專利名稱：一種高密度檢測拷貝數變異的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及用熒光通用引物、限制性內切酶消化樣本和PCR法制備內對照模板的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，應用于生物科學研究與臨床分子診斷。
背景技術：
拷貝數變異(copy number variations, CNVs)是近年來發(fā)現的基因組多樣性的新形式，它是指與參考序列相比，基因組中l(wèi)kb 3Mb的DNA片段的結構變異現象。CNVs廣泛存于基因組中，與一些遺傳性疾病的發(fā)生相關，對人類抗病性和易感性表型等變異有重要影響。這就要求建立一種快速、準確和低成本的CNVs分型檢測技術。隨著生物技術的發(fā)展，不同的研究小組相繼開發(fā)了許多的檢測方法，主要包括 以雜交為基礎和以PCR為基礎的檢測技術。前者可以在全基因組水平上對CNVs進行檢測，代表技術有微陣列比較基因雜交(SolinasToldo, Lampel et al Genes ChromosomesCancer. 1997Dec; 20 (4) : 399-407)、全基因組 SNP 芯片(Irving, Bloodworth et al. CancerRes. 2005Aprl5; 65 (8) :3053-8),代表性寡核昔酸微陣列技術(Lucito, Healy etal. Genome Res. 20030ct; 13 (10) : 2291-305. Epub 2003 Sep 15.)等，其優(yōu)點是通量高且易于實現自動化，但是普遍存在分辨率低、成本高和周期長的缺點。后者主要是針對具體的目標位點進行檢測，代表性的技術有實時熒光定量PCR、多重連接探針擴增技術(MLPA)(Schouten, McElgunn et al. Nucleic Acids Res. 2002 Jun 15; 30 (12) : e57)和多重可擴增探針雜交(MAPH) (Armour, Sismani et al. Nucleic Acids Res. 2000Jan 15; 28 (2) :605-9.)等。實時熒光定量技術有操作簡單、重復性好、實驗周期短等優(yōu)點，但是檢測通量較??；與實時熒光定量PCR相比，MLPA和MAPH的檢測通量有了很大提高，不過PCR微環(huán)境的變化會導致不同位點不能完全同步擴增，而且PCR的平臺效應也會影響檢測結果。以PCR為基礎的檢測技術存在一個共同的缺陷就是待測樣本和對照樣本是分開檢測的，這樣兩者PCR效率的差異會引起檢測結果的偏差。競爭性PCR克服了這個缺陷，實現CNVs的快速、準確、經濟的檢測。在PCR擴增過程中，PCR產物的量可以用公式Y=A (1+R) n來表示，其Y表示PCR產物的量，A表示初始模板的量，R表示PCR的擴增效率，η表示PCR的循環(huán)數，當PCR擴增效率相同時，PCR產物的量與初始模板的量成正比。競爭性PCR利用了這一原理，在同一 PCR反應體系中涉及兩組模板，一組是待測樣本，另一組是合成的一段核酸序列，用作內對照，兩組模板僅在目標序列長度上(存在一些堿基的插入或缺失)存在一些差異，其他反應條件一致，因此兩者擴增效率接近一致，兩種擴增產物量的比直觀的反映了初始模板(待測樣本和內對照不存在拷貝數差異)量的比，可以根據內對照的初始模板的量來計算樣本的濃度。在檢測拷貝數變異時，當兩模板具有相同的濃度或削除了濃度差異帶來的影響時，PCR產物量的比值就反映模板拷貝數的差異。PRT 法(Paralogue Ratio Test) (Armour, Palla et al. Nucleic AcidsRes. 2007; 35 (3) :el9. Epub 2006 Decl4)是基于競爭性 PCR 的一種檢測 CVNs 的一種方法，此方法的優(yōu)點是待測位點和內對照共存于基因組序列中，但是缺點也是很明顯的，只能針對有限的基因位點進行檢測，而且針對不同檢測位點都要設計一對熒光引物，加大了實驗成本。