專利名稱：利用固定化酶合成膽紅素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)與生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及利用固定化酶促合成膽紅素的方法。
背景技術(shù)：
:膽紅素是人膽汁中的主要色素，呈橙黃色。膽紅素具備多種藥理作用，是制造人工牛黃的主要原料。藥理實驗證明，它對W256瘤有較好的抑制作用；它對乙型腦炎病毒的滅活率，抑制指數(shù)比去氧膽酸和膽酸高I 1.5倍；它還是一種有效的肝臟疾病的治療藥物，在不破壞肝組織的情況下，有增殖新細(xì)胞的作用，可治療血清肝炎、肝硬變等病。此外，膽紅素具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)驚、解熱、降壓等作用。主要用于人工牛黃的原料及藥品、保健品、化妝品等行業(yè)。牛黃是牛的膽結(jié)石，在我國藥用已有二千多年歷史，是世界上公認(rèn)的珍貴稀有藥料，以牛黃配制的中成藥方180多個品種，如日本的救心丹，我國的安宮牛黃丸等。目前市場上的牛黃有天然牛黃、人工合成牛黃及人工培育牛黃。市場上以人工牛黃為主。人工牛黃的純膽紅素含量只有0.7%。人工牛黃粉膽紅素含量太低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于天然牛黃35%的含量標(biāo)準(zhǔn)，功效大打折扣是可想而知的。假定人工牛黃粉膽紅素含量按35%的膽紅素配制而成本增加不多，則人工牛黃市場會更大。按常規(guī)方法生產(chǎn)膽紅素(即以動物如豬膽為材料經(jīng)化學(xué)方法提取)，由于技術(shù)門檻太低，毛利潤率極低，國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)眾多，如四川什邡市康源植物原料有限公司、福建瑞國藥業(yè)有限公司/哈爾濱瑞國醫(yī)藥有限公司、四川菲德力制藥有限公司、安徽科寶生物工程有限公司等。目前，膽紅素是來自膽汁，一公斤膽紅素約需5萬個豬膽，故膽紅素成本較高，因而售價也高。酶催化生產(chǎn)高純度膽紅素之綜合成本較低，故經(jīng)濟(jì)效益極佳
發(fā)明內(nèi)容
:本發(fā)明的目的在于提供一種利用固定化酶促合成膽紅素的方法。本發(fā)明的另一目的還在于提供含有編碼本發(fā)明所述的血紅素加氧酶和膽綠素還原酶的基因序列。本發(fā)明的再一目的在于同時利用固定化血紅素加氧酶和固定化膽綠素還原酶催化，以血紅素和氧氣為底物，在氧化型輔酶II輔助下生產(chǎn)膽紅素。為實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明人進(jìn)行了大量深入的實驗，通過克隆較佳的血紅素加氧酶和膽綠素還原 酶的基因至適當(dāng)?shù)妮d體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，本發(fā)明的血紅素加氧酶和膽綠素還原酶在大腸桿菌中皆高表達(dá)。表達(dá)的重組蛋白菌體未破菌直接固定化、或破菌后粗蛋白直接固定化、又或破菌后粗蛋白經(jīng)純化得純蛋白再固定化，進(jìn)而形成固定化酶，并獲得了高活力的固定化血紅素加氧酶和高活力的固定化膽綠素還原酶，該固定化血紅素加氧酶和固定化膽綠素還原酶能以血紅素和氧氣為底物，在氧化型輔酶II輔助下生產(chǎn)膽紅素。
本發(fā)明的血紅素加氧酶是來源于Clostridium tetani E88。序列表中的SEQ IDN0.:2代表本發(fā)明的血紅素加氧酶的氨基酸序列。本發(fā)明的膽綠素還原酶是來源于Synechocystis sp.PCC 6803。序列表中的SEQ ID N0.:4代表本發(fā)明的膽綠素還原酶的氨基酸序列。本發(fā)明的酶固定化載體是選擇了環(huán)氧型載體LX-3000，還可選用本領(lǐng)域的其它酶固定化載體，如傳統(tǒng)的無機(jī)載體材料二氧化硅、活性炭、玻璃珠等，再如有機(jī)高分子載體大孔型聚N-氨乙基丙烯酰胺-聚乙烯等。通過與該類型載體結(jié)合，本發(fā)明獲得了高活力的固定化血紅素加氧酶和固定化膽綠素還原酶，該二酶以血紅素和氧氣為底物，在氧化型輔酶II輔助下高轉(zhuǎn)化率(大于80% )生產(chǎn)膽紅素。附圖的簡要說明:


