專利名稱：使用膀胱癌特異性甲基化標記基因的膀胱癌診斷試劑盒和芯片的制作方法
技術領域：
本發明涉及使用膀胱癌特異性標記基因的用于診斷膀胱癌的試劑盒和核酸芯片，具體涉及用于診斷膀胱癌的試劑盒和核酸芯片，其可檢測膀胱癌特異性基因的啟動子甲基化，該啟動子區在膀胱癌的轉化細胞中被特異性甲基化。
背景技術：
膀胱癌是泌尿系統最常見的癌癥，并由許多因素引起。已知膀胱癌主要由吸煙或者各種化學物質(皮革染料、空氣污染、人造增甜劑、硝酸鹽以及類似物)引起，這些化學物質在體內吸收后作為尿液排泄出來的同時刺激膀胱壁。作為診斷膀胱癌的常規方法，使用發現尿液中的異常細胞的方法，但是準確率很低。而且，包括將導管插入到膀胱中并從膀胱中收集可疑組織的細胞檢查是具有相當高的精確率的侵入方法(invasive method)。一般說來，當膀胱癌在早期被診斷時，膀胱癌患者的存活率增加，但在早期診斷膀胱癌是不容易的。作為用于診斷膀胱癌的方法，目前使用的是切除身體部分，但其在早期診斷膀胱癌分類是有難度的。根據浸潤到膀胱的肌肉層，膀胱癌被分為淺表性癌和浸潤性癌。一般說來，在膀胱癌診斷時大約30%的患者是浸潤型膀胱癌患者。因此，為了增加患者的存活時間，當膀胱癌病變很小時在早期診斷膀胱癌是最佳方法。因此，迫切需要開發比各種用于膀胱癌的現有診斷方法更為有效的診斷方法，也就是說，允許早期診斷膀胱癌的膀胱癌特異性生物標記物可處理大量的樣品并具有高度的靈敏性和特異性。近年來，通過DNA甲基化測定診斷癌癥的方法已經被提出。DNA甲基化主要出現在特定基因的啟動子區中的CpG島的胞嘧啶上以干擾轉錄因子的結合，由此使基因表達沉默。因此，檢測腫瘤抑制基因的啟動子中的CpG島的甲基化極大地有助于癌癥研究。近年來，已經嘗試通過諸如甲基化特異性PCR(這里稱為MSP)或者自動DNA測序來確定啟動子的甲基化來診斷并篩查癌癥。盡管關于啟動子CpG島的甲基化是否直接誘導癌癥形成或者在癌癥形成之后引起次級變化存在爭議，但業已發現在許多癌癥中腫瘤抑制基因、DNA修復基因、細胞循環調節基因以及家系(line)是超甲基化的，因此這些基因的表達被沉默。特別是，已知特定基因的啟動子區域的超甲基化在癌癥形成的早期階段出現。因此，腫瘤相關基因的啟動子甲基化的甲基化是癌癥的重要指標，并可在許多應用中使用，包括癌癥的診斷和早期診斷，癌癥發展的預測，癌癥的預后預測，治療后的進度檢查(follow-up examination)以及對抗癌治療響應的預測。近年來,檢查血液、痰、唾液、糞便中腫瘤相關基因的啟動子甲基化并使用檢查結果診斷和治療癌癥的實際嘗試已經活躍地進行(Esteller, Μ.等人，Cancer Res. , 59:67,1999 ；Sanchez-Cespedez, Μ.等人，Cancer Res. , 60:892, 2000 ；Ahlquist, D. A 等人，Gastroenterol. ,119:1219, 2000)。因此，本發明的發明人付出了極大的努力來開發能夠有效診斷膀胱癌的診斷試劑盒，結果發現膀胱癌可通過使用在膀胱癌細胞中特異性表達的甲基化相關基因的啟動子的生物標記物來測定甲基化程度進行診斷，由此完成了本發明。

發明內容
本發明的目的在于提供用于診斷膀胱癌的試劑盒，其包括甲基化的膀胱癌標記物基因的啟動子或者外顯子區域。本發明的另一目的在于提供用于診斷膀胱癌的核酸芯片，其包括能夠與含有膀胱癌特異性標記物基因的CpG島的片段雜交的探針。本發明的還一目的在于提供測定來自診斷樣品的基因的啟動子或外顯子的甲基 化的方法。為了實現上述目的，本發明提供了用于診斷膀胱癌的試劑盒，其包括選自下組的甲基化的膀胱癌標記物基因的啟動子或者外顯子，所述組由(1)CDX2(NM_001265)-尾同源異型盒轉錄因子2 ;(2)0￥ 181(匪_000104)-細胞色素？450，家族1，亞科B，多肽I ;
(3)VSX1(NM_199425)_視覺系統同源異型盒I同系物(homoIog)，CHXlO-狀(斑馬魚)；
(4)H0XA11(NM_005523)-同源異型盒All； (5)T(NM_003181)-T,鼠短尾突變體表型同系物(brachyury homolog)(小鼠)；(6) TBX5 (NM_080717)-T-盒 5 ； (7)PENK(NM_006211)-腦啡妝原(proenkephalin) ; (8) PAQR9 (NM_198504)-黃體酮(progestin)和 adipoQ 受體家族成員IV ;(9)LHX2(NM_004789)-UM同源異型盒2 ;以及(10) SM2 (U80456)-單意同源物2 (single-minded homolog) 2 (果蜆)所組成。本發明還提供了用于診斷膀胱癌的核酸芯片，其包括能夠與含有選自下組的膀胱癌標記物基因的啟動子或者外顯子的CpG島的片段雜交的探針，該組由(I)CDX2 (NM_001265)-尾同源異型盒轉錄因子 2; (2) CYPlBl (NM_000104)-細胞色素 P450，家族1，亞科B，多肽I ;(3)VSX1(NM_199425)_視覺系統同源異型盒I同系物(homoIog)，CHXlO-狀(斑馬魚)；(4)H0XA11(NM_005523)-同源異型盒 All ;(5)T(NM_003181)-T，鼠短尾突變體表型同系物(brachyury homolog)(小鼠);(6) TBX5 (NM_080717)-T-盒5 ； (7)PENK(NM_006211)-腦啡肽原(proenkephalin) ; (8) PAQR9 (NM_198504)-黃體酮(progestin)和 adipoQ 受體家族成員 IV ; (9) LHX2 (NM_004789)-UM 同源異型盒 2 ;以及
