專利名稱：抗人cd146的單克隆抗體，包含其的組合物，檢測可溶性cd146的方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學和生物技術領域。具體地說本發明涉及一組抗人⑶146的鼠單克隆抗體，這組抗體能夠在生化、細胞和組織水平特異性識別人源⑶146蛋白。本發明還涉及一種夾心ELISA檢測可溶性CD146的方法，在這種檢測方法中捕獲抗體是本發明中涉及的鼠單克隆抗體，檢測抗體是用生物素標記的發明專利ZL 991075862中涉及的鼠單克隆抗體AA98。
背景技術：
⑶146，又名MUC18，Mel-CAM/MCAM,是一種屬于免疫球蛋白超家族的細胞黏附分子。CD146胞外有五個免疫球蛋白樣結構域(V-V-C2-C2-C2) (HolnessandSimmons 1994)，并被高度糖基化，介導鈣離子非依賴的細胞間相互黏附。⑶146最早發現是黑色素瘤的標志分子，參與黑色素瘤的轉移及惡化(Lehmann，Riethmuller et al. 1989 ；Sers,Kirsch et al. 1993)。CD146 在黑色素腫瘤中的異常高表達增強了腫瘤細胞之間的黏附，并對于腫瘤的侵襲和轉移非常重要(Johnson，Rothbacheret al. 1993)。研究表明，⑶146的表達與黑色素瘤細胞的轉移能力直接相關，而在不表達CD146的黑色素瘤細胞中過量表達CD146可以顯著增強腫瘤細胞的侵襲和轉移能力(Bani，Rak et al. 1996 ；Shih, Speicher et al. 1997 ；Xie, Luca et al. 1997)。此外，CD 146 也表達在少量的正常組織中，比如平滑肌，血管內皮和滋養層等(Shih 1999)。同時，⑶146也被廣泛認為是血管內皮細胞的特異性標志分子(Bardin，Franceset al. 1996 ；Bardin, Anfosso et al. 2001)。在之前的研究中，抗人CD146抗體被應用檢測血液中的循環內皮細胞(George, Poncelet et al. 1991 ；Bardin, George et al. 1996 ；Solovey, Gui et al. 2001)。由于這一特征,在伴有內皮損傷、脫落現象的某些疾病中，⑶146可作為疾病進程的參考指標。另有研究表明⑶146分子還表達于單核細胞，有報道在激活的T淋巴細胞上也有高表達(Pickl，Majdic et al. 1997)。像其它很多黏附分子一樣，體內CD146分子以細胞膜和可溶形式(soluble CD146，sCD146)存在(Neidhart，Wehrliet al. 1999 ；Bardin, Moal et al. 2003)。研究表明sCD146在風濕性關節炎滑液以及慢性腎衰竭患者的血清中的表達水平明顯高于正常人?？谷薈D146抗體在動物實驗中體現出了很強的抑制腫瘤生長的治療效果。Mills等開發的抗CD146全人抗體，ABX-MAl在裸鼠模型中顯著地抑制黑色素腫瘤的生長、侵襲以及向肺部的轉移(Mills,Tellez et al. 2002)。發明專利ZL 991075862中所述，開發的抗CD146鼠單克隆抗體AA98具有抑制腫瘤血管生成的作用，并在多種裸鼠荷瘤實驗中明顯抑制腫瘤(例如肝癌、胰腺癌等)的生長(Yan，Lin et al. 2003)。進一步的研究還揭示了AA98的抑制腫瘤血管生成的機制是通過抑制MAPK磷酸化以及NF κ B活化實現的(Bu，Gaoet al. 2006)。雖然抗人源⑶146的抗體已有一些報道，但是這些抗體對不同的血管內皮組織卻有著不同的結合活性。