專利名稱：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)疫苗重組蛋白抗原FnbA1的純化方法
技術領域：
本發明屬于生物技術制藥領域，涉及一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)疫苗重組蛋白抗原FnbAl的純化方法。
背景技術：
耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)局部感染經久不愈，全身感染死亡率高達20%。自1961年被首次發現，目前已成為全球ICU病房、燒傷、戰創傷等感染率最高的病原菌之一。MRSA因其傳播途徑廣泛，易暴發流行，又由于其致病性強，呈多重耐藥而成為臨床上治療的難點及重要的生物戰劑，被稱為“超級細菌”，當前MRSA已與乙型肝炎、AIDS被列為世界三大最難解決的感染性疾病，并位居首位。萬古霉素被認為是治療MRSA的最后一道防線，但2002年以來耐萬古霉素的MRSA相繼被分離出來，使MRSA即將面臨無抗生素可治的嚴峻挑戰。目前，在我國各大醫院，由于抗生素的濫用，MRSA的分離檢出率逐年上升，已由1978年的5%發展到2009年的79%，且菌群的毒力基因改變明顯，并且耐萬古霉素的金葡菌也呈蔓延趨勢。基于這種嚴峻形勢，我國已將MRSA列為21世紀可能對國人衛生健康有重大影響的12種病原微生物之一。2010年“中國MRSA院內感染診治策略新進展”會議資料顯示，我國內地醫院院內感染發生率約為8%，全國每年因醫院感染造成的直接損失超過150億元。因此，加強對MRSA感染的防治研究已迫在眉睫，研制安全、有效的新型MRSA疫苗將對有效控制MRSA耐藥性蔓延和臨床MRSA廣泛感染具有重大應用價值。美國研發的MRSA疫苗已進入III期臨床試驗，研發具有自主知識產權、高效、安全、經濟的MRSA疫苗對有效控制MRSA耐藥性蔓延和臨床MRSA廣泛感染，提升我國的國際競爭力具有重要意義。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抗原組分復雜，且含量較低，直接從全菌中分離純化出保護性抗原的難度較大，方法繁瑣，不利于疫苗的產業化制備。利用基因工程技術將菌體有效的保護性抗原進行克隆表達使MRSA疫苗研制的可行性大大提高。金黃色葡萄球菌表面的粘附素是一類能夠介導細菌粘附于寄主細胞表面進而引發疾病的膜蛋白，其中纖連蛋白結合蛋白A(FnbA)是重要的粘附素之一，編碼基因具有高度保守性，是MRSA疫苗重要的候選抗原。它能夠介導金黃色葡萄球菌結合于細胞表面的纖連蛋白，使細菌黏附于寄主細胞表面，促進細菌對寄主組織的入侵，目前分離到的大多數金黃色葡萄球菌都能夠與細胞外基質上的纖連蛋白特異性的結合。申請人:采用生物信息學的方法從FnbA中預測出了一段活性片段FnbAl，通過克隆表達并純化后，動物試驗證明可有效刺激機體產生較高的體液免疫應答和良好的免疫保護作用。FnbAl具有序列表I所述的核苷酸序列和序列表2所述的氨基酸序列。

發明內容
本發明旨在針對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌重組蛋白抗原(FnbAl)制備中的抗原蛋白純化，，提供一種工藝簡捷、所獲得目標蛋白純度高、回收率較好的純化工藝和方法。為實現上述目的，本發明采用如下的技術方案。一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌疫苗重組蛋白抗原的純化方法，包含步驟收集發酵的表達FnbAl的工程菌后，按照高壓破菌、離心，硫酸銨分步沉淀，GST親和層析、PP酶切，離子交換層析、凝膠過濾層析技術的順序組合對制備的抗原進行純化。步驟具體為I)高壓破菌將收集的抗原的菌體以pH為7. 0-7. 