專利名稱：一種單核細胞太空培養基及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種單核細胞太空培養基的配制，屬于太空生物技術領域，確保單核細胞抵御太空環境中的不利因素，適度增長，降低凋亡率，從而為空間醫學細胞領域的研究提供必需的條件。
背景技術：
太空環境復雜多變，是一個低溫、強輻射、微重力的惡劣環境。在太空環境中作業的宇航員要面對復雜的外界環境，研究已經證明這些環境因素對宇航員的健康會產生影響。為進一步探索其影響機制以及制定相應的對策，需要從人體、組織、細胞以及動物實驗等全方位開展研究。隨著我國空間醫學的不斷發展，載人航天技術的進步，太空環境對人體方面的研究越來越多，細胞領域的研究也廣泛開展。無論是地面模擬太空環境還是太空搭載，在細胞研究領域仍存在許多瓶頸問題，尤其在細胞培養基制備方面仍有許多難以攻克的技術難題，例如細胞在長期太空飛行中，如何抵抗惡劣的太空環境，利用有限的培養條件繼續生存、維持增殖和凋亡的平衡？目前在地面實驗室中，細胞培養的方法已趨于成熟，根據細胞營養狀態、細胞周期、培養條件的不同，選擇恰當的時間點更換新鮮的細胞培養基、進行細胞傳代、保存細胞等。通常情況下，如人單核巨噬細胞(THP-1)，2-3天更換一次細胞培養基，根據細胞密度(IO6-1OVmL)進行傳代，37°C、5% C02的培養條件下4_5天傳代一次，在保存細胞時需配制專門的含二甲基亞砜的細胞凍存液，將細胞保存在液氮中。在地面實驗室中細胞培養通常要達到的條件包括定期更換新鮮的細胞培養基、保持一定的細胞密度并且具有適宜細胞生長條件(37°C、5% C02的細胞培養箱)。然而在太空搭載實驗中，因為微重力和輻射等因素的影響，無法達到和地面一樣的適宜細胞生存的條件，因此太空培養具有特殊性。為了增加太空細胞培養實驗的可 操作性、減少空間人力消耗、降低污染風險，因此就要求培養基的更換頻率減少，甚至不更換細胞培養基。在太空實驗中，整個細胞培養過程是一個密閉環境，這就要求對培養基進行更新，研發出適合細胞太空生存的新型培養基，在已有的研發成果中，某些太空培養基已成功應用于腫瘤細胞、干細胞等貼壁細胞的太空實驗中，但對于單核細胞太空培養基的研發缺少特異性，單核細胞屬于懸浮細胞，其生長周期及生長特性有其獨特性，已研發的太空培養基不能達到其最佳的生長狀態。

發明內容
本發明目的在于克服現有技術的缺陷，提供一種具有適應太空環境的單核細胞培養基，可以為空間醫學細胞領域的研究提供必需的研究條件。本發明中將下列物質按一定百分比配制成單核細胞太空培養基35% 45%的無L-谷氨酰胺、無HEPES的1640基礎培養基，4 % 5 %的3g/LL-谷氨酰胺，0. 01 %
0.015%的1. 5mg/L氫化可的松，50% 60%的胎牛血清，1%的1000U/ml青霉素和鏈霉素。配制單核細胞太空培養基的基本步驟為向無L-谷氨酰胺、無HEPES的1640培養基中依次加入濃度為3g/L的L-谷氨酰胺及濃度為1. 5mg/L氫化可的松，配制為無血清單核細胞太空培養基；按上述太空培養基的比例再取胎牛血清及青霉素和鏈霉素加入到無血清單核細胞太空培養基中，充分混合均勻；上述過程均在超凈工作臺上完成，嚴格遵守無菌操作原則，配制好的培養基放4°C儲存備用。配制成功后，將單核細胞接種于太空培養基中首先將培養基37°C復溫，其次以800r/min 1000r/min的速度將地面培養的單核細胞離心5min進行細胞收集，血細胞計數板計數細胞數量,最后按照105個/mL的密度將細胞接種于裝有太空培養基的搭載裝置中，密閉保存運輸。本發明通過提高培養基中胎牛血清的比例，血清濃度達到50%，可大大提高單核細胞的存活時間，有利于單核細胞保持增殖與凋亡之間的平衡，利用本發明培養的單核細胞在太空環境下生存397小時后，顯微鏡下觀察細胞。


圖1為單核細胞太空培養基的配制方法流程圖；圖2為普通光學顯微鏡下，正常單核細胞地面培養照片(X 100倍)；圖3為普通光學顯微鏡下，太空搭載飛行397小時后單核細胞照片(X 100倍)。