與MLPA技術相比，常規(guī)的競爭性PCR方案因為同一區(qū)段中PCR間距小而會相互干擾，所以PCR間的間距要足夠遠。一般PCR間距為5千個堿基時，相互之間沒有影響，即5000個堿基中只能有一個PCR反應進行檢測。所以當需要精細檢測這個核酸區(qū)段中的拷貝數變化時，在需要用高密度的檢測位點將整個檢測區(qū)段全部覆蓋時，比如在IOOOkb中放置3個檢測位點，常規(guī)競爭性PCR法是無法進行檢測的，而MLPA則可以完成。與此同時，由于內對照模板一般構建在質粒載體上，一般長度為2-4kb，而線性化的基因組長度為20k，在檢測過程中，這種模板的長度差異，使得實際PCR效率不完全一致，這種差異在很多時候是不可以忽視的，尤其是在拷貝數變異的定量檢測中，這種差異無法避免造成定量結果不準確，因此許多檢測區(qū)段無法用競爭性PCR進行檢測。對于GC較高的檢測片段，這種差異現象更加突出。最后，由于常規(guī)的內對照模板需要全基因合成及克隆在質粒上，因此制備時間在I周到I個月，用PCR法直接制備則在一天內可以內對照的制備，快速進入后續(xù)的實驗。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是克服現有技術的空白，提供一種新的成本低、通量高、適用性好、方案建立時間短、實現和MLPA —樣高密度覆蓋的CNVs檢測方法。在總結現有技術中各種檢測方法的優(yōu)缺點基礎上，發(fā)明人經過自主創(chuàng)新研發(fā)，令人驚奇地發(fā)現通過如下設計，可以成功解決上述技術問題，并且成功應用于生物科學研究與臨床分子診斷等領域。本發(fā)明的目的通過以下技術方案實現簡而言之，是通過利用一種或多種限制性內切酶消化樣本，將大的目標區(qū)段消化成一個個獨立的小片段，同時用一個引物方案簡單制備和酶切產物類似的內對照模板，使得目標模板和內對照模板從起始開始的狀態(tài)基本一致，從而使基于熒光通用引物的多重競爭性PCR的檢測方案構建時間更快，方案適用性更廣及使檢測區(qū)段實現高密度檢測位點覆蓋。本發(fā)明的技術方案之一是提供一種多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，包括以下步驟(I)提供多重競爭性PCR引物，由至少一對通用熒光引物、至少一對位于待測區(qū)段和至少一對位于參照區(qū)段的嵌合特異引物組成；所述通用熒光引物長度范圍為l(T25bp，5’端用熒光標記，TM值彡57°C值，且對待測基因組具有特異性；所述嵌合特異引物針對待測區(qū)段和參照區(qū)段設計，TM值>62°C，長度范圍為28 50bp，3’端為18 25bp的特異引物序列，5’端為所述通用引物序列，所述3，端和5，端的兩個序列之間插入兩個堿基的固定組合；所有嵌合特異引物之間的TM值的差異不超過3°C ;當有兩對或兩對以上時，所述參照引物設計在相同或不同的參照區(qū)段上，且與待測基因無特異性匹配；所述多重競爭性PCR引物所產生的不同擴增產物片段之間有可檢出的長度差異；(2)提供至少一對內對照的嵌合特異引物，針對待測區(qū)段或參照區(qū)段設計，其擴增產物比多重競爭性PCR產物中待測區(qū)段或參照區(qū)段所對應的產物長或短l 6bp，且由三部分組成與(I)中所述的嵌合特異引物的3’端特異引物序列完全相同的5’端多重PCR引物區(qū)；與(1)中所述的嵌合特異引物下游18 25bp的序列相同，并且TM值>62°C、引物間TM值的差異不超過3°C的3’端序列；所述5’端多重PCR引物區(qū)和所述3’端序列之間是Hbp的長度調節(jié)序列，即在5’端和3’端兩序列間分別插入Ilbp任意堿基、或在5’和3’端序列間的靠3’端 分別刪除Ilbp堿基，使所述的內對照的嵌合特異引物的擴增產物即內對照比多重競爭性PCR產物中待測區(qū)段或參照區(qū)段所對應的產物長或短l-6bp ；(3)用所述內對照的嵌合特異引物對待測區(qū)段或參照區(qū)段模板進行PCR擴增制備內對照稀釋液，將PCR產物DNA定量、稀釋，直接作為內對照模板使用；(4)用一至五種限制性內切酶對目標區(qū)段進行消化；(5)多重競爭性PCR反應(a)將含待測區(qū)段和參照區(qū)段的待測樣本和對照樣本與內對照稀釋液及多重競爭性PCR反應試劑混合在一起，進行PCR，在前3 16個循環(huán)中，退火溫度高于所述通用熒光引物的退火溫度，用于所述嵌合特異弓I物引導的擴增，在后17 20個循環(huán)中，退火溫度低于所述通用熒光引物的退火溫度，用于所述通用引物引導的擴增，且兩組退火溫度的差距^ 5 0C ；(b)根據熒光標記PCR擴增產物長度不同，對擴增產物片段進行檢測，獲得待測樣本中待測區(qū)段和參照區(qū)段以及內對照擴增產物片段的長度信息與相應的熒光強度信息；(6)數據分析i.計算每個待測區(qū)段和參照區(qū)段的樣本峰高和/或峰面積(S)和相應內對照的峰高和/或峰面積(I)，得到每個待測區(qū)段和參照區(qū)段的比值(S/I);ii以一個參照區(qū)段的比值為標準，將所有待測區(qū)段和參照區(qū)段的比值同其作比，進行數據內部標化；iii.按照i和ii的步驟將對照樣本進行數據內部標化；iv.將待測樣本和對照樣本的內部標化值作比，獲得待測樣本與對照樣本的比值，該比值乘以對照樣本的拷貝數，得到待測樣本的拷貝數上述技術方案的優(yōu)選方式之一為，所述通用突光引物長度范圍為18 20bp。上述技術方案的優(yōu)選方式之二為，所述嵌合特異引物和所述參照引物長度范圍分別為38 45bp。上述技術方案的優(yōu)選方式之三為，所述多重PCR引物對應的擴增產物的長度范圍為12(T2000bp，且所述的可檢出的長度差異為8 50bp。上述技術方案的優(yōu)選方式之四為，所述樣本的DNA分子數與所述內對照稀釋液的DNA分子數相差10倍范圍內。優(yōu)選地，所述的內對照稀釋液為濃度IOng/ μ L的所述內對照PCR產物DNA稀釋一百萬倍。上述技術方案的優(yōu)選方式之五為，所述限制性內切酶的用量為每種內切酶
O.5U/5ng總DNA量/I μ L反應體系。上述技術方案的優(yōu)選方式之六為，所述的多重競爭性PCR引物含一對通用突光引物、或者本領域的技術人員通過現有的四色熒光標記技術和ABI測序儀(如3130/3730)等的四色熒光檢測系統(tǒng)，可以非常容易地將本發(fā)明的藍色熒光標記通用熒光引物的實施例擴展至兩色、三色或者四色標記的兩對、三對或四對通用熒光引物；在多重PCR技術領域，多至幾十對的在序列上無同源性的引物對在同一 PCR反應體系中分別實現獨立的擴增反應也是常規(guī)技術。作為另一種具體實施方式
，所述的多重競爭性PCR引物由一對通用熒光引物、一對到二十對針對相同或不同待測基因的嵌合特異引物和一對到六對參照引物組成。與上述有關多重PCR技術領域的描述相同，現有技術提供了多于二十對、三十對、乃至更多對引物在同一 PCR反應體系中分別實現獨立的擴增反應的原理、方案、和具體操作指導；本發(fā)明的具體實施方式
在這樣的技術背景下，不應被視為對其他實施方式的限制，即現有技術完整地提供了實現其他實施方式的充分和必要條件。本發(fā)明的技術方案之二是提供一種基于上述的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異方法的試劑盒，包括至少一對通用熒光引物、至少一對位于待測基因上下游的嵌合特異引物和至少一對參照引物、至少一對內對照的嵌合特異引物或者定量稀釋后的內對照稀釋液、和至少一種限制性內切酶、和/或多重競爭性PCR的反應試劑。有益.效果 本發(fā)明提供了現有技術文獻中所缺乏的成本低、通量高、適用性好、方案建立時間短、實現和MLPA —樣高密度覆蓋的CNVs檢測方法。本發(fā)明令人驚奇地發(fā)現具有以下優(yōu)點I、成本低。