5的10_20mM PBS緩沖液混勻 懸浮，預冷后采用高壓勻漿破菌，高速離心，收集上清；2)硫酸銨分步沉淀4°C攪拌條件下，上清中緩慢加入終濃度為30%的硫酸銨，攪拌半小時以上，10000-15000g高速離心20分鐘以上，收集上清，上清中繼續緩慢加入終濃度為40%的硫酸銨，攪拌半小時以上，10000-15000g高速離心20分鐘以上，收集沉淀；3)沉淀復溶稱量沉淀濕重，按重量體積比為1: 10比例加入pH為7. 0-7. 5的10-20mM的PBS緩沖液，攪拌混勻10-15分鐘，10000_15000g高速離心20分鐘以上，收集上清；4) GST親和純化選擇GST親和層析填料進行初步純化，使用roSpH7. 0-7. 5的條件下對目標蛋白進行純化，Prescission Protease酶進行酶切洗脫；5)離子交換層析純化步驟4)收集的樣品，pH調至9.0，使用pH為9. 0、10 50Tris、0 O.1MNaCl的Tris緩沖液平衡層析系統及離子交換層析柱，然后采用pH為9. O、
10 50Tris0. 5 IMNaCl 的 buffer 梯度洗脫；6)疏水層析純化將步驟5)純化獲得的樣品，按1:1的比例與pH為7. 5的20mMPB，3M (NH4)2SO4混合，采用緩沖液pH為7. 5的lOmMPB，1. 5M (NH4)2SO4平衡層析系統和疏水層析柱后上樣，采用pH為7. 5的IOmM PB梯度洗脫，去除痕量非目標蛋白等雜質，分離純化目標蛋白。7)脫鹽采用PBS平衡脫鹽柱，將步驟6)純化獲得的樣品通過脫鹽柱置換緩沖液。優選地，步驟I)采用生產或中試純化中的60_80MPa高壓勻漿破菌技術，高速離心
獲取破菌上清。優選地,步驟2)和步驟3)硫酸銨分步沉淀再復溶。優選地，步驟4)所述的GST親和純化所使用的填料為GST-Sepharose4B、GST-Sepharose 6B> GST-Sepharose FastFlow、GST-Sepharose HP 之一。優選地,步驟4)所使用的Prescission Protease酶帶有GST標簽，以利于去除Prescission Protease 酶。優選地，步驟5)所使用的離子交換層析填料為Q HP,RESOURCE Q、Q FF、Adhere之
ο優選地,步驟6)所述的凝膠層析柱為Superdex75、Superdex 200、Superdex HR10/30 之一。本發明所述抗原是通過以下步驟制備的I)設計正向引物和反向引物通過PCR擴增或全基因合成以獲得編碼FnBAl蛋白活性片段的核酸序列；
2)將步驟I)所獲得的核酸序列克隆至表達載體構建重組載體，然后將該重組載體轉化至宿主菌；3)誘導轉化后的宿主菌表達重組蛋白。本發明的有益效果是本發明采用的此純化方法，從表達耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)重組基因工程疫苗候選抗原(本申請中命名為FnbAl)的大腸桿菌工程菌中可以獲得純度大于98%的FnbAl，得率50%以上，整個純化過程無需額外置換緩沖液。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌疫苗重組蛋白抗原FnbAl為采用生物信息學方法，從MRSA的纖連蛋白結合蛋白A中預測出的的活性片段，經大腸桿菌基因工程菌表達獲得。通過上述工藝處理不同批次的FnbAl作12% SDS-PAGE，呈現出單一目標蛋白條
帶，分子量約為72KD，純度在98%以上。蛋白等電點在pH4. 5左右。不同FnbAl肽指紋圖譜各峰峰數均保持一致，各峰的保留時間均在± IOSec內波動，說明肽圖譜重現性好。純化后的FnbAl與氫氧化鋁佐劑或磷酸鋁佐劑共同注射免疫BalB/C小鼠，發現FnbAl加免疫佐劑組血清中的IgG水平顯著高于陰性對照組(PBS組)(P < O. 01)，證明使用本發明純化方法獲得的FnbAl可有效刺激機體產生較高的免疫應答。使用MRSA標準株252 (購自ATCC)感染，發現FnbAl加免疫佐劑組感染率為80%作用，且具有良好的重復性，表明該蛋白片段具有良好的免疫原性和免疫保護性，可用作耐甲氧西林葡萄球菌重組基因工程疫苗的候選抗原。