具體實施例方式本發明中按一定百分比配制成單核細胞太空培養基35% 45%的無L-谷氨酰胺、無JEPES的1640基礎培養基，4% 5%的3g/L L-谷氨酰胺，0. 01% 0. 015%的1. 5mg/L氫化可的松，50% 60%的胎牛血清，I %的1000U/ml青霉素和鏈霉素。太空培養基中1640基礎培養基作為單核細胞生長發育的基本微環境，確保細胞生長所必需的營養物質；適當加大了 L-谷氨酰胺的比例，為單核細胞生長過程中合成核酸、蛋白質提供了更為充足的原料；氫化可`的松(HC)是一種腎上腺皮質激素類物質，小劑量HC(遠小于生理劑量)不但能夠促進細胞生長發育，而且發揮抗炎作用；青、鏈霉素發揮了預防細菌污染的作用；太空培養基中最重要的是胎牛血清及其濃度配比，血清含有豐富的營養成份，胎牛血清品質最高、所含對細胞有害的成分最少，血清中的各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等協調細胞生長平衡。地面環境中細胞培養通常選擇血清濃度為10 % 20 %，本發明中將血清濃度調整為50 % 60 %，主要考慮到在無源環境中，細胞長時間生長會消耗掉大量的營養物質，血清中營養物質豐富，故提高血清比重。例如配制500mL單核細胞太空培養基的基本步驟為①按所述自Gibco公司購買無L-谷氨酰胺、無HEPES的1640細胞培養基，按45%的比例取225mL無L-谷氨酰胺、無HEPES的1640培養基，25mL的3g/L L-谷氨酰胺，
0.075mL的1. 5mg/L氫化可的松(按0. 015%比例)，配制為無血清細胞太空培養基共計250. 075mL ；②按所述50%的比例再取250mL胎牛血清及青霉素和鏈霉素ImL (按1%比例)加入到無血清細胞太空培養基中，充分混合均勻；③上述過程均在超凈工作臺上完成，嚴格遵守無菌操作原則，配制好的培養基放4 °C儲存備用。
搭載前將單核細胞太空培養基放置在37°C水浴箱中復溫，根據搭載裝置容積，取500 μ L的單核細胞太空培養基放入搭載裝置中。取生長狀態良好的單核細胞，如圖1所示細胞形態大小規則，成圓球形，多呈簇排列，似葡萄串珠狀。利用水平轉子離心機以IOOOr/min的速度將單核細胞離心5min收集細胞，血細胞計數板計數細胞，按IO5個/mL的細胞密度將細胞接種于添加單核太空培養基的搭載裝置中，密閉保存運輸。隨神州八號飛船太空飛行397小時。太空飛行結束后，普通光學顯微鏡下觀察細胞，如圖2所示部分細胞仍保持原來大小,性狀較規整,成圓球狀,細胞透光度較好,視野中也有部分固縮死亡的細胞,死亡細胞體積較存活細胞明顯變小，細胞成黑色團塊狀，無透光性。 本發明未詳細闡述部分屬于本領域公知技術。
權利要求
1.一種單核細胞太空培養基，其特征在于單核細胞太空培養基由下列物質按一定百分比組成35 % 45 %的無L-谷氨酰胺、無HEPES的1640基礎培養基，4 % 5 %的3g/L L-谷氨酰胺，O. 01 % O. 015 %的1. 5mg/L氫化可的松，50 % 60 %的胎牛血清，I %的1000U/ml青霉素和鏈霉素。
2.配制500mL權利要求1所述的單核細胞太空培養基，其特征在于所需上述物質分別為225mL的無L-谷氨酰胺、無HEPES的1640基礎培養基，25mL的3g/L L-谷氨酰胺，O.075mL的1. 5mg/L氫化可的松，250mL的胎牛血清，ImL的1000U/mL青霉素和鏈霉素。
3.單核細胞太空培養基的制備方法，其特征在于具體配置過程為 ①向無L-谷氨酰胺、無HEPES的1640培養基中依次加入濃度為3g/L的L-谷氨酰胺及濃度為1. 5mg/L氫化可的松，配制為無血清單核細胞太空培養基； ②按權利要求1所述的比例再取胎牛血清及青霉素和鏈霉素加入到無血清單核細胞太空培養基中，充分混合均勻； ③上述過程均在超凈工作臺上完成，嚴格遵守無菌操作原則，配制好的培養基放4°C儲存備用。
4.利用權利要求1和2所述的單核細胞太空培養基，其特征在于培養單核細胞的具體步驟為首先將培養基37°C復溫，其次以800r/min 1000r/min的速度將地面培養的單核細胞離心5min進行細胞收集，血細胞計數板計數細胞數量,最后按照IO5個/mL的密度將細胞接種于裝有太空培養基的搭載裝置中，密閉保存運輸。
全文摘要
本發明涉及一種生物技術領域，尤其是涉及一種單核細胞太空培養基的制備。包括將無L-谷氨酰胺、無HEPES的1640基礎培養基，3g/L L-谷氨酰胺，1.5mg/L氫化可的松，胎牛血清及1000U/ml青霉素和鏈霉素按一定百分比配制成單核細胞太空培養基。本發明保障了單核細胞在太空環境中長時間無源生長，并不需要對現有的培養基原料進行大量變動，保證單核細胞在長時間太空模擬環境中抵御低溫、強輻射及微重力等惡劣環境，確保其適度生長、降低凋亡率，這為空間醫學細胞領域的研究提供必需的條件。
文檔編號C12N5/0786GK103060270SQ201210379619
公開日2013年4月24日 申請日期2012年9月26日 優先權日2012年9月26日
發明者劉長庭, 郭英華, 郭娜, 方向群, 王俊峰, 李天志, 常德, 蘇龍翔, 陳振鴻, 王立 申請人:中國人民解放軍總醫院