(10)SIM2 (U80456)-單意同源物 2 (single-minded homog 2)(果蜆)所組成。本發明還涉及測定選自下組的來自診斷樣品的基因的啟動子或外顯子的甲基化的方法，該組由CDX2、CYPlBl、VSXl、H0XA11、T、TBX5、PENK, PAQR9、LHX2 和 SM2 所組成。通過下列詳細描述和隨附的權利要求書，本發明的其他特征和實施方式將更加容易想到。


圖I是通過CpG微陣列分析來自正常人和膀胱癌患者的尿液細胞中的用于膀胱癌診斷的甲基化生物標記物的過程的示意圖。
圖2定量顯示了通過膀胱癌細胞系中的10種甲基化生物標記物的焦磷酸測序(Pyrosequencing)得到的甲基化程度。圖3顯示了在臨床樣品中10種生物標記物基因的甲基化指數的測定結果。圖3顯示了在正常人、膀胱炎患者、血尿癥患者和膀胱癌患者尿液細胞中10種生物標記物的甲基化程度的測定結果。圖4顯示了測定用于膀胱癌診斷的10種甲基化生物標記物中每種的靈敏性和特異性的受試者操作特征(ROC)曲線分析的結果。圖5顯示了正常人和膀胱癌患者尿液細胞中的甲基化頻率。圖6顯示了用于膀胱癌診斷的使用邏輯回歸分析(logistic regressionanalysis)從10種生物標記物中選擇的6種生物標記物基因的最佳組(optimal panel)的甲基化圖示，并顯示了用于膀胱癌診斷的基因組(gene panel)的靈敏性和特異性。圖7顯示了為了測定膀胱癌細胞系中用于膀胱癌的生物標記物SM2基因的甲基化，使用甲基化的DNA特異性結合蛋白MBD進行PCR的結果。
具體實施例方式在一個方面，本發明涉及用于診斷膀胱癌的試劑盒，其包括膀胱癌標記物基因的甲基化啟動子或者外顯子區域。在另一方面，本發明涉及用于診斷膀胱癌的核酸芯片，其包括能夠與含有膀胱癌特異性標記物基因的啟動子或外顯子區域的CpG島片段雜交的探針。在本發明中，啟動子或者外顯子區域可含有至少一個甲基化CpG 二核苷酸。而且，啟動子或者外顯子區域是由序列號31到序列號40表不的DNA序列的任何一種。在本發明中，探針優選具有從IObp到Ikb范圍的尺寸，并與含有膀胱癌標記基因的啟動區或者外顯子的CpG島的堿基序列具有同源性，從而使其可與堿基序列雜交。更優選地，探針具有IO-IOObp的尺寸，并與含有膀胱癌標記基因的啟動區或者外顯子的CpG島的堿基序列具有同源性，使其可在嚴格條件下與堿基序列雜交。如果探針尺寸小于IObpJf發生非特異性雜交，如果大于lkb，將發生探針之間的結合，由此使其難以閱讀雜交結果。根據本發明的用于篩選甲基化標記基因的方法包括下列步驟(a)從轉化細胞和非轉化細胞中分離基因組DNA ;(b)將分離的基因組DNA與甲基化DNA結合的蛋白質反應并從基因組DNA中分離甲基化的DNA ；以及(c)擴增分離的甲基化DNA，將擴增的DNA與CpG微陣列雜交，并在雜交基因中篩選在正常細胞與癌細胞之間顯示甲基化程度最大差別的甲基化標記基因。通過篩選甲基化標記物基因的方法，不僅能夠篩選在膀胱癌細胞中甲基化的基因，而且還能篩選在膀胱癌發展中的各個異常發育時期的各種基因。篩選的基因還可用于血液癌癥篩查、風險評估、預后、疾病鑒別、疾病分期以及治療目標的選擇。膀胱癌以及各個時期的異常中甲基化基因的鑒別使得能夠以精確有效的方式進行膀胱癌的早期診斷，并允許使用多個基因的甲基化數據的建立和治療目標的鑒別。另外，當與測定其他非甲基化相關生物標記物的方法一起使用時，根據本發明的甲基化數據能夠建立膀胱癌診斷的更準確的系統。本發明的方法能夠通過確定來自樣品的至少一種核酸生物標記物的甲基化階段診斷各個階段的膀胱癌發展。將來自膀胱癌各個階段的樣品中分離的核酸的甲基化階段與膀胱組織的細胞增殖中沒有出現異常的樣品中得到的至少一種核酸的甲基化階段相比時，樣品中膀胱癌的某一階段可被確定。甲基化階段可以是超甲基化(hypermethylation)。在本發明的一種實施方式中，核酸可在基因的調節區被甲基化。在另一種實施方式中，由于甲基化從基因的調節區的外邊界開始然后向內擴散，調節區外邊界的甲基化測定能夠早期診斷在細胞轉化中涉及的基因。在本發明的還一種實施方式中，膀胱組織的細胞生長異常(發育異常)可通過使用試劑盒或者核酸芯片測定下列核酸的至少一種核酸的甲基化來診斷，所述核酸包括CDX2 (ΝΜ_001265，尾同源異型盒轉錄因子2) ；CYPIBI (ΝΜ_000104，細胞色素P450，家族1，亞科B，多肽I) ;VSX1(NM_199425，視覺系統同源異型盒I同系物)，CHXlO-狀(斑馬魚)；H0XA11(NM_005523，同源異型盒All) ;T (NM_003181)-T，鼠短尾突變體表型同系物(brachyury homolog)(小鼠);TBX5 (NM_080717，T-盒 5) ;PENK(NM_006211，腦啡肽原)；和PAQR9 (NM_198504)，黃體酮和adipoQ受體家族成員IV) ；LHX2 (NM_004789) LIM同源異型盒 2 ;SIM2(U80456)，單意同源物2(果蠅)基因以及它們的組合。