針對所有的檢測位點，應用了通用熒光引物，并采用同一的參照區(qū)段，這些措施都大大降低了實驗成本。2、內對照制備時間短，省去了克隆，擴增等等一系列制備過程，只要一次PCR就可制備完成。3、通過一種或多種內切酶消化，使得目的片段消化成獨立的小片段，因為這些獨立片段相互不干擾，因此可實現在檢測片段上高密度覆蓋。4、數據更準確。因為PCR產物內對照和限制性內切酶消化的檢測片段都是小片段，使得PCR擴增效率更為一致。另外對于高GC的片段，也因為模板都是小片段，這個因素的影響也不存在。實驗周期短。相對于MLPA技術(需要兩天)來講，一天內就可以得到實驗結果。可對少量樣本多個基因進行同時檢測，大大縮短了實驗周期，提高了實驗效率。


圖I為一個參照區(qū)段和三個目標區(qū)段的多重PCR的試驗結果。圖2為圖I的多重PCR的試驗的原理示意圖(分析過程中涉及兩組引物一組是多重上下游嵌合特異引物；另一組是熒光通用引物)。圖3為實施例I中樣本檢測結果示意圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
實施例I利用本發(fā)明所述的方法對VIPR2基因區(qū)段(GeneBank序列號NT_007741)和10號，5號染色體上參照區(qū)段(GeneBank序列號NT_030059、NT_006576)進行了拷貝數的檢測，其中選擇限制性內切酶BamHI和Hindlll，并VIPR2基因區(qū)段上連續(xù)設計3個PCR進行檢測。實驗步驟I、通用熒光引物、位于待測基因上下游的嵌合特異引物的設計通用熒光引物的設計設計原則保證上下游引物的TM值彡57°C，且差距不超過3°C，針對小鼠和人基因組特異，引物相互作用小，上游通用引5’端用Fam熒光標記。通用引物序列為上游5’ -TTCATCCGTTCGTCCTAC-3’ ；下游5’ -ACAGCGTCAATCTCGTTC-3’。嵌合特異引物的設計我們選擇了 I個目標基因VIPR2和2個參基因區(qū)段，共設計 了 5對特異引物，并與通用引物組合成特異引物，且在通用引物的3’端插入ct兩個堿基，要求TM值彡62°C，擴增產物的長度在12(T400bp之間。所有的引物均經過Blast和Oligomask軟件的分析，從而減少非特異擴增和引物二聚體。含待測區(qū)段的VIPR2的序列如下，限制性內切酶TaqI和BamHI進行雙酶切，序列中酶切位點用斜體下劃線表示。多重PCR嵌合特異引物的特異性序列區(qū)用雙劃線表示。
>VIPR2 序列(5，-3，) CAGGGCAGGGCCGGGTGGTCGGGCCCCAGCACACGGCTCGGGGAGCCTCCCACACTTGGTGATCCCGAGCCCTCAGTCTGCTGGTGGTGGTGCTCGAGAACTGTGGCTTACAGTGCGGGTGGGC AAGCGGAGAGGAGCAGCT GTGGAGGGCAAGGACTGGGGCCATTGCTCCTTGATACACTGTGGATGAAACCCTTTACTCAGTGAAGACCTAAGACTCCCCCAGGCCTGAAAGCTGGTCTTGGCAGGAAGAGGACACAGACGGGAAGACCTTGG ACAGGGAGAC i GAT CCCT' GGCTGGCTTATCTGCTTCAGGATCTGACTGCAGCAGGTGAGACCCCAAATAAAGGCCCAGACCATGGCCACGGCTGGTGCGGCCCCTTGGGCTCCAGGTCCAGATGAGATGCAGCTGCTCAGCAGTGCCCAGGGCTGCCCTAGAGCCCTCTGGTCCGCAGAGCCCTTCTCCTCCCAGGGGCTCCCACACCCACATCTCTGCTGATTCCCTCACACATGTAGCCAAGTCTGTGGCTTCTGTGGAGGCTAATTTTTTTTCTCGAATTTAATTAATTTCGAAAACAATAAACAATAATGATTGCACACACAACACCCAGGGCAGACTTTGGCCCTGTGCAAGCAGGAAACACAACTAAAAATGTG