圖1為FnbAl發酵菌體破菌樣品SDS-PAGE。在圖中，泳道M為蛋白分子量marker，泳道1_2為FnbAl破菌上清。圖2為硫酸銨沉淀及GST親和層析樣品SDS-PAGE。在圖中，泳道M為蛋白分子量marker，泳道I為40%硫酸銨沉淀后復溶樣本，泳道2為PP酶酶切后第一次洗脫樣本，泳道3為PP酶酶切后第二次洗脫樣本，泳道4為PP酶(Prescission Protease酶)酶切后第三次洗脫樣本。圖3為離子交換層析圖。圖中分別列出了 280nm處的紫外吸收值和電導值的變化。圖4為離子交換層析樣品SDS-PAGE。在圖中，泳道M為蛋白分子量marker，泳道1_5為峰I樣品，泳道6為峰2樣品，泳道7為峰3樣品，泳道8為峰4樣品。圖5為兩次疏水層析的層析圖。圖中分別列出了 280nm處的紫外吸收值和電導值的變化。 圖6為疏水層析樣品SDS-PAGE。在圖中，泳道M為蛋白分子量marker，泳道I為離子交換層析樣本，泳道2_3為第二次疏水層析樣本，泳道4-7為第一次疏水層析樣本。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作詳細描述。實施例一抗原FnBAl的制備
本實施例所使用的菌株與各種試劑如下1.菌株金黃色葡萄球菌MRSA-252國際標準株由美國ATCC提供；2.試劑質粒pGEX-6p_2、大腸桿菌菌株XL-lblue為申請人教研室保存，primeSTAR HS DNA Polymerase>DNA Marker、限制性內切酶 BamHI 和 Not1、蛋白Marker為大連TakaRa公司產品；質粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒為美國Omega公司產品；細菌基因組提取試劑盒、超薄回收試劑盒以及顯色液為天根公司產品；T4DNA Ligase 為 Fermentas 公司產品；谷胱甘妝-瓊脂糖凝膠Glutathione Sepharose 4B為美國GE Healthcare公司
女口
廣叩ο本實施例的具體步驟如下(一 )耐甲氧西林金黃色葡萄球菌纖連蛋白結合蛋白A活性片段FnBAl活性片段的克隆1.首先根據MRSA_252FnBA蛋白全長基因序列，應用生物信息軟件進行結構分析，確定需要擴增的FnBAl目的基因片段。所述FnBAl目的基因片段的核苷酸序列如SEQ IDNO :1所不,其蛋白的的氣基酸序列如SEQ ID N0:2所不。2.根據分析結果，采用PCR方法自MRSA-252基因組擴增FnBAl目的基因片段，擴增步驟如下I)設計PCR引物如下，分別為SEQ ID NO :3_4 (下劃線示酶切位點堿基序列)FnBAl-F SEQ ID NO 35, -CGCGGATCCATGGGACAAGATAAAGAAGCTGCA-3'BamH IFnBAl-R SEQ ID NO 45' -TTTTCCTTTTGCGGCCGCCTATCCATTATCCCATGTTAATGTAT-3'Not I2)-80°C冷凍庫中取出保存的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA-252菌株涂布于MRSA-252專用固體培養基上，于37 °C培養過夜，再挑取單菌落接種于MRSA-252專液體體培養基中培養8個小時，參照細菌基因組抽提試劑盒抽提MRSA基因組。3)以MRSA-252全基因組DNA為模板PCR擴增FnBAl基因片段PCR 體系
權利要求
1.一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)疫苗重組蛋白抗原FnbAl的純化方法，其特征在于，包含步驟收集制備的所述抗原；按照高壓破菌、離心，硫酸銨分步沉淀，GST親和層析、PP酶酶切，離子交換層析、疏水層析和脫鹽的順序組合對制備的抗原進行純化。