本發明的診斷試劑盒或者核酸芯片的使用可確定樣品中膀胱組織的細胞生長異常。確定膀胱組織的細胞生長異常的方法包括測定從樣品中分離的至少一種核酸的甲基化。在該方法中，將至少一種核酸的甲基化時期與從沒有細胞生長異常(發育異常)分離的核酸的甲基化時期相比較。所述核酸的例子如下⑶X2 (NM_001265,尾同源異型盒轉錄因子2);CYPlBl (NM_000104，細胞色素 P450，家族 1，亞科 B，多肽 I) ；VSX1 (NM_199425,視覺系統同源異型盒I同系物)，CHX10-狀(斑馬魚)；H0XA11(NM_005523，同源異型盒All)；T(NM_003181, T，鼠短尾突變體表型同系物(小鼠))；TBX5 (NM_080717, T-盒5);PENK(NM_006211，腦啡肽原)；PAQR9 (NM_198504，黃體酮和 adipoQ 受體家族成員 IV)；LHX2 (NM_004789) -LIM同源異型盒2) ;SM2 (U80456)，單意同源物2 (果蠅)基因以及它們的組合。在本發明的還一種實施方式中，能夠形成膀胱癌的細胞可使用甲基化基因標記物在早期進行診斷。當確定在癌細胞中被甲基化的基因在臨床或者形態上看似正常的細胞中被甲基化時，該看似正常的細胞是正在進行癌發生的細胞。因此，可通過測定看似正常的細胞中膀胱癌特異性基因的甲基化早期診斷膀胱癌。本發明的甲基化標記物基因的使用能夠測定樣品中膀胱組織的細胞生長異常(發育異常形成)。測定膀胱組織的細胞生長異常(發育異常形成)的方法包括將從樣品中分離的至少一種核酸與能夠測定核酸的甲基化狀態的試劑接觸。該方法包括確定至少一種核酸中的至少一個區域的甲基化狀況，并且核酸的甲基化狀態與從膀胱組織的沒有細胞生長異常(發育異常形成)的樣品中分離的核酸中的相同區域的甲基化狀態不同。在本發明的還一種實施方式中，轉化的膀胱癌細胞可通過使用上述試劑盒或者核酸芯片檢查標記物基因的甲基化來測定。在本發明的還一種實施方式中，可通過使用上述試劑盒或者核酸芯片檢查標記物基因的甲基化診斷膀胱癌。在本發明的還一種實施方式中，可通過使用上述試劑盒或者核酸芯片檢查顯示正常表現型的樣品中標記物基因的甲基化診膀胱癌發展的可能性。樣品可以使固體或者液體組織、細胞、尿液、血清或者血衆。在還一方面，本發明涉及測定來自臨床樣品的啟動子甲基化的方法。在本發明中，測定來自臨床樣品的基因的啟動子甲基化的方法可選自下組，該組由PCR、甲基化特異性PCR、實時甲基化特異性PCR、使用甲基化的DNA特異性結合蛋白的PCR、定量PCR、焦磷酸測序(Pyrosequencing)和二硫鍵測序所組成，并且臨床樣品優選疑似癌癥患者或者待診斷受試者的組織、細胞、血液或者尿液。在本發明中，測定基因的啟動子甲基化的方法包括下列步驟(a)從臨床樣品中分離DNA ;(b)使用引物擴增分離的DNA，所述引物能夠擴增含有選自下組的基因啟動子CpG島片段，該組由 CDX2、CYP1B1、VSX1、H0XA11、T、TBX5、PENK、PAQR9、LHX2 和 SM2 所組成；以及(c)在步驟(b)中是否擴增出DNA的基礎上確定DNA的啟動子甲基化。在本發明的另一種實施方式中，可通過檢查在膀胱癌中特異性甲基化的基因的甲 基化頻率并確定具有發展成膀胱癌的可能性的組織的甲基化頻率來評估組織發展成膀胱癌的可能性。在本文中，“細胞轉化”指的是細胞特性從一種形式改變成另一種形式，諸如從正常細胞變成異常細胞，從非腫瘤細胞變成腫瘤細胞，從未分化細胞變成分化細胞，從干細胞變成非干細胞。此外，轉化可通過細胞的形態、細胞表現型、生化特性等等來識別。在本文中，術語癌癥的“早期診斷”指的是在病變轉移之前發現癌癥的可能性。優選地，其指的是在樣品組織或者細胞的形態學變化之前觀察到發現癌癥的可能性。另外，術語轉化的“早期診斷”指的是細胞在形態上標示為被轉化之前在其較早時期發生轉化的高度可能性。在本文中，術語“超甲基化”指的是CpG島的甲基化。在本文中，術語“樣品”或者“生物樣品”指的是其最廣泛的含義，并包括根據將要進行的分析的類型得自個體、體液、細胞系、組織培養物或者其他來源的任何生物學樣品。從哺乳動物得到體液和組織活檢的方法通常是廣泛已知的。優選來源是膀胱活檢。甲基化調節的生物標記物的篩選本發明涉及確定當細胞或組織從一種細胞類型轉化或改變成另一種細胞類型時被甲基化的生物標記物基因的方法。在本文中，“轉化”細胞指的是細胞或組織的性質從一種從改變成另一種，諸如從正常變成異常，從非腫瘤變成腫瘤，從未分化變成分化等等。在本發明的一種實施例中，從正常人和膀胱癌患者的尿液中分離出尿液細胞，然后從尿液的細胞中分離基因組DNA。為了從基因組DNA中僅僅得到甲基化的DNA，允許基因組DNA與結合到甲基化DNA的McrBt反應，然后分離與McrBt蛋白結合的甲基化DNA。