AATCTGGGAAGCAAGTGG' GCCTGATGGGACGAAGCGTGAGCTCCGGGCAGGAGAAACTCTGTTCAGTTCAGCTCCCAGGCAGCCCTGCGCTCGCCGGTGGGCAGAGCCGGCCCAGGACCGTGCATGTCCACCCCGTGGCTGCCTGGGGCCTGTTCTGGTGCTTGCAGCCTCCAGAGCCGCCTGTGCTATGTGCTGTT GCTTCGTCTTGGAAGCGAGT CCCTMACCAACCAAGTATTCAAAGTATTCAACGAGCAGMACTGCMCAGGAAGAAAAATTATTCATTTTGGTTTTGTGCCATCCTTTTCTTTGCTTTCTCACTTTAAAATATTTTGACTTTCTAATCCCTTAGCAGTGAATATGCACTTATAATATTTGCAGAATCTCTGAAATGTTTAATTAAGAAGAAAAATAGTTCTTCAGACTAAACAGCAAAGCATCAGGGGATCACAGAGCCACTATGCTCACGCAGGCAGGGTTTACTTACAGGCCTCGATGAAGGACCAGTGGACCC AGAAGAGCTTGCCACGTGTC CCTGGGATGCCTCACAGGGTGTGCCCAGGAGGAGACAGGAGATAAGGAGCTTGGGCATGACTCTGTGGGCTGACATTGCCACAGCAGGCGGCGGCTGTCACTGCCTCCCAGATCCACATCACTCTTTATAACCCAGGCTGGGGCTCAGAAAGGAGGTTCCCAGGGAATGCTTATTGAATAAAGGAAGGAGAGAATGAACGACGGAGCCT GCACATACGGGGCTC TGG GTGACGCTGCTGGGGGCCTTGGTCTCTGCTCTTCACCAGCACCTCTGTCCTAATGTCTCCCAGGCACAGTTGCCGGCTAGGTGCAGACGAAGATGAAGACTCAGAGGTGGTGCCTCCAACACACCGGGGATCCCACCTGGACCTTGAAATCCCCCCCAGGCCACAGAAGCCCCTGAGACCCCTGG
>10號染色體序列(5，-3’ )TCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGAAATACAGGCATGTGCCACCATGCCCAGCTAATTTTGTATTTTTAGTAAAGATGGAGTTTCTTCATGTTGGCCAGGTTGGTCTCAAA.TTCCTGACCTCAGGTGATCCACCTGCCTTGGCCTCCCAMGTGCTCGGATTACAGGCATGAGTCACTGCACCTGGCATATAGATACCATTTTAAATGAGACATTTAAATAMTTACAGACACCATCACACTTCATCCCT CAATACTTCGGCATGGGTCT CCTATACGTMGGGCATTTTCCTGTGAAACAATAATACCATTATCATACCTAAGAAAATTAATGTTAAGTCACCATTGTTACCTAATATGTGCAGTCCATAGTAACATTTCCCCAATTTTCCCAATGGTGTCTCTTGTAACTCTTTTTGT>5號染色體序列(5’ -3’ )AGTCACCCAGGACAAAGCTGAGGATTCTTTATTTTTTATAAGTTTCAAAAATTTAAAGTCTAGATGAAAACTTCTCTGAAACATCCTAGATTTCTTGAATAGATATGCTCACGTTATGCTAAGGTTTGTAATATATTGTGCTAAAGTAGATGCAAAATGAAGCAAACACTATAG TGATCCT ACTACACGGCAGA