專利名稱：一種鯉皰疹病毒2型的巢式pcr檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及水產養殖動物病原檢測領域，更具體涉及一種鯉皰疹病毒2型(Cyprinidherpesvirus 2, CyHV-2)的基因檢測試劑盒,適用于水產養殖中鯉皰疫病毒病2型的診斷、進出口檢驗檢疫中鯉皰疹病毒病2型的快速檢測。
背景技術：
鯉皰疹病毒2型(CyHV-2)是造成金魚大量死亡的皰疹病毒性造血器官壞死病(herpesviral haematopoietic necrosis,HVHN)的病原，故也稱為金魚造血器官壞死病毒(goldfish haematopoietic necrosis virus,GFHNV)。按照國際病毒系統分類委員會的系 統命名規則，正式命名為鯉皰疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2)0該病毒于1992年秋季和1993年春季因造成日本西部養殖的金魚大量死亡而被首次發現，其致死率高達100%。該病隨后在美國，中國臺灣,澳大利亞和英國相繼爆發,給金魚養殖造成了巨大的經濟損失。近年來，我國鯽魚(異育銀鯽)主要養殖區的鯽魚出現了大規模死亡，死亡率達80%以上，經過電鏡觀察和分子檢測，確定病原為CyHV-2。該病傳播范圍廣、傳染性強、發病快、致死率高，已給我國鯽魚養殖業造成了巨大的經濟損失，成為我國水產養殖中危害最為嚴重的病毒性疾病之一。細胞培養分離技術是病毒診斷的有效方法，通常是世界動物衛生組織(OIE)推薦的魚類病毒檢測的首選方法。但現有研究資料表明，CyHV-2很難在現有的魚類細胞系中增殖。胖頭鯉細胞(fathead minnow cells,FHM)、鯉魚上皮瘤細胞(epithelioma papillosumcyprini, EPC)、獲魚腎細胞(eel kidney, EK-1)、鮭魚胚胎細胞(chinook salmon embryo,CHSE-214)、虹鱒魚性腺細胞(rainbow trout gonad, RTG-2)和羅非魚卵巢細胞(tilapiaovary，T0-2)均對CyHV-2不敏感。僅錦鯉鰭細胞(koi fin 1，KF-1)能產生特征性的細胞病變效應(CPE)，但可惜的是，病毒在KF-I細胞上傳至第3代后，CPE消失。可見目前階段，細胞培養不是CyHV-2診斷的有效方法，基于病毒基因檢測的技術就成為了 CyHV-2最有效的檢測方法。聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)擴增技術作為最基本的基因擴增技術，現在廣泛應用于分子生物學的各個領域，在病毒鑒定領域也得到了廣泛的應用。然而其擴增結果受限于檢測對象的模板含量，當模板量很少時，常常獲得陰性結果。在魚病學領域，患病魚體內的病毒量通常很低，使用傳統的常規PCR檢測技術通常由于其靈敏度不夠而出現假陰性結果，無法滿足水產養殖病害診斷以及口岸檢疫工作的需要。巢式PCR擴增技術是一種建立在常規PCR技術上的新技術，其設計兩套PCR引物(巢式引物)對模板進行兩輪PCR擴增反應。在第一輪擴增中，外引物用以產生擴增產物，以此擴增產物作為模板用內引物進行第二輪擴增。由于巢式PCR反應有兩次PCR擴增，從而降低了擴增多個靶位點的可能性(因為與兩套引物都互補的模板很少)因而增加了檢測的敏感性，同時又有兩對PCR引物與檢測模板的配對，增加了檢測的可靠性。目前未見CyHV-2的巢式PCR試劑盒的報道。

發明內容