圖1A:重組的血紅素加氧酶(粗提蛋白)之聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果，圖中右邊條帶M并配有數(shù)字(單位是“KD”)是蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，左邊主帶是重組的血紅素加氧酶(粗提蛋白)，具體參見實施例3;圖1B:重組的膽綠素還原酶(粗提蛋白)之聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果，圖中右邊條帶M并配有數(shù)字(單位是“KD”)是蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，左邊主帶是重組的膽綠素還原酶(粗提蛋白)，具體參見實施例4;
具體實施方式
:利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，先分別構(gòu)建含有編碼血紅素加氧酶和膽綠素還原酶的基因的載體質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，無須誘導(dǎo)培養(yǎng)，將表達(dá)的血紅素加氧酶和膽綠素還原酶提取并固定于適當(dāng)?shù)沫h(huán)氧型酶載體，從而獲得高活力的固定化血紅素加氧酶和高活力的固定化膽綠素還原酶。該固定化血紅素加氧酶和固定化膽綠素還原酶雙酶合力催化，以血紅素和氧氣為底物，在氧化型輔酶II輔助下生產(chǎn)膽紅素。本發(fā)明所獲得的血紅素加氧酶和膽綠素還原酶基因可以在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞胞內(nèi)表達(dá)，也可采用本領(lǐng)域已知的任何其它適當(dāng)方法實現(xiàn)在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞胞外表達(dá)。在本發(fā)明制備血紅素加氧酶和膽綠素還原酶的方法中，所述載體的宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。所述原核細(xì)胞包括但不限于大腸桿菌(如HB101，BL21，JM109，DH5a)、凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽胞桿菌和鏈霉菌。所述真核細(xì)胞包括但不限于釀酒酵母和畢赤巴斯德酵母(如畢赤巴斯德酵母GS115/9891)。本發(fā)明用于克隆血紅素加氧酶和膽綠素還原酶基因的載體包括但不限于pRSET系列、pGEM_T系列等。本發(fā)明用于固定化血紅素加氧酶和膽綠素還原酶基因的載體包括但不限于環(huán)氧型載體等。在本申請文本中所用的氨基酸三字母或單字母表達(dá)方式，采用IUPAC規(guī)定的氨基酸代碼(Eur.J.Biochem.，138:9_37，1984)。下列實施例僅用于說明本發(fā)明而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。實施例1:血紅素加氧酶編碼基因的擴(kuò)增與克隆
根據(jù)基因庫(GenBank NC_004557)基因序列設(shè)汁引物H0-F:5’ AACATATGTCAATAATTAATAATTATAT3’ 和 HO-R:5’ AAGGCGCGCCCTATTTAAATCTATCAAATTCT3’。用引物對HO-F和HO-R從Clostridium tetani E88中擴(kuò)增血紅素加氧酶編碼基因。擴(kuò)增條件為:20mMTris-HCl (pH8.8), IOmM KCl, IOmM(NH4)2SO4, 2mM MgSO4,0.1%Triton Χ_100，50μΜ dATP,50yM dTTP,50yM dCTP,50yM dGTP，400nM 引物 HO-F，400nM引物HO-R, 1.0 U Pfu DNA 聚合酶(Promega,USA),用接種環(huán)挑取少許Clostridium tetaniE88菌體，再用無菌水調(diào)反應(yīng)體積至50 μ I。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序為:95°C 3分鐘，35圈循環(huán):95°C 50秒、50°C 30秒和72°C I分鐘，最后72°C 10分鐘。擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeI和AscI酶切后與經(jīng)同樣限制性內(nèi)切酶NdeI和AscI酶切的載體pRSET-A(源自Invitrogen，USA)連接，得質(zhì)粒pRSET-HO。經(jīng)DNA測序，確定該被克隆的血紅素加氧酶的核苷酸序列，具體示于序列表中序列1，相應(yīng)的氨基酸序列為序列表中的序列2。實施例2:膽綠素還原酶編碼基因的擴(kuò)增與克隆根據(jù)基因庫(GenBank NC_000911)基因序列設(shè)計引物BR-F:5’ AACATATGTCTGAAAATTTTGCAGTT3’ 和 BR R:5’ AAGGCGCGCCCTAATTTTCAACCTTATATCCA3’。用引物對BR-F和BR-R從Synechocystis sp.PCC 6803中擴(kuò)增膽綠素還原酶編碼基因。擴(kuò)增條件為:20mMTris-HCl (pH8.8), IOmM KCl, IOmM(NH4)2SO1^mM MgSO4,0.1%Triton Χ_100，50μΜ dATP,50yM dTTP,50yM dCTP,50yM dGTP，400ηΜ 引物 BR-F，400ηΜ引物 BR-R, 1.0 U Pfu DNA 聚合酶(Promega, USA),用接種環(huán)挑取少許 Synechocystissp.PCC 6803菌體，再用無菌水調(diào)反應(yīng)體積至50 μ I。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序為:95°C 3分鐘，35圈循環(huán):95°C 50秒、50°C 30秒和72°C I分鐘，最后72°C 10分鐘。擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdcI和AscI酶切后與經(jīng)同樣限制性內(nèi)切酶NdeI和AscI酶切的載體pRSET-A(`源自Invitrogen，USA)連接，得質(zhì)粒pRSET-BR。經(jīng)DNA測序，確定該被克隆的膽綠素還原酶的核苷酸序列，具體示于序列表中序列3，相應(yīng)的氨基酸序列為序列表中的序列4。實施例3:血紅素加氧酶的提取血紅素加氧酶的提取與純化主要參考Hong-Bo Hu, et al.Bioprocess BiosystEng.2007，30:87_90。具體過程如下:將含血紅素加氧酶基因的質(zhì)粒pRSET-HO轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞E.coli HB101，在Luria broth(LB)平板(含100mg/L卡那霉素)上37°C培養(yǎng)24小時。接種單個克隆于5毫升LB液體培養(yǎng)基(含100mg/L卡那霉素)中于30°C培養(yǎng)20-24小時。離心收集菌體，并懸浮于I毫升IOOmM Tris鹽酸緩沖液(pH7.5)中。然后用超聲波裂解細(xì)菌細(xì)胞。離心(10°C, 17, 800g, 10分鐘)并收集上清液，即為粗提蛋白(或稱粗提物)。圖1A顯示了重組的血紅素加氧酶粗提蛋白之聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果，表明血紅素加氧酶(目標(biāo)帶大小約為26.5kD)在大腸桿菌HB101中有相當(dāng)高的表達(dá)水平。實施例4:膽綠素還原酶的提取膽綠素還原酶的提取與純化主要參考Aya ffatanabe, et al.Acta Cryst.2011,F67，313-317。具體過程如下:將含膽綠素還原酶基因的質(zhì)粒pRSET-BR轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞E.coli HB101，在Luria broth (LB)平板(含100mg/L卡那霉素)上37°C培養(yǎng)24小時。接種單個克隆于5毫升LB液體培養(yǎng)基(含100mg/L卡那霉素)中于30°C培養(yǎng)20-24小時。離心收集菌體，并懸浮于I毫升IOOmM Tris鹽酸緩沖液(pH7.5)中。然后用超聲波裂解細(xì)菌細(xì)胞。離心(10°C, 17, 800g, 10分鐘)并收集上清液，即為粗提蛋白(或稱粗提物)。圖1B顯示了重組的膽綠素還原酶粗提蛋白之聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果，表明膽綠素還原酶(目標(biāo)帶大小約為36.6kD)在大腸桿菌HB101中有較高表達(dá)水平。