擴增與McrBt蛋白結合的分離的甲基化DNA，然后使用Cy3標記來自正常人的DNA，使用Cy5標記來自膀胱癌患者的DNA。然后，將DNA與人類CpG島微陣列雜交，并選擇在正常人與膀胱癌患者之間顯示甲基化差異最大的10種基因作為生物標記物。在本發明中，為了進一步確認10種生物標記物已經被甲基化，進行了焦磷酸測序。特別是，將總基因組DNA從膀胱細胞系RT-4、J82、HT1197和HT1376中分離出來并使用重亞硫酸鹽處理。擴增使用重亞硫酸鹽轉化的基因組DNA。然后,將擴增的PCR產物進行焦磷酸測序以便測定基因的甲基化程度。結果，可以看出10種生物標記物都被甲基化。用于膀胱癌的生物標記物本發明提供了用于診斷膀胱癌的生物標記物。用于膀胱癌的生物標記物-使用癌細胞與正常細胞進行比較在本發明的一種實施方式中，可以理解“正常”細胞是沒有顯示任何異常形態或者細胞學變化的那些細胞。“腫瘤”細胞指的是癌細胞?！胺悄[瘤”細胞指的是患病組織的一部分，但其不被認為是腫瘤的一部分。在一個方面，本發明基于膀胱癌與下列10種基因的啟動子或者外顯子區域的超甲基化之間的關系⑶X2(NM_001265，尾同源異型盒轉錄因子2) ；CYP1B1 (NM_000104,細胞色素P450，家族1，亞科B，多肽I) ;VSX1(NM_199425，視覺系統同源異型盒I同系 物)，CHXlO-狀(斑馬魚)；H0XA11(NM_005523，同源異型盒 All) ；T (NM_003181, T，鼠短尾突變體表型同系物(小鼠));ΤΒΧ5(ΝΜ_080717Τ-盒5) ;ΡΕΝΚ(ΝΜ_006211，腦啡肽原)；PAQR9(NM_198504，黃體酮和adipoQ受體家族成員IV) ；LHX2 (NM_004789)-LIM同源異型盒2 ;SM2(U80456)_單意同源物2(果蠅)基因。根據本發明的診斷試劑盒或者核酸芯片另一應用，本發明可通過確定從受試者分離的一種或多種核酸的甲基化狀態診斷受試者膀胱組織的細胞增殖性疾病，其中當與來自在膀胱組織中沒有細胞增殖性疾病的受試者的一種或多種核酸的甲基化狀態相比時一種或多種核酸的甲基化狀態指示受試者膀胱組織的細胞增殖性疾病的。優選的核酸是含有CpG的核酸，諸如CpG島。根據本發明的診斷試劑盒或者核酸芯片的應用，受試者膀胱組織中的細胞生長異常可被診斷，包括確定來自受試者的一種或多種核酸的甲基化。所述核酸優選編碼下列基因CDX2(NM_001265，尾同源異型盒轉錄因子2) ;CYP1B1 (NM_000104，細胞色素P450，家族1，亞科B，多肽I) ;VSX1(NM_199425，視覺系統同源異型盒I同系物(homolog)，CHXlO-狀狀(斑馬魚)；H0XA11(NM_005523，同源異型盒All) ；T(NM_003181, T，鼠短尾突變體表型同系物(brachyury homolog)(小鼠))；TBX5 (NM_080717, T-盒 5) ；PENK(NM_006211,腦啡肽原(proenkephalin) ；PAQR9 (NM_198504,黃體酮和adipoQ受體家族成員IV)；LHX2 (NM_004789) -LIM同源異型盒2 ；SIM2 (U80456)-單意同源物2 (果蠅)基因以及它們的組合。當與來自沒有細胞增殖性疾病傾向的膀胱組織的受試者的一種或多種核酸的甲基化狀態相比時一種或多種核酸的甲基化狀態指示受試者膀胱組織的細胞增殖性疾病。在本文中，“傾向”指的是個體將患有疾病的可能性。雖然具有易患病體質的受試者還沒有出現疾病，但存在增加的患病傾向。本發明的另一種實施方式提供了診斷受試者膀胱組織中細胞增殖性疾病的診斷方法，包括將來自受試者的含有核酸的樣本與確定樣品中核酸的甲基化狀態的試劑接觸，并識別至少一種核酸的至少一個區域的甲基化狀態，其中與沒有細胞增殖性疾病的受試者中的相同核酸的相同區域的甲基化狀態不同的至少一種核酸的至少一個區域的甲基化狀態指示受試者膀胱組織中細胞增殖性疾病。本發明的方法包括確定從受試者分離的一種或多種核酸的一個或多個區域的甲基化狀態。本文中使用的短語“核酸”或者“核酸序列”指的是寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸或者他們中任一的片段，或者可以是單鏈或者雙鏈的基因組或者合成來源的DNA或RNA,或者可代表有義鏈或反義鏈的基因組或者合成來源的DNA或RNA,肽核酸(peptide nucleicacid，PNA)，或者天然或合成來源的DNA-狀或者RNA-狀物質。如同可由本領域技術人員理解的那樣，當核酸是RNA時，脫氧核糖核苷A、G、C和T分別被核糖核苷A、G、C和U代替。感興趣的核酸可以是其中需要檢測區別地甲基化CpG島的存在的任何核酸。CpG島是核酸序列的富CpG區。甲基化任何純化或者非純化形式的核酸樣品可根據本發明被使用，只要其含有或者懷疑其含有包括目標位點的核酸序列(例如含CpG的核酸)。能夠被差別甲基化的一種核酸區域是CpG島，一種與二核苷酸CpG的其他核酸區相比具有增加的密度的核酸序列。CpG 二核苷酸(doublet)僅僅以大約20%的頻率出現在脊椎動物DNA中，其可被預期來自一部分G*C堿基對。