針對現有技術的不足，本發明的目的是在于提供了一種鯉皰疹病毒2型的巢式PCR檢測試劑盒，本發明操作簡單，方便快捷，檢測限低，靈敏度高，檢測結果準確可靠。本發明以抽提自患病魚組織的病毒DNA作為PCR擴增模板，用兩對嵌套式引物對模板DNA進行擴增，可以在較短時間內完成整個PCR檢測，不但極大地提高了檢測靈敏度，而且縮短了檢測時間，且結果準確可靠，是一種有效的鯉皰疹病毒2型分子生物學檢測方法。為了實現上述的目的，本發明采用以下技術方案一種鯉皰疹病毒2型的巢式PCR檢測試劑盒，包括盒體，盒內襯墊上放置6個盛有試劑的I. 5mL離心管，包括IOX反應緩沖液，Taq酶(1U/μ L)，引物Pl (含CyHV_2PlF、CyHV-2PlR各 10 μ Μ)，引物 P2 (含 CyHV-2P2F、CyHV_2P2R各 10 μ Μ)，純水(分子生物學級)，陽性0嫩(1(^8/!1^)。 所述的IOX 反應緩沖液的配方為Tris-HCl IOOmM, KCl 500mM, MgC1215mM,dNTPs2mM。所述的Tris-HCl為三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽；KC1為氯化鉀；MgCl2為氯化鎂；dNTPs為合成DNA所需的四種脫氧核苷酸的等體積混合液。上述各種液體試劑分別裝在I. 5mL離心管中，置于盒內。所述的引物核苷酸序列為CyHV-2PlF 為TGAAATGTCAAAAGTGGATGGCyHV-2PlR 為TATTCCCAGACAGCCTTCAAACyHV-2P2F 為GAACACCGCTGCTCATCATCCyHV-2P2R 為ACTCTTCGCAAGTCCTCACC一種鯉皰疹病毒2型的巢式PCR檢測試劑盒，其檢測步驟是I)檢測前檢測樣本DNA的提取取適量瀕死的患病魚鰓絲、脾臟、腎臟組織，用玻璃勻漿器勻漿，5000rpm于4°C離心10分鐘，取適量勻漿上清液用DNA提取試劑提取DNA。2)外引物Pl的PCR擴增制備PCR反應體系20 μ L :10XPCR反應緩沖液2 μ L，Taq酶(1U/μ L)1 μ L，外引物Ρ10. 5 μ L，DNA模板4 μ L，純水補足至20 μ L。同時取陽性對照DNA模板做陽性對照，取純水做陰性對照。PCR反應條件為94°C預變性5分鐘，94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸40秒，30個循環后72 °C 5分鐘。3)內引物P2的PCR擴增取I μ L外引物Pl的擴增產物作為模板，以內引物Ρ2為弓丨物進行PCR擴增，其他反應成分和反應條件同第一次擴增。4)擴增產物檢測與分析2%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶并成像分析。5)結果判定A.當檢測樣本和陽性對照的擴增條帶大小一致，為357bp時，結果為陽性；B.當檢測樣本無條帶或條帶大小與陽性對照的擴增條帶大小不一致，不為357bp時，結果為陰性；C.當陽性對照無條帶時，表明試劑盒中相關試劑降解，試劑盒失效；D.當陰性對照出現條帶時，操作過程中有試劑污染，檢測結果無效。本發明的有益效果是
本發明檢測鯉皰疹病毒2型的巢式PCR試劑盒，提供一種檢測高致病性的魚類病毒的分子檢測技術，尤其是能快速、簡便、準確的檢測病原的試劑盒，能在8小時內完成檢測。本發明提供了一種依賴PCR的分子檢測試劑盒，克服細胞分離培養、電鏡超薄切片觀察、ELISA檢測等病毒診斷方法繁瑣、效率低、可靠性差、成本高的不足。該試劑盒能快速、靈敏、準確地檢測到病原，并可直接從患病魚組織中檢測到病毒病原。大大簡化了檢測程序，提高了檢測水平，同時為病害防治策略的制定提供了技術依據。通過對鯉皰疹病毒2型的特異性檢測，經過外引物CyHV_2PlF和CyHV_2PlR，以及內引物CyHV-2P2F和CyHV_2P2R對目標病毒進行兩輪PCR擴增，獲得357bp的單一 PCR產物，可以特異的檢測目標病毒。但是對于錦鯉皰疹病毒(KHV)、大鯢虹彩病毒(GSIV)、斑點叉尾鮰病毒(CCV)、鰻魚皰疹病毒(HVA)等4種DNA病毒，均無擴增產物。通過靈敏度的檢測，對克隆有目的基因的T載體進行常規PCR和巢式PCR檢測比較，發現常規PCR擴增的最低檢測限為IO3個拷貝，而巢式PCR最低檢測限為10個拷貝。