例如S-endol能夠結合各種類型的血管的內皮細胞，包括動脈、細動脈、靜脈、小靜脈、毛細血管、高內皮微靜脈和淋巴血管系統等(George，Poncelet etal. 1991)。而另一株抗CD146抗體MUC18只結合毛細血管和高內皮微靜脈(Kuzu，Bicknellet al. 1993)。S-endol結合胳帶靜脈內皮組織而MUC18不結合(Bardin, Frances etal. 1996)。此外，P1H12能夠同時結合腫瘤和正常組織的血管內皮細胞(St Croix7Rago etal. 2000)，而AA98卻特異性的結合腫瘤組織的血管內皮細胞(Yan, Lin et al. 2003)。這些證據表明，很可能不同的抗體結合表位在不同的組織和微環境中的暴露情況有所差異。因此，針對CD146蛋白上不同表位開發抗體，并研究其對于不同組織的結合能力，對于闡明⑶146在血管內皮細胞上的功能非常必要。

發明內容
本發明利用天然純化的CD146蛋白免疫小鼠，獲得雜交瘤細胞。用ELISA的方法篩選與重組表達的⑶146蛋白胞外區有強結合能力的抗體，獲得六株抗體，分別命名為AA1、AA2、AA3、AA4、AA5和AA7，同時獲得分泌這些抗體的雜交瘤細胞，依次是8E8、8F4、A5、GlO、H5①和H5②。這六株抗體均屬IgGl，K亞型。ELISA和免疫印跡的實驗證實了這些抗體和⑶146分子的特異性結合。利用重組表達的⑶146蛋白胞外不同的結構域以及免疫印跡的方法，證實AAl和AA2識別表位(序列為SEQ ID NO : I的人⑶146序列中的位置24-128)位于第一個IgV結構域，而AA3、AA4、AA5和AA7識別表位(序列為SEQ ID NO 1的人⑶146序列中的位置335-400)位于第二個IgC2結構域。因此，這六株抗體依照不同的抗原表位分成兩類V1類(包括 AAl 和 AA2)和 C2-2 類(包括 AA3、AA4、AA5 和 AA7)。細胞免疫熒光，免疫沉淀及免疫組化實驗發現Vl類抗體能夠在分子、細胞及組織水平同時識別天然構象和變性的CD146蛋白質，而C2-2類抗體只識別變性的CD146蛋白質。這證實了不同的抗原表位在不同情況下的暴露有所不同。本發明同時利用Vl類抗體，如AAl和生物素標記的發明專利ZL991075862中涉及的鼠單克隆抗體AA98，開發了一套夾心ELISA的方法，用于檢測溶液和體液中可溶性0)146分子。相比之前提供的商業化檢測方法報道(CyQuant ELISA assay kit,Bioxytex,Marseille, France)的雙抗夾心ELISA (靈敏度為10ng/ml),本發明的夾心ELISA方法靈敏度提高了一個數量級，達到lng/ml。此方法能夠用于人血液及腦脊液中可溶性⑶146的檢測，并在CD146表達異常的病癥中具有臨床診斷應用價值。運用本發明中的方法，發現在系統性血管炎等自身免疫病中，病人血清中的CD146分子含量顯著升高，對于臨床診斷具有指導意義和應用價值。具體地，本發明涉及一種人⑶146抗原表位，其氨基酸序列為SEQ IDNO 24或SEQID NO 25 所示。在一個實施方案中，本發明涉及一種抗人CD146抗體，其特征在于其能夠特異性識別上述人⑶146抗原表位。優選地,所述抗人⑶146抗體特征在于包括抗體重鏈和抗體輕鏈，