在一些區域中，CpG 二核苷酸的密度達到預測值；其相對于剩余基因組增加10倍。CpG島具有大約60%的G*C平均含量，并且一般DNA具有大約40%的G*C平均含量。該島采 取典型地大約I到2千堿基長的延伸形式。在人類基因中存在大約45，000個這樣的島。在許多基因中，CpG島緊鄰啟動子的上游開始，并向下游延伸到轉錄區中。在啟動子的CpG島的甲基化常常防止基因的表達。該島還可圍繞基因編碼區的5'區和編碼區的3'區。因此，CpG島可在包括調節區的編碼序列上游的核酸序列的多個區域包括啟動子區，編碼區(例如外顯子)，編碼區的下游例如增強子區和內含子中發現。一般說來，含有CpG的核酸是DNA。但是，本發明的方法可采用例如含有DNA或者含有DNA和RNA的樣品，包括信使RNA，其中DNA或者RNA可以是單鏈或者雙鏈，或者DNA-RNA雜交體可包括在樣品中。也可采用核酸的混合物。待測的特定核酸序列可以是大分子序列的碎片，或者可作為離散分子存在，因此特定序列構成了整個核酸。核酸序列最初不需要以純的形式存在，核酸序列可以使復雜混合物的很小的碎片，諸如包括在整個人類DNA中。用于測定包含在樣品中的核酸甲基化狀態或者檢測甲基化的CpG島的含核酸樣品可通過各種技術提取，諸如由 Sambrook 等人描述的技術(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor, N. Y.，1989 ;上述文獻全文引入本發明參考)。核酸可以含有作為編碼信息或者控制核酸轉錄的DNA區域的調節區域。調節區包括至少一個啟動子?！皢幼印笔亲阋灾苯愚D錄，使啟動子依賴性基因表達可控制細胞類型特異性、組織特異性或者可由外來信號或試劑誘導的最小序列。啟動子可定位在基因的5,或者3'區。對于CpG島甲基化位點，一些核酸的全部或者部分啟動子區可被檢查。此外，通常認為目標基因啟動子的甲基化自然從外邊界向內進行。因此，細胞轉化的早期階段可通過在啟動子區的外部區域中的甲基化測定來檢測。從受試者分離的核酸得自受試者的生物樣本。如果想要檢測膀胱癌或者膀胱癌發展的階段，可通過刮取或者進行生物活檢從膀胱組織分離核酸。這些樣本可通過對本領域技術人員來說已知的各種手術得到。在本發明的一個方面，與沒有患膀胱組織細胞增殖性疾病的受試者的核酸的相同區域相比，從受試者得到的樣品的核酸的甲基化狀態是超甲基化的。這里使用的“超甲基化”是一個或多個核酸中甲基化等位基因的存在。當檢查相同核酸時，來自沒有患膀胱組織細胞增殖性疾病的受試者的核酸不含有可檢測的甲基化等位基因。
樣品本發明描述了膀胱癌的早期診斷并以及膀胱癌特異性基因的甲基化的應用。膀胱癌特異性基因的甲基化也出現在腫瘤部位附近的組織中。因此，在用于膀胱癌早期診斷的方法中，膀胱癌特異性基因的甲基化可通過檢查所有樣品包括液體或者固體組織來檢測。樣品包括但不限于組織、細胞、尿液、血清或者血漿。個體基因和組(panel)可以理解本發明可單獨使用每個基因作為診斷或者先兆標記物的來實踐，或者少數與組顯示形式(panel display format)組合的標記基因來實踐，從而多個標記基因可被檢測以增加可靠性和效率。此外，在本申請中識別的任何基因可單獨或者作為與在申請中引證的任何其他基因以任何組合的一組基因使用。而且，基因可根據它們的重要性以及甲基化基因數目被分級和權重，并且形成癌癥的可能性水平可被確定。這些算法也落入本發明的范圍之內。
甲基化測定方法甲基化特異性PCR當使用重亞硫酸鹽處理基因組DNA時，5’ _CpG’ _3區中的甲基化胞嘧啶保持不變，未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶。因此，對于通過重亞硫酸鹽修飾的堿基序列，構建了含有5’-CpG-3'堿基序列的區域對應的PCR引物。這里，與甲基化情形和未甲基化情形對應的兩種類型的引物被設計。當基因組DNA被重亞硫酸鹽修飾然后使用兩種類型的引物進行PCR時，在其中DNA被甲基化的情況下，PCR產物得自其中與使用甲基化堿基序列對應的引物的DNA。相反，在其中基因未甲基化的情況下，PCR產物得自其中使用與未甲基化的堿基序列對應的引物的DNA。DNA的甲基化可使用瓊脂糖凝膠電泳定量分析。實時甲基化特異性PCR實時甲基化特異性PCR是由甲基化特異性PCR修改而來的實時測定方法，包括使用重亞硫酸鹽處理基因組DNA，設計與甲基化情形對應的PCR引物，并使用引物進行實時PCR0這里，測定甲基化的方法包括兩種方法使用與擴增的堿基序列互補的TanMan探針進行測定的方法，和使用Sybergreen進行測定的方法。因此,實時甲基化特異性PCR選擇性地僅僅定量分析DNA。這里，使用體外甲基化DNA樣品制備標準曲線，并且作為標準，在堿基序列中沒有5’ -CpG-3’序列的基因也可擴增作為陰性對照組，并定量分析甲基化程度。焦磷酸測序焦磷酸測序是由重亞硫酸鹽測序方法修改而來的實時測序方法。以與重亞硫酸鹽測序相同的方式，基因組DNA通過重亞硫酸鹽處理修飾，然后構建與沒有5’-CpG-3’序列的區域對應的引物。在使用重亞硫酸鹽處理基因組DNA之后，使用PCR弓丨物對其進行擴增，然后使用測序引物進行實時序列分析。