專利名稱：一種甘蔗轉基因瞬時表達葉片受體材料的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種植物轉基因受體材料的制備方法，具體涉及一種甘蔗轉基因瞬時表達葉片受體材料的制備方法。
背景技術：
轉基因研究是植物基因功能鑒定的一種重要途徑，通常以煙草或擬南芥為模式植物。煙草或擬南芥轉基因穩定表達研究技術已趨成熟，近年來，農桿菌(Agroinfilration)介導的瞬時表達系統廣泛地應用在本生煙(AYcoiiaaa benthamian、及其M基趣系16C上。通過農桿菌混合注射將報告基因和RNA沉默抑制子導入本生煙或16C的植株葉片細胞，分析報告基因的表達情況，從而鑒定出植物病毒編碼的RNA沉默抑制子活性。甘蔗是一種單子葉禾本科糖料作物，與轉基因模式植物或其它作物(如水稻、玉米)相比，轉基因研究相對落后，這是由于甘蔗轉基因穩定表達研究存在遺傳轉化效率低、周期長、成本高的缺點，且受甘蔗不同品種基因型的限制。瞬時表達研究是解析基因功能的一種重要輔助手段。至今，開展甘蔗轉基因瞬時表達主要以愈傷組織為受體材料，但是，愈傷組織材料的準備需要1-2個月，時間長，效率低，成本高。甘蔗葉片組織是一種開展轉基因瞬時表達研究的理想外植體，不受季節限制，制備簡便，葉片表面平坦，便于報告基因表達情況的觀察，且不受品種基因型的影響。本發明采用甘蔗新葉基部幼嫩葉片，經過暗培養后即可作為外源基因表達、啟動子分析、基因沉默等轉基因瞬時表達研究的受體材料。

發明內容
本發明的目的是提供一種甘蔗轉基因瞬時表達葉片受體材料的制備方法。本發明的方法提供了一種快速、高效、簡便的甘蔗轉基因瞬時表達研究所需的受體材料的制備方法，克服現有以甘蔗愈傷組織為受體材料的轉基因瞬時表達研究體系存在的時間長，效率低，成本高的問題。本發明的目的是通過以下方法實現的。本發明的一種甘蔗轉基因瞬時表達葉片受體材料的制備方法，包括甘蔗葉片外植體田間采樣、甘蔗葉片外植體表面消毒、甘蔗葉片外植體制備和甘蔗葉片外植體預培養；其特征在于操作步驟如下
1、甘蔗葉片外植體田間采樣取生長正常且無病蟲害的甘蔗植株梢部，去除老葉和生長出來的上部葉片；
2、甘蔗葉片外植體表面消毒進一步去除梢部葉片和蔗莖，留20-30厘米長的葉片組織，用體積比75%酒精溶液消毒后，移入無菌的超凈工作臺；
3、甘鹿葉片外植體制備剝去_1和_2葉及以外的葉片,取-3和-4嫩葉,去除中脈后將基部幼嫩葉片切成2厘米X 2厘米的小方塊，平鋪于的MSO. 6固體培養基上，上表面朝下；所述MSO. 6固體培養基為改良MS+0. 5 g/L水解酪蛋白+0.6 mg/L 2，4-D+30 g/L蔗糖+6. Og/L瓊脂粉；所述改良MS培養基的配方如表I所示；所述-1、-2、-3和-4葉為甘蔗植株最高可見肥厚帶葉之上依次未完全展開的第1、2、3、4葉；
權利要求
1.一種甘蔗轉基因瞬時表達葉片受體材料的制備方法，其特征在于操作步驟如下 (1)甘蔗葉片外植體田間采樣取生長正常且無病蟲害的甘蔗植株梢部，去除老葉和生長出來的上部葉片； (2)甘蔗葉片外植體表面消毒去除梢部葉片和蔗莖，留20-30厘米長的葉片組織，用體積比75%酒精溶液消毒后，移入無菌的超凈工作臺； (3)甘鹿葉片外植體制備剝去-I和-2葉及以外的葉片，取-3和-4嫩葉,去除中脈后將基部幼嫩葉片切成2厘米X 2厘米的小方塊，平鋪于的MS0. 6固體培養基上，上表面朝下；所述MS0. 6固體培養基為改良MS+0. 5 g/L水解酪蛋白+0.6 mg/L 2，4-D+30 g/L蔗糖+6. O g/L瓊脂粉；所述改良MS培養基的配方如表I所示； 表I 改良MS培養基配方
2.由權利要求I的方法制備的甘蔗轉基因瞬時表達葉片受體材料，在甘蔗外源基因表達、啟動子分析、基因沉默研究中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種甘蔗轉基因瞬時表達葉片受體材料的制備方法，包括甘蔗葉片外植體田間采樣、甘蔗葉片外植體表面消毒、甘蔗葉片外植體制備和甘蔗葉片外植體預培養。本發明的方法取代了傳統的甘蔗愈傷組織為外植體，建立了快速、高效、簡便的甘蔗葉片受體材料制備技術，可廣泛應用于高通量的外源基因表達、啟動子活性分析、基因沉默等方面的甘蔗轉基因瞬時表達研究。
文檔編號C12N5/04GK102911929SQ20121039200
公開日2013年2月6日 申請日期2012年10月16日 優先權日2012年10月16日
發明者高三基, 米爾科夫艾瑞克, 陳如凱, 林藝華, 付為林, 傅華英, 陳永武 申請人:福建農林大學