其中所述抗體重鏈包括作為⑶R的由SEQ ID NO 26的氨基酸序列組成的⑶R1，由SEQ ID NO 27的氨基酸序列組成的CDR2和由SEQ ID NO 28的氨基酸序列組成的CDR3組成，所述抗體輕鏈包括作為⑶R的由SEQ ID NO 29的氨基酸序列組成的⑶R1，由SEQID NO 30的氨基酸序列組成的⑶R2和由SEQ IDNO 31的氨基酸序列組成的⑶R3組成。更優選地，所述抗體的重鏈由SEQ ID NO :32的氨基酸序列組成，輕鏈由SEQ IDNO 33的氨基酸序列組成。在另一個實施方案中，本發明涉及一種抗人⑶146抗體，特征在于包括抗體重鏈和抗體輕鏈，其中所述抗體重鏈包括作為⑶R的由SEQ ID NO 34的氨基酸序列組成的⑶R1，由SEQ ID NO 35的氨基酸序列組成的CDR2和由SEQID NO 36的氨基酸序列組成的CDR3組成，所述抗體輕鏈包括作為⑶R的由SEQ ID NO 37的氨基酸序列組成的⑶Rl，由SEQID NO 38的氨基酸序列組成的⑶R2和由SEQ IDNO 39的氨基酸序列組成的⑶R3組成。優選地，所述抗體的重鏈由SEQ ID NO 40的氨基酸序列組成，輕鏈由SEQ ID NO 41的氨基酸序列組成。在本發明的另一方面，還涉及上述抗人CD146的抗體在制備用于治療腫瘤的藥物組合物中的應用。優選地，所述腫瘤是黑色素瘤、肝癌，胰腺癌。在本發明的另一個方面，還涉及上述抗人⑶146的抗體在制備用于靶向⑶146的人體腫瘤的成像定位診斷的診斷劑中的應用。在另一個方面，本發明還涉及一種組合物，例如用于治療腫瘤的藥物組合物，其包含上述任一方面的抗人⑶146抗體，和藥用載體。用于本文時，“藥用載體”包括生理適合的任何和所有的溶劑、分散介質、包衣劑、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延緩試劑等。優選地，所述載體適合于靜脈內的、肌內的、皮下的、腸胃外的、脊柱的或表皮的施用(例如，通過注射或灌輸)。通過許多本領域已知的方法可以施用本發明的組合物。如本領域技術人員將理解，施用路徑和/或模式將取決于所需結果而變化。為了通過某些施用路徑來施用本發明化合物，用一種材料來包被化合物，或與一種材料共同施用化合物以預防其失活可能是必需的。例如，可以以適當載體，例如脂質體或稀釋劑來給受試者施用所述化合物。藥用稀釋劑包括鹽水和水性緩沖溶液。藥用載體包括用于即時制備滅菌的可注射溶液或分散體的滅菌水溶液或分散體和滅菌粉末。將這些介質和試劑用于藥用活性物質的應用為本領域所知。在用于本文時，短語“腸胃外的施用”和“經腸胃外施用”表示除腸內的和局部施用以外的通常通過注射的施用模式，包括但不局限于，靜脈內的、肌內的、動脈內的、鞘內的、囊內的、眶內的、心內的、皮內的、腹膜內的、經氣管的、皮下的、表皮下的、關節內的、囊下的、蛛網膜下的、脊柱內的、硬膜外的、胸骨內的注射和灌輸。無論選擇何種施用路徑，通過為本領域技術人員已知的常規方法，將可以以適合的水合形式和/或本發明的藥物組合物形式使用的本發明的化合物配制成可藥用劑型。對于特定患者、組合物和施用方式，本發明藥物組合物的活性成分的實際劑量水平可以變化以獲得有效實現理想的治療反應而不會對患者具有毒性的活性成分的量。選定的劑量水平將取決于許多藥物動力學因素，其包括所用的本發明特定組合物的活性，施用的路徑，施用的時間，所用的特定化合物的排泄率，治療的持續時間，與所用的特定化合物結合使用的其它藥物、化合物和/或物質，待治療的患者的年齡、性別、體重、疾病狀況、一般健康和以前的疾病史和醫學領域眾所周知的類似因素。所述組合物必須是無菌且流體的，以到達組合物可以通過注射器進行傳遞的程度。除了水之外，載體優選是等滲緩沖鹽溶液。在另一個方面，本發明還涉及分泌抗人CD146抗體的雜交瘤細胞株，保藏號分別為 CGMCC NO 2310 和 CGMCC NO :2311。在另一個方面，本發明還涉及編碼能與下面定義的各個另外抗體鏈一起裝配的多肽的核酸，其中所述多肽是下述多肽的任一種a)抗體重鏈，其為上述所定義的抗體重鏈之一；b)抗體輕鏈，其為上述所定義的抗體輕鏈之一。