圖I為一種鯉皰疹病毒2型的巢式PCR檢測試劑盒的示意圖。其中I為盒體，2為襯墊，3為IOX反應緩沖液，4為Taq酶，5為引物P1，6為引物P2，7為純水，8為陽性DNA。圖2是發明實施例患病魚的CyHV-2檢測結果示意圖。其中M為Takara DL1000DNA Marker, Γ5為檢測樣本，6為陽性對照，7為陰性對照。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明的原理與特征進行描述，所舉實施例只用于解釋本發明，并非用于限定本發明的范圍。實施例I :一種鯉皰疹病毒2型的巢式PCR檢測試劑盒，包括盒體(I )，盒內襯墊(2)上放置6個盛有試劑的I. 5mL離心管，包括IOX反應緩沖液(3)，Taq酶(1U/μ L) (4)，引物Pl (包含 CyHV-2PlF、CyHV_2PlR 各 10 μ Μ) (5)，引物 Ρ2 (包含 CyHV_2P2F、CyHV_2P2R 各 10 μ Μ)
(6)，純水(分子生物學級)(7)，陽性0嫩(1(^8/!1^) (8)。所述的IOX 反應緩沖液的配方為Tris-HCl IOOmM, KCl 500mM, MgCl215mM,dNTPs2mM。所述的Tris-HCl為三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽；KC1為氯化鉀；MgCl2為氯化鎂；dNTPs為合成DNA所需的四種脫氧核苷酸的等體積混合液。上述各種液體試劑分別裝在I. 5mL離心管中，置于盒內。所述的引物核苷酸序列為CyHV-2PlF 為TGAAATGTCAAAAGTGGATGGCyHV-2PlR 為TATTCCCAGACAGCCTTCAAACyHV-2P2F 為GAACACCGCTGCTCATCATC
CyHV-2P2R 為ACTCTTCGCAAGTCCTCACC實施例2 一種鯉皰疹病毒2型的巢式PCR檢測試劑盒，包括盒體1，盒內襯墊2上放置6個盛有試劑的1.5mL離心管，包括IOX反應緩沖液3，Taq酶(1U/μ L) 4，引物Pl (包含CyHV-2PlF、CyHV-2PlR 各 10 μ Μ) 5，引物 P2 (包含 CyHV_2P2F、CyHV-2P2R 各 10 μ Μ) 6，純水(分子生物學級)7，陽性DNAdOy g/mL) 8ο所述的IOX 反應緩沖液的配方為Tris-HCl IOOmM, KCl 500mM, MgC1215mM,dNTPs2mM。所述的Tris-HCl為三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽；KC1為氯化鉀；MgCl2為氯化鎂；dNTPs為合成DNA所需的四種脫氧核苷酸的等體積混合液。所述試劑盒的使用方法，包括以下步驟 I)檢測前檢測樣本DNA的提取取適量瀕死的患病魚鰓絲、脾臟、腎臟組織，用玻璃勻漿器勻漿，5000rpm于4°C離心10分鐘，取適量勻漿上清液用DNA提取試劑提取DNA。2)外引物Pl的PCR擴增制備PCR反應體系20 yL :10XPCR反應緩沖液2 μ L，Taq酶(1U/μ L)1 μ L，外引物Ρ10. 5 μ L，DNA模板4 μ L，純水補足至20 μ L。同時取陽性對照DNA模板做陽性對照，取純水做陰性對照。PCR反應條件為94°C預變性5分鐘，94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸40秒，30個循環后72 °C 5分鐘。