2.如權利要求1所述的純化方法，其特征在于1)高壓破菌將收集的菌體以PH為7.0-7. 5的10-20mM PBS緩沖液混勻懸浮，預冷后采用高壓勻漿破菌，高速離心，收集上清；2)硫酸銨分步沉淀4°C攪拌條件下，上清中緩慢加入終濃度為30%的硫酸銨，攪拌半小時以上，10000-15000g高速離心20分鐘以上，收集上清，上清中繼續緩慢加入終濃度為 40%的硫酸銨，攪拌半小時以上，10000-15000g高速離心20分鐘以上，收集沉淀；3)沉淀復溶稱量沉淀濕重，按重量體積比為1: 3-10比例加入pH為7. 0-7. 5的 10-20mM的PBS緩沖液，攪拌混勻10-15分鐘，10000-15000g高速離心20分鐘以上，收集上清；4)GST親和純化選擇GST親和層析填料進行初步純化，使用PBSpH7. 0-7. 5的條件對目標蛋白進行純化，Prescission Protease酶進行酶切洗脫；5)離子交換層析純化步驟4)收集的樣品，pH調至9.0，使用pH為9.0，10 50Tris， O O.1M NaCl的Tris緩沖液平衡層析系統及離子交換層析柱，然后采用pH為9. 0,10 50Tris，0. 5 IM NaCl 的 buffer 梯度洗脫；6)疏水層析純化將步驟5)純化獲得的樣品，按1:1的比例與pH為7. 5的20mM PB， 3M (NH4) 2S04混合，采用緩沖液pH為7. 5的lOmMPB，1. 5M (NH4) 2S04平衡層析系統和疏水層析柱后上樣,采用pH為7. 5的IOmM PB梯度洗脫，去除痕量非目標蛋白等雜質，分離純化目標蛋白。7)脫鹽采用PBS平衡脫鹽柱，將步驟6)純化獲得的樣品通過脫鹽柱置換緩沖液。
3.如權利要求2所述的純化方法，其特征在于，步驟I)采用生產或中試純化中的 60-80MPa高壓勻漿破菌技術，高速離心獲取破菌上清。
4.如權利要求2所述的純化方法，其特征在于，步驟2)和步驟3)硫酸銨分步沉淀再復溶。
5.如權利要求2所述的純化方法，其特征在于，步驟4)所述的GST親和純化所使用的填料為 GST-Sepharose 4B、GST-Sepharose 6B、GST-Sepharose FastFlow> GST-Sepharose HP 之一。
6.如權利要求5所述的純化方法，其特征在于，步驟4)所使用的Prescission Protease酶帶有GST標簽，以利于去除Prescission Protease酶。
7.如權利要求2所述的純化方法，其特征在于，步驟5)所使用的離子交換層析填料為 Q HP、RESOURCE Q、Q FF、Adhere 之一。
8.如權利要求2所述的純化方法，其特征在于，步驟6)所述的疏水層析柱為phenyl或 butyl ο
9.如權利要求1至8任一項所述的純化方法，其特征在于，所述抗原是通過以下步驟制備的I)設計正向引物和反向引物通過PCR擴增或全基因合成以獲得編碼FnBAl蛋白活性片段的核酸序列；2)將步驟I)所獲得的核酸序列克隆至表達載體構建重組載體，然后將該重組載體轉化至宿主菌；3)誘導轉化后的宿主菌表達重組蛋白。
全文摘要
本發明公開了一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)疫苗重組蛋白抗原FnbA1的純化方法。FnbA1為采用生物信息學方法，從MRSA的纖連蛋白結合蛋白A中預測出的活性片段，經大腸桿菌基因工程菌表達獲得。其純化步驟為對高密度發酵的FnbA1重組表達菌按照高壓破菌、離心，硫酸銨分步沉淀，GST親和層析、PP酶酶切，離子交換層析、疏水層析和脫鹽的順序組合進行純化。本發明提供的純化方法簡捷、容易放大、重復性好，所獲目標蛋白純度高，動物試驗證明純化的抗原可有效刺激機體產生較高的體液免疫應答和良好的免疫保護作用。
文檔編號C12N15/31GK102993278SQ20121037884
公開日2013年3月27日 申請日期2012年9月29日 優先權日2012年9月29日
發明者章金勇, 鄒全明, 郭鷹, 馮強, 樊紹文, 盧陸, 董衍東, 敬海明, 顧江 申請人:重慶原倫生物科技有限公司, 中國人民解放軍第三軍醫大學