CACTGCTGTACTAGGATTGTCTTATTCAATTTACTTAAGGTCTATGGTTATCTGATTCTACCGTTTAAGAAGCAGAAGCTAAGGAGACAACAAGTCAAACATACAGTTCTGGAAAATAAGTTATTAAACATATTTCTGATGTTCTATATGGGTACTGTCACCAGAGAAAGACTAGAAAAGGTTCTCTGGGATTTAGGTTTTACCACTGTGTATTAGATAGGCCATAATAATATATTGCATTATAACCTTCTTATCACTGTAGAAAGAACTGTCATCTTCAAAATAGGTTCTGCCTGACCTTTCCTCCTATTGCCACACTCTAAAGCTG CTCTTGGCCTTACAGGGTTATCATTCTGAGCTAAAGATAGTCATCTGTACCTAAGCAGTGACATTCTATGTGGAAAGCCATAAGACAAGGCTGCTTCATTGCGGACCTCTCCACCAGCAGGGTGTGTTGTTC表一目標區(qū)段和參照區(qū)段的嵌合特異引物序列
權利要求
1. 一種多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，包括以下步驟 (1)提供多重競爭性PCR引物，由至少一對通用熒光引物、至少一對位于待測區(qū)段和至少一對位于參照區(qū)段的嵌合特異引物組成； 所述通用熒光引物長度范圍為l(T25bp，5’端用熒光標記，TM值彡57°C值，且對待測基因組具有特異性； 所述嵌合特異引物針對待測區(qū)段和參照區(qū)段設計，TM值彡62°C，長度范圍為28 50bp，3’端為18 25bp的特異引物序列，5’端為所述通用引物序列，所述3’端和5’端的兩個序列之間插入兩個堿基的固定組合；所有嵌合特異引物之間的TM值的差異不超過3°C ;當有兩對或兩對以上時，所述參照引物設計在不同的參照區(qū)段上，且與待測基因無特異性匹配； 所述多重競爭性PCR引物所產生的不同擴增產物片段之間有可檢出的長度差異； (2)提供至少一對內對照的嵌合特異引物，針對待測區(qū)段或參照區(qū)段設計，其擴增產物比多重競爭性PCR產物中待測區(qū)段或參照區(qū)段所對應的產物長或短l 6bp，且由三部分組成與(I)中所述的嵌合特異引物的3’端特異引物序列完全相同的5’端多重PCR引物區(qū)；與(I)中所述的嵌合特異引物下游18 25bp的序列相同，并且TM值>62°C、引物間TM值的差異不超過TC的3’端序列；所述5’端多重PCR引物區(qū)和所述3’端序列之間是Hbp的長度調節(jié)序列，即在5’端和3’端兩序列間分別插入Ilbp任意堿基、或在5’和3’端序列間的靠3’端分別刪除Ilbp堿基，使所述的內對照的嵌合特異引物的擴增產物即內對照比多重競爭性PCR產物中待測區(qū)段或參照區(qū)段所對應的產物長或短l-6bp ； (3)用所述內對照的嵌合特異引物對待測區(qū)段或參照區(qū)段模板進行PCR擴增制備內對照稀釋液，將PCR產物DNA定量、稀釋，直接作為內對照模板使用； (4)用一至五種限制性內切酶對目標區(qū)段進行消化； (5)多重競爭性PCR反應 (a)將含待測區(qū)段和參照區(qū)段的待測樣本和對照樣本與內對照稀釋液及多重競爭性PCR反應試劑混合在一起，進行PCR，在前3 16個循環(huán)中，退火溫度高于所述通用熒光引物的退火溫度，用于所述嵌合特異弓I物引導的擴增，在后17 20個循環(huán)中，退火溫度低于所述通用熒光引物的退火溫度，用于所述通用引物引導的擴增，且兩組退火溫度的差距彡5°C ； (b)根據熒光標記PCR擴增產物長度不同，對擴增產物片段進行檢測，獲得待測樣本中待測區(qū)段和參照區(qū)段以及內對照擴增產物片段的長度信息與相應的熒光強度信息； (6)數據分析 1.計算每個待測區(qū)段和參照區(qū)段的樣本峰高和/或峰面積(S)和相應內對照的峰高和/或峰面積(I)，得到每個待測區(qū)段和參照區(qū)段的比值(S/I); 以一個參照區(qū)段的比值為標準，將所有待測區(qū)段和參照區(qū)段的比值同其作比，進行數據內部標化； iii.按照i和ii的步驟將對照樣本進行數據內部標化； iv.將待測樣本和對照樣本的內部標化值作比,獲得待測樣本與對照樣本的比值,該比值乘以對照樣本的拷貝數，得到待測樣本的拷貝數。