定量分析5’-CpG-3'區域中胞嘧啶和胸腺嘧啶的量，并且甲基化程度以甲基化指數表示。使用甲基化DNA特異性結合蛋白和DNA芯片的PCR或者定量PCR在使用甲基化DNA特異性結合蛋白的PCR或者DNA芯片的方法中，當僅僅與甲基化DNA特異性結合的蛋白質與DNA混合時，蛋白質僅僅特異性地與甲基化DNA結合，因此僅僅甲基化DNA可被分離。在本發明中，將基因組DNA與甲基化DNA-特異性結合蛋白混合，然后僅僅甲基化DNA被選擇性分離。分離的DNA使用與其啟動子區對應的PCR引物進行擴增，然后通過瓊脂糖凝膠電泳測定DNA的甲基化。另外，DNA的甲基化還可通過定量PCR方法來測定。特別是，使用甲基化DNA特異性結合蛋白分離的甲基化DNA可使用熒光染料標記并與其中互補探針被集成到其中的DNA芯片雜交，由此測定DNA的甲基化。這里，甲基化的DNA-特異性結合蛋白不限于McrBt。差別甲基化-甲基化敏感限制性內切酶的測定差別甲基化的測定可通過將核酸樣品與僅僅在一定條件下裂解未甲基化的CpG位點的甲基化敏感核酸內切酶接觸一段 時間以允許未甲基化核酸裂解來實現。在分離反應中，將樣品進一步與在一定條件下裂解甲基化和未甲基化兩者的CpG位點的甲基化敏感的限制性內切酶的同裂酶接觸一段時間以允許甲基化核酸裂解。在一定條件下將特異性引物加入到核酸樣品中一段時間以允許通過常規方法發生核酸擴增。在使用甲基化敏感性核酸限制性內切酶消化的樣品中擴增產物存在，但使用裂解甲基化和未甲基化兩者的CpG位點的甲基化敏感性核酸限制性內切酶的同裂酶消化的樣品中擴增產物不存在，表明在被檢測的核酸區域中已經發生了甲基化。但是，使用甲基化敏感性限制性核酸內切酶消化的樣品中擴增產物缺少，以及使用裂解甲基化和未甲基化兩者的CpG位點的甲基化敏感性核酸限制性內切酶的同裂酶消化的樣品中擴增產物缺少，表明在測定的核酸中沒有發生甲基化。在本文中，“甲基化敏感核酸內切酶”是包括CG作為其識別位點的一部分并且與C沒有被甲基化(例如，Sma I)時相比C被甲基化時具有變化的活性的限制性內切酶。甲基化敏感的限制性核酸內切酶的非限制性的例子包括MSpI、HpaII、BSSHII、BStn和Notl。這種酶可單獨或者組合使用。其他甲基化敏感的限制性核酸內切酶諸如SacII和EagI可應用于本發明，但不限于這些酶。甲基化敏感核酸內切酶的“同裂酶”是識別與甲基化敏感核酸內切酶相同的識別位點，但裂解甲基化CG和非甲基化CG兩者的限制性核酸內切酶，諸如MspI。本發明的引物被設計成與待擴增位點的每條鏈“大體上”互補，并包括如上所述的適當的G或C核苷酸。這意味著引物必須充分互補以便在允許試劑進行聚合的條件下與它們各自的鏈雜交。本發明的引物在酶鏈式反應擴增過程中采用，所述反應產生相對于涉及的反應步驟的數目指數增長量的目標位點(例如聚合酶鏈反應(PCR))。典型地，一個引物與位點的負㈠鏈互補(反義引物)并且另一個引物與正⑴鏈互補(有義引物)。在通過使用酶諸如大片段DNA聚合酶I (Klenow)和核苷酸延伸之后將引物與變性核酸退火得到新合成的含有目標位點序列的+和-鏈。由于這些新合成的序列也作為模板，變性、引物退火和延伸的重復循環導致由引物限定區域(即目標位點序列)的指數產生。鏈式反應的產物是具有與采用的特定引物末端相對應末端的離散核酸雙螺旋。優選地，擴增方法通過PCR進行，如在這里描述并由本領域普通技術人員使用的那樣。但是，擴增的替代方法已經被描述，并且還可采用諸如實時PCR或者使用等溫酶(isothermal enzyme)的線性擴增。也可使用多重擴增反應。差別甲基化重亞硫酸鹽測序方法的測定測定含有甲基化CpG核酸的另一種方法包括將含有核酸的樣本與修飾未甲基化的胞嘧啶的試劑接觸，通過CpG特異性寡核苷酸引物擴增樣本中的含CpG的核酸，其中寡核苷酸引物區分修飾的甲基化和未甲基化的核酸并檢測甲基化的核酸。擴增步驟是理想而且需要的，但不是必需的。該方法依賴于PCR反應本身來區分修飾(例如化學修飾)的甲基化和未甲基化的DNA。所述方法在美國專利號5，786，146中描述，其內容通過全部引用結合入本文，尤其是當涉及用于甲基化核酸測定的重亞硫酸鹽測序方法時。底物一旦擴增了目標核酸區域，可將核酸與固定在固體上的已知基因探針雜交以支持核酸序列的存在。在本文中，當參照物質、結構、表面或材料使用時，“底物”指的是包括非生物、合成、非存活(nonliving)、平面、球形或者平坦表面的組合物，它們是迄今為止已知的包括特異性結合、雜交或者催化識別位點或者多個不同識別位點或者超過包括表面、結構或材料的不同分子種類的一些不同識別位點。底物可包括，例如但不限于半導體、合成(有機)金屬、合成半導體、絕緣體和換雜劑；金屬、合金、元素(element)、化合物和礦物質；合成、裂解、蝕刻、光刻、印刷、機械加工和微制作玻片(microfabricated slide)、裝置、結構和表 面；工業聚合物、塑料、膜；二氧化硅、硅酸鹽、玻璃、金屬和陶瓷；木頭、紙張、硬紙板、棉花、毛織品、布、紡織和無紡織纖維、材料和織物。用于核酸序列粘附的一些類型的膜對本領域技術人員來說是已知的。