同時，本發明還涉及包括按照權利要求11的核酸的表達載體，其能夠在原核或真核宿主細胞中表達所述核酸。以及包括所述表達載體的原核或真核宿主細胞。在本發明的另一個方面，還涉及一種制備結合人CD146的抗體的方法，其特征在于在原核或真核宿主細胞中表達上述編碼抗體重鏈的核酸和編碼抗體輕鏈的核酸，并且從所述細胞中回收所述多肽。在本發明的另一個方面，涉及一種檢測人⑶146的方法，其利用上述的抗人⑶146抗體，通過酶聯免疫吸附法進行。優選地，所述酶聯免疫吸附法是夾心酶聯免疫吸附法，其中將上述的抗人CD146抗體的一種或多種作為捕獲抗體，將中國專利ZL 991075862中的鼠單克隆抗體AA98作為檢測抗體。更優選地，所述人⑶146存在于體液中。甚至更優選地，所述體液是組織液，血清，淋巴液或腦脊液。所述體液可采自系統性血管炎、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化癥以及格林巴利綜合癥等自身免疫性疾病病人或/和慢性腎衰等病癥的病人。在本發明的另一個方面，還涉及所述抗人CD146的抗體的衍生物，其中所述衍生物為所述抗體與生物標記物(如生物素、HRP、堿性磷酸酶、FITC、PE、Cy3、Cy5等常規熒光染料、納米磁珠等納米材料)、抗腫瘤藥物(如現有技術已知的卡鉬、順鉬、五氟尿喃唳等)、毒素(如蓖麻毒素、淋巴毒素等)、放射活性劑(如m碘、9°釔、放射性銅等)結合的產物。本領域的普通技術人員基于說明書關于抗人CD146抗體的教導，結合現有技術的知識，完全可以毫無困難地獲得上述衍生物，進而確定衍生物的效果。本發明的創新點在于(I)研制了一組針對人CD146蛋白的鼠單克隆抗體；(2)揭示了這組抗⑶146抗體識別的抗原表位，并證實了識別不同表位的抗體，在分子、細胞及組織水平上對于⑶146蛋白的結合有顯著差別；(3)開發了一種高靈敏度的夾心ELISA方法用于可溶性CD146分子的檢測。


圖I :AA1-AA7特異識別重組人源⑶146分子胞外區段蛋白。圖2 :各種⑶146胞外重組蛋白示意圖。
圖3 AA1-AA5和AA7的抗原表位鑒定。上圖是D1-D5的蛋白電泳圖。下圖是分別利用AA1-AA5和AA7進行免疫印跡實驗檢測其與D1-D5的結合能力。圖4 AA1-AA5和AA7在免疫印跡中識別還原和非還原⑶146蛋白。泳道1_6是非還原的A375細胞裂解液，泳道7-12是還原的A375細胞裂解液。圖5 AA1-AA5和AA7用于流式細胞術的⑶146分子檢測。圖中mlgG作為陰性對照。只有AAl和AA2識別活細胞中的⑶146分子。圖6 AA1-AA5和AA7用于細胞免疫熒光實驗檢測細胞膜上⑶146。AA98作為實驗的陽性對照，mlgG作為實驗的陰性對照。只有AAl和AA2以及AA98能夠結合細胞膜上⑶146，箭頭僅示其中之一。圖7 AA1-AA5和AA7用于免疫沉淀實驗捕獲細胞裂解液中的⑶146。泳道1_7是分別用mlgG，AA1-5及AA7進行免疫沉淀捕獲的蛋白復合物，泳道8是細胞裂解上清，作為陽性對照，用AA98進行免疫印跡檢測。圖8 AA1-AA5和AA7進行冰凍切片免疫組化實驗檢測組織水平的⑶146分子。AA98作為實驗的陽性對照，CD31用于標記血管內皮細胞(如箭頭所示)。如箭頭所示，只有AAl和AA2能夠結合冰凍切片上組織水平的⑶146分子。圖9 :夾心ELISA檢測5ng/ml_320ng/ml標準樣品的標準曲線。圖10 :夾心ELISA檢測5ng/ml_80ng/ml標準樣品的標準曲線,及擬合方程。圖11 HMV6g載體的圖譜，其含有ΜΒΡ-His標簽。雜交瘤細胞株8E8和GlO (其分別分泌抗體AAl和AA4)于2007年12月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，中國，北京，海淀區中關村北一條 13 號)，保藏號分別為 CGMCC No. 2310 和 CGMCC No. 2311。