3)內引物P2的PCR擴增取I μ L外引物Pl的擴增產物作為模板，以內引物Ρ2為弓丨物進行PCR擴增，其他反應成分和反應條件同第一次擴增。4)擴增產物檢測與分析2%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶并成像分析。5)結果判定E.當檢測樣本和陽性對照的擴增條帶大小一致，為357bp時，結果為陽性；F.當檢測樣本無條帶或條帶大小與陽性對照的擴增條帶大小不一致，不為357bp時，結果為陰性；G.當陽性對照無條帶時，表明試劑盒中相關試劑降解，試劑盒失效；H.當陰性對照出現條帶時，操作過程中有試劑污染，檢測結果無效。實施例3 對5個自然感染的患病魚組織樣本的檢測隨機抽取患典型病癥的鯽魚，取適量鰓組織于玻璃勻漿器勻漿，取勻漿上清液O. 25mL用DNAzol提取病毒DNA模板，用試劑盒中的試劑進行巢式PCR檢測。檢測結果用1%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳及成像系統分析。結果表明(附圖2)，所檢測的5個鯽魚樣本均為CyHV-2陽性，此結果和電鏡超薄切片觀察結果完全一致。以上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本實施，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.ー種鯉皰疹病毒2型的巢式PCR檢測試劑盒，其特征在于盒體(I)內襯墊(2)上放置6個盛有試劑的I. 5mL離心管，包括IOX反應緩沖液含Tris-HCl IOOmM, KCl 500mM,MgCl2 15mM, dNTPs 2mM (3)，Taq 酶 IU/μ L (4)，引物 Pl :含 CyHV-2 P1F、CyHV-2 PlR 各10yM(5)3|_P2:*CyHV-2 P2F、CyHV-2 P2R#10yM (6)，純水(7)，陽性 DNA 10 μ g/mL (8)；上述各種液體試劑分別裝在1.5mL離心管中，置于盒內。
2.根據權利要求I所述的ー種鯉皰疹病毒2型的巢式PCR檢測試劑盒，其特征在于所述的引物核苷酸序列為 CyHV-2 PlF 為TGAAATGTCAAAAGTGGATGGCyHV-2 PlR 為TATTCCCAGACAGCCTTCAAACyHV-2 P2F 為GAACACCGCTGCTCATCATC CyHV-2 P2R 為ACTCTTCGCAAGTCCTCACC。
全文摘要
本發明公開了一種鯉皰疹病毒2型的巢式PCR檢測試劑盒，其特征在于盒體(1)內襯墊(2)上放置6個盛有試劑的1.5mL離心管，包括10×反應緩沖液含Tris-HCl100mM，KCl500mM，MgCl215mM，dNTPs2mM(3)，Taq酶1U/μL(4)，引物P1含CyHV-2P1F、CyHV-2P1R各10μM(5)，引物P2含CyHV-2P2F、CyHV-2P2R各10μM(6)，純水(7)，陽性DNA10μg/mL(8)。外引物P1的序列為CyHV-2P1FTGAAATGTCAAAAGTGGATGG，CyHV-2P1RTATTCCCAGACAGCCTTCAAA；內引物P2的序列為CyHV-2P2FGAACACCGCTGCTCATCATC，CyHV-2P2RACTCTTCGCAAGTCCTCACC。經過內外引物的兩輪擴增，最終可獲得357bp的DNA產物。本發明操作簡單，方便快捷，檢測限低，靈敏度高，檢測結果準確可靠。
文檔編號C12R1/93GK102851403SQ20121037883
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月29日 優先權日2012年9月29日
發明者徐進, 張輝, 曾令兵 申請人:中國水產科學研究院長江水產研究所