這些膜的特定的非限制性的例子包括硝化纖維或者用于基因表達測定的其他膜，諸如聚氯乙烯、重氮化紙(diazotized paper)以及其他從市場購買的膜，諸如GENESCREEN 、ZETAPROBE (Biorad)和NYTRAN 。小珠、玻璃、晶片和金屬基板包括在其中。將核酸與這些物質連接的方法對本領域技術人員來說是公知的。作為替代，篩選可在液相中進行。雜交條件在核酸雜交反應中，用于實現特定嚴謹水平的條件基于待雜交的核酸性質而變化。例如在選擇雜交條件時可考慮核酸的雜交區域的長度、同源程度、核苷酸序列組成(例如GC/AT含量)以及核酸類型(例如RNA，DNA)。其他考慮是核酸之一是否被固定在例如濾紙上。進一步更高嚴謹條件的一個例子如下大約室溫下(雜交條件)的2XSSC/0. 1%SDS ;大約室溫下(低嚴謹條件)的O. 2X SSC/0. 1%SDS ;大約42。C的(中度嚴謹條件)的O. 2X SSC/0. 1%SDS ;以及大約68° C的(高嚴謹條件)的O. IX SSC0可僅僅使用這些條件之一進行洗滌，例如高嚴謹條件，或者按照上面列舉的順序使用每種條件進行洗滌例如10-15分鐘，重復任何或者所有列舉的步驟。但是，如上所述，最佳條件可根據涉及的特定雜交反應而變化，并可根據經驗來確定。一般說來，高度嚴謹條件用于感興趣的探針的雜交。標記感興趣的探針可以被可檢測地標記，例如使用放射性同位素、熒光化合物、生物發光化合物、化學發光化合物、金屬螯合物或者酶標記。本領域普通技術人員將會知道用于與探針結合的其他合適的標記，或者能夠使用常規實驗確定它們。試劑盒根據本發明，提供了一種對于檢測受試者細胞增殖性疾病來說有用的試劑盒。根據本發明的試劑盒包括被間隔(compartmentalized)成可使樣品容納在其中的載體部件(carrier mean);一個或多個容器，所述容器包括一個或多個含有選擇性裂解未甲基化胞嘧啶的試劑的第一容器，含有用于含有CpG的核酸擴增的引物的第二容器，以及含有檢測裂解或者未裂解核酸存在的部件的第三容器。根據本發明預期使用的引物包括在序列號1-20中闡明的那些以及它們的任何功能性組合及片段。功能性組合及片段指的是其被用作引物以檢測在試圖待測的基因組區域上是否出現甲基化的能力。載體部件適于包括一個或多個容器部件，諸如小瓶、管以及類似物，每個容器部件包括在本發明中待用的一個分離元件?？紤]到在本發明的方法中提供的描述，本領域技術人員可以很容易確定在容器部件中需要的試劑的分配。例如，容器部件之一可包括含有甲基化敏感限制性核酸內切酶的容器。還可包括一個或多個含有與感興趣的核酸位點互補的容器部件。另外，還可包括一個或多個含有甲基化敏感限制性核酸內切酶的同裂酶的容器部件。實施例此后，將參照實施例進一步詳細描述本發明。但是應當理解，這些是實力僅僅用于·解釋的目的而不解釋為對本發明的范圍的限制。實施例I:膀胱癌特異性甲基化基因的發現為了篩選在膀胱癌中特異性甲基化的生物標記物，將10位膀胱癌患者和10位正常人中每位的大約20ml尿液在離心機(Hanil Science Industrial Co.，Ltd.，Korea)中以4，200 Xg的速度離心10分鐘分離尿液細胞。棄去上清，并使用5ml的PBS將細胞沉淀物洗滌兩次。使用QIAamp DNA Mini試劑盒(QIAGEN，USA)將基因組DNA從細胞沉淀物中分離出來。將500ng分離的基因組DNA超聲(Vibra Cell, S0NICS)處理，由此構建大約200-300-bp-基因組DNA片段。為了從基因組DNA中僅僅得到甲基化的DNA，使用已知與甲基化DNA結合的甲基結合區(MBD) (Fraga 等人，Nucleic Acid Res.，31:1765-1774，2003)。具體地說，將 2yg的6X His-標記的MBD與500ng大腸桿菌JMllO (No. 2638，生物資源中心，韓國生物科學與生物工藝學研究所)的基因組DNA預培養，然后與Ni-NTA磁性粒子(Qiagen，USA)結合。從正常人和膀胱癌患者的尿液細胞中分離的超聲處理的基因組DNA與在結合緩沖液(IOmMTris-HCKpH 7. 5), 50mM NaCl, ImM EDTA, ImM DTT, 3mM MgCl2,0. l%Triton_X100，5% 甘油，25mg/ml BSA)中存在的粒子在4°C反應20分鐘。然后，使用含有700mM NaCl的500 μ I結合緩沖液將小珠洗滌三次，然后使用QiaQuick PCR純化試劑盒(QIAGEN，USA)分離與MBD結合的DNA。然后，使用基因組DNA擴增試劑盒(Sigma，USA, Cat. No. WGA2)擴增與MBD結合的基因組DNA,且4 μ g擴增的DNA通過Bk)Pi'!m。]、·:: Total基因組標記系統(BioPrime TotalGenomic Labeling system I) (Invitrogen Corp. , USA)將正常人來源的 DNA 使用 Cy3 標記，將來自膀胱癌患者的DNA使用Cy5標記。將正常人的DNA與膀胱癌患者的DNA彼此混合，然后與244K人類CpG微陣列(Agilent，USA)雜交(圖I)。雜交之后，將DNA混合物進行一系列洗滌過程，然后使用Agilent掃描儀進行掃描。