具體實施例方式下面通過實施例詳細描述本發明。本領域的普通技術人員可以理解，下述實施例僅是用于舉例說明的目的。本發明的精神和范圍由后附的權利要求所限定。實施例I :單克隆抗體AA1-AA5和AA7的制備及鑒定。應用雜交瘤技術(KohlerandMilstein1975 ；Yeh, Hellstrom et al. 1979 ；Yeh,Hellstrom et al. 1982)產生并篩選獲得抗體AA1-AA6和AA7。簡述如下從人臍帶靜脈內皮細胞中分離天然⑶146蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示，核苷酸序列如SEQ IDN0:2所示)，按照(Yan，Lin et al. 2003)描述的單克隆抗體AA98抗原純化方法純化，將其作為免疫原對BALB/C小鼠(北京實驗動物中心)進行免疫接種，每次腹膜內注射100 μ g蛋白/鼠，每兩星期一次，共三次。取脾細胞之前加強免疫一次，腹膜內注射IOOyg蛋白/鼠。加強免疫之后三天，取脾臟，并將脾細胞懸浮于RPMI培養基中。在聚乙二醇(PEG)存在下，將脾細胞和SP2/0-Agl4鼠骨髓瘤細胞(ATCC)進行融合，并用HAT選擇性培養基對雜交瘤進行篩選。運用酶聯免疫吸附(ELISA)的方法篩選能夠大量產生高親和力的抗人CD146抗體的雜交瘤細胞克隆。使用重組表達的⑶146分子胞外區蛋白，rh⑶146(序列為SEQ ID NO:I的人⑶146序列中的位置氨基酸24-552)作為包被抗原，檢測雜交瘤細胞培養上清。具體的做法是，首先在ELISA板上過夜包被50 μ I I μ g/ml rh⑶146蛋白，用PBS洗三遍。加入2%牛血清白蛋白(Ameresco)封閉I小時。然后先后加入分泌抗體的雜交瘤培養上清、酶標抗體(I : 5000 稀釋的羊抗鼠 HRP, Santa Cruz)和底物(200ng/ml TMB (Ameresco),O. 03% H2O2 (北京化學試劑公司)，pH4. 5)，進行ELISA篩選。通過三輪篩選獲得了六個分泌高親和力抗體的雜交瘤細胞株8E8、8F4、A5、G10、H5①和H5②，其分泌的抗體分別對應命名為AA1、AA2、AA3、AA4、AA5和AA7。將雜交瘤細胞株8E8和GlO (其分別分泌抗體AAl和AA4)于2007年12月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，中國，北京，海淀區中關村北一條13號)，保藏號分別為CGMCC No. 2310和CGMCC No. 2311。而雜交瘤細胞株AA6是ELISA篩選時的陰性雜交瘤克隆，與CD146結合能力很弱。分別大量培養擴增雜交瘤細胞8E8、8F4、A5、G10、H5①和H5②，分別收集含有AA1、AA2、AA3、AA4、AA5和AA7抗體的培養上清用于抗體功能鑒定。另外分別將雜交瘤細胞8E8、8F4、A5、G10、H5①和H5②用無血清RPMI-1640培養基制成細胞懸液，用于制備抗體腹水。腹水的制備方法簡述如下六周齡BALB/C小鼠腹腔注射降植烷(Sigma)O. 5ml/只。10天后，將雜交瘤細胞懸液IxlO6個/ml接種于BALB/C小鼠腹腔，O. 5ml/只，約十天后，收集腹水，離心取上清。通過蛋白A親和層析，從培養上清或腹水中純化單克隆抗體AA1、AA2、AA3、AA4、AA5和AA7。將純化單克隆抗體無菌過濾，并冷藏或冷凍保存。應用BD Pharmingen公司鼠抗體亞型鑒定試劑盒(目錄號550487),將發明專利ZL991075862中所述AA98(下同)作為實驗陽性對照，ELISA方法鑒定出抗體AA1、AA2、AA3、AA4、AA5和AA7均屬于IgGl亞型,如表I所不。表I 抗體 AAl、AA2、AA3、AA4、AA5、AA7 和 AA98 抗體分型