2.根據權利要求I所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，其特征在于，所述通用熒光引物長度范圍為18 20bp。
3.根據權利要求I所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，其特征在于，所述嵌合特異引物和所述參照引物長度范圍分別為38 45bp。
4.根據權利要求I所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，其特征在于，所述多重PCR引物對應的擴增產物的長度范圍為12(T2000bp，且所述的可檢出的長度差異為8 50bpo
5.根據權利要求I所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，其特征在于，在所述多重競爭性PCR反應中，所述待測樣本和所述對照樣本的DNA分子數與所述內對照稀釋液的DNA分子數相差10倍范圍內。
6.根據權利要求5所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，其特征在于，所述的內對照稀釋液為濃度IOng/ μ L的所述內對照PCR產物DNA稀釋一百萬倍。
7.根據權利要求I所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，其特征在于，所述限制性內切酶的用量為每種內切酶O. 5U/5ng總DNA量/I μ L反應體系。
8.根據權利要求I所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，其特征在于，所述的多重競爭性PCR引物含一對通用熒光引物、或者兩對、三對或四對不同熒光標記的通用熒光引物。
9.根據權利要求8所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，其特征在于，所述的多重競爭性PCR引物由一對通用熒光引物、一對到二十對針對相同或不同待測基因的嵌合特異弓I物和一對到六對參照弓I物組成。
10.一種基于權利要求I所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異方法的試劑盒，包括至少一對通用熒光引物、至少一對位于待測基因上下游的嵌合特異引物和至少一對參照引物、至少一對內對照的嵌合特異引物或者定量稀釋后的內對照稀釋液、和至少一種限制性內切酶、和/或多重競爭性PCR的反應試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速高密度多重競爭性PCR法檢測拷貝數變異的方法，包括下列步驟(1)提供多重競爭性PCR引物，由至少一對通用熒光引物、至少一對位于待測區(qū)段和至少一對位于參照區(qū)段的嵌合特異引物組成；(2)用限制性內切酶消化樣本獲得獨立的結構相似的樣本模板小片段，使得該檢測片段能被高密度PCR所檢測，且對于高GC序列不敏感；(3)利用PCR法直接制備內對照模板；(4)多重競爭性PCR反應；和(5)數據分析。本發(fā)明的方法能在一天內快速簡便地建立起中通量的適于5～28個基因/反應的拷貝數變異的檢測方案，結果準確，適用性廣。本發(fā)明還提供相應的試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK102936624SQ20121037885
公開日2013年2月20日 申請日期2012年10月8日 優(yōu)先權日2012年10月8日
發(fā)明者陸炯, 陳軼群, 肖君華 申請人:上海翼和應用生物技術有限公司