申請日期2012年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月18日
發(fā)明者陳海泉, 孫藝華, 王瑞, 潘云建, 胡海川, 李晨光, 王磊, 葉挺, 羅曉陽, 李航, 張揚(yáng) 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院