權利要求
1.SEQ ID NO :25所不的氣基酸序列。
2.一種抗人CD146抗體，其特征在于其能夠特異性識別權利要求I的氨基酸序列，其由保藏號是CGMCC NO. 2311的雜交瘤細胞株分泌。
3.權利要求2的抗人CD146的抗體在制備用于治療腫瘤的藥物組合物中的應用，其中所述腫瘤是黑色素瘤、肝癌，胰腺癌。
4.權利要求2的抗人CD146的抗體在制備用于靶向CD146的人體腫瘤的成像定位診斷的診斷劑中的應用。
5.一種用于治療腫瘤的藥物組合物,其包含權利要求2的抗人CD146抗體和藥用載體。
6.分泌抗人⑶146抗體的雜交瘤細胞株，保藏號分別為CGMCCNO :2311。
7.一種編碼權利要求2所述抗人⑶146抗體的核酸。
8.—種包括按照權利要求7的核酸的表達載體，其能夠在原核或真核宿主細胞中表達所述核酸。
9.一種原核或真核宿主細胞,其包括按照權利要求8的載體。
10.一種制備結合人CD146的抗體的方法，其特征在于在原核或真核宿主細胞中表達按照權利要求7的編碼抗體重鏈的核酸和編碼抗體輕鏈的核酸，并且從所述細胞中回收所述多肽。
11.權利要求2的抗人CD146抗體在制備用于檢測人CD146的診斷劑中的應用，其中所述檢測是通過酶聯免疫吸附法進行的。
12.權利要求11的應用，其中所述酶聯免疫吸附法是夾心酶聯免疫吸附法，其中將權利要求2的抗人CD146抗體的一種或多種作為捕獲抗體，將中國專利ZL 991075862中的鼠單克隆抗體AA98作為檢測抗體。
13.權利要求11或12的應用，其中所述人CD146存在于人體液中。
14.權利要求12的應用，其中所述體液是組織液，血清，淋巴液或腦脊液。
15.權利要求2的抗人CD146的抗體的衍生物，其中所述衍生物為所述抗體與生物標記物、抗腫瘤藥物、毒素、放射活性劑結合的產物，其中所述生物標記物是生物素，辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，異硫氰酸熒光素，藻紅素，Cy3，Cy5或納米磁珠，所述抗腫瘤藥物是卡鉬，順鉬或五氟尿嘧啶，毒素是蓖麻毒素或淋巴毒素，放射活性劑是131碘，9°釔或放射性銅。
全文摘要
本發明是利用生物技術研制出的一組抗人CD146分子及建立的高靈敏度夾心ELISA檢測可溶性CD146的方法。本發明包括抗人CD146鼠單克隆抗體AA1、AA2、AA3、AA4、AA5和AA7，利用抗體組合及夾心ELISA特異性檢測可溶性CD146的方法。這組抗體能夠在分子、細胞和組織水平特異性識別人源CD146，并基于其識別不同表位而分成兩類。由抗體AA1與另一株抗人CD146鼠單抗AA98組合的夾心ELISA方法能夠檢測到每毫升鈉克量級可溶性CD146。這些抗體及此種檢測手段將成為基礎研究或臨床應用中有效的檢測或診斷的工具及方法，同時也將為與CD146相關疾病的靶向治療提供良好載體。
文檔編號C12N15/63GK102936283SQ20121039485
公開日2013年2月20日 申請日期2008年1月31日 優先權日2008年1月31日
發明者閻錫蘊, 張瑩, 鄭超固, 楊東玲, 馮靜, 盧迪 申請人:中國科學院生物物理研究所