來自微陣列圖像的信號值的計算通過使用Feature Extraction程序ν· 9. 5. 3. I (Agilent)計算正常人樣品與膀胱癌患者樣品之間的信號強度的相對差來進行。為了從正常樣品中選擇甲基化的點，將全部Cy3信號值平均，然后具有平均低于10%的信號值的點被認為是正常人樣品中未甲基化的那些。結果，篩選到41，674個點具有低于65的Cy3信號值。為了從41，674個點中選擇膀胱癌患者樣品中的甲基化點，具有大于130的Cy5信號值的點被認為是膀胱癌中的甲基化點。結果，篩選到631個點具有超過130的信號值的Cy5信號值的。通過這些點。227個與啟動子區對應的基因被確定為膀胱癌特異性甲基化基因。從這些基因中，選擇了顯示正常人的甲基化程度與膀胱癌患者的甲基化程度之間的最大相對差的 10 個基因(CDX2，CYPlBl，VSX16，HOXAlI, T, TBX5, PENK, PAQR9, LHX2 以及SIM2)，并使用 MethPrimer (http: //itsa. ucsf. edu/ urolab/methprimer/indexl. html)確定10個基因的啟動子區中的CpG島的存在。這10種基因被確定為膀胱癌診斷的甲基化生物標記物。10種基因及其相對于正常人尿液細胞的膀胱癌患者的尿液細胞的相對甲基化程度在下表I中顯示。表I :用于膀胱癌診斷的10種甲基化生物標記物
用T膀朧癌診斷相對甲基W銀行U 說明的^物標丨己物____坫化a
CDX2NMJMM265Ml"j源異型盒轉求 W —f 211.0
CYPlBlNM^OOO104細胞色-泰 P450,家族 I,―視族 B,多肽 I14.6
VSXlNMJ99425視覺系統I"!源盒 I |"1 系物，CHX10-狀(斑，33.4
HOXAll MM^OOS523 _關盒 AU__14.2
TNMj00318iT,鼠^|1突.變體灰_1"1系物(小鼠)51.4
TBX5NM—080717T-boxS18.7
PENKNMJM)621I__12.7
PAQR9NM^l98504黃體W和 adipoQ 受體家族成(A IX4.1
LHX2NMJMM789 _LiM H源盒 25.8
SIM2 U80456Single-minded homoiog 2(DrosophiIa)9,5通過將CpG微陣列中膀胱癌患者樣品總的平均信號(Cy5)值除以正常人樣品中的平均信號(Cy5)值計算正常樣品與膀胱癌患者樣品之間的相對甲基化程度。實施例2:癌細胞系中生物標記物基因的甲基化測定為了確定10種基因的甲基化狀態，進行了對每個啟動子的重亞硫酸鹽測序。為了使用重亞硫酸鹽將未甲基化的胞嘧啶修飾成尿嘧啶，將總基因組DNA從膀胱癌患者細胞系 RT_4(韓國細胞系銀行(KCLB 30002)，J82 (KCLB 30001)、HTl 197 (KCLB21473)和HT1376(KCLB 21472)中分離出來，并使用EZ DNA甲基化金標試劑盒(ZymoResearch, USA)以重亞硫酸鹽對200ng的基因組DNA進行處理。當使用重亞硫酸鹽處理DNA時，未甲基化的胞嘧啶被修飾成尿嘧啶，并且甲基化的胞嘧啶保持不變。將使用重亞硫酸鹽處理的DNA在20 μ I無菌蒸餾水中洗脫并進行焦磷酸測序。
用于進行10種基因焦磷酸測序的PCR和測序引物使用PSQ測定設計程序(Biotage7USA)設計。用于測定每種基因的甲基化的PCR和測序引物在下表2和3中顯示。表2:引物和條件
權利要求
1.一種診斷膀胱癌的試劑盒，其包括能夠擴增含有膀胱癌標記物基因SIM2-單意同源物2(果蠅)的CpG島的片段的引物。
2.根據權利要求I的診斷膀胱癌的試劑盒，其中所述片段是序列號40所表示的DNA序列。
3.—種診斷膀胱癌 的核酸芯片，其包括能夠與含有膀胱癌標記物基因SM2-單意同源物2 (果蠅)的CpG島的片段雜交的探針。
4.根據權利要求3的診斷膀胱癌的核酸芯片，其中所述片段是序列號40所表示的DNA序列。
5.一種檢測來自臨床樣品的SIM2的啟動子或者外顯子區域的甲基化的方法。
6.根據權利要求5的檢測甲基化的方法，包括測定甲基化的方法，其中所述測定甲基化的方法選自下組PCR、甲基化特異性PCR、實時甲基化特異性PCR，使用甲基化DNA特異性結合蛋白的PCR、定量PCR、焦磷酸測序和二硫鍵測序。
7.根據權利要求5的檢測甲基化的方法，其中所述臨床樣品來自疑似癌癥患者或者待診斷受試者的組織、細胞、血液或者尿液。
全文摘要
本發明涉及使用膀胱癌特異性標記基因的用于診斷膀胱癌的試劑盒和核酸芯片。具體涉及用于診斷膀胱癌的試劑盒和核酸芯片，其可檢測膀胱癌特異性基因的啟動子甲基化，該啟動子或其外顯子區在膀胱癌的轉化細胞中被特異性甲基化。本發明的診斷試劑盒或者核酸芯片的使用能夠在轉化的早期診斷膀胱癌，由此能夠早期診斷膀胱癌，并且與常規方法相比可以更精確迅速的方式診斷膀胱癌。
文檔編號C12Q1/68GK102899415SQ201210394820
公開日2013年1月30日 申請日期2008年12月1日 優先權日2007年11月30日
發明者安成煥, 文英豪, 吳泰正 申請人:基因特力株式會社