實施例5:血紅素加氧酶活性的測定配制底物溶液:含50 μ M的血紅素、50 μ M的抗壞血酸和IOOmM Tris鹽酸緩沖液，調(diào)pH至7.5。取底物溶液400微升，然后加入100微升血紅素加氧酶粗提蛋白，于30°C進(jìn)行30分鐘反應(yīng)。離心(l(TC，17，8(K)g，15分鐘)并收集上清液。通過高壓液相色譜(HPLC)測定所得上清液中膽綠素的含量。用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定酶蛋白濃度。一單位酶比活性定義為在上述條件下每分鐘轉(zhuǎn)化一微摩爾血紅素為膽綠素所需之酶量。血紅素加氧酶(粗提蛋白)特異性活力為0.6U/mg。實施例6:膽綠素還原酶活性的測定配制底物溶液:含20mM的膽綠素、5mM NADP、50mM磷酸鉀緩沖液和終濃度為IOmM之MgCl2,調(diào)pH至7.5。取底物溶液400微升，然后加入100微升膽綠素還原酶粗提蛋白，于37°C進(jìn)行30分鐘反應(yīng)。離心(l(TC，17，8(K)g，15分鐘)并收集上清液。通過高壓液相色譜(HPLC)測定所得上清液中膽紅素的含量。用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定酶蛋白濃度。一單位酶比活性定義為在上述條件下每分鐘轉(zhuǎn)化一微摩爾膽綠素為膽紅素所需之酶量。結(jié)果，膽綠素還原酶(粗提蛋白)特異性活力為0.2U/mg。實施例7:血紅素加氧酶固定化取血紅素加氧酶粗提蛋白，用洗酶緩沖液(0.02M Tris-HCl/0.001MEDTA,pH7.0溶液)稀釋至蛋白含量5 10mg/ml。將酶稀釋液與PB溶液(2.0mol/L磷酸二氫鉀，pH7.5)等體積混合，加入環(huán)氧型固定化酶載體LX-3000 (10毫克酶/克載體),于搖床(轉(zhuǎn)速IOOrpm)中25V反應(yīng)20小時。反應(yīng)完成后用濾袋過濾，用洗酶緩沖液清洗5 6次，得到固定化血紅素加氧酶。實施例8:膽綠素還原酶固定化取膽綠素還原酶粗提蛋白，用洗酶緩沖液(0.02M Tris-HCl/0.001MEDTA,pH7.0溶液)稀釋至蛋白含量5 10mg/ml。將酶稀釋液與PB溶液(2.0mol/L磷酸二氫鉀，pH7.5)等體積混合，加入環(huán)氧型固定化酶載體LX-3000 (10毫克酶/克載體),于搖床(轉(zhuǎn)速IOOrpm)中25V反應(yīng)20小時。反應(yīng)完成后用濾袋過濾，用洗酶緩沖液清洗5 6次，得到固定化膽綠素還原酶。實施例9:用固定化血紅素加氧酶和膽綠素還原酶制備膽紅素配制底物溶液:含IOOuM的血紅素、100 μ M的抗壞血酸、ImM的NADP、IOOmM Tris鹽酸緩沖液和終濃度 為IOmM之MgCl2，調(diào)pH至7.5。取底物溶液10毫升，然后加入0.5克固定化血紅素加氧酶和0.5克固定化膽綠素還原酶，于35°C進(jìn)行反應(yīng)2-20小時。離心(10°C，17，800g，15分鐘)并收集上清液。通過高壓液相色譜(HPLC)測定所得上清液中膽紅素的含量。結(jié)果，血紅素轉(zhuǎn)化為膽紅素的轉(zhuǎn)化率超過80%。本發(fā)明不受上述具體文字描述的限制，本發(fā)明可在權(quán)利要求書所概括的范圍內(nèi)做.各種改變。這些改變均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種利用固定化酶促合成膽紅素的方法，其特征在于同時利用固定化血紅素加氧酶和固定化膽綠素還原酶，以血紅素和氧氣為底物，在氧化型輔酶II(NADP)輔助下生產(chǎn)膽紅素。
2.權(quán)利要求1所述的血紅素加氧酶是在大腸桿菌中表達(dá)的重組蛋白。
3.權(quán)利要求2所述的重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)后，未破菌直接固定化、或破菌后粗蛋白直接固定化、又或破菌后粗蛋白經(jīng)純化得純蛋自再固定化，進(jìn)而形成固定化酶。
4.權(quán)利要求3所述的重組蛋白是由源自Clostridiumtetani E88的血紅素加氧酶基因編碼，具有序列表中SEQ ID N0.:2所示的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求1所述的膽綠素還原酶是在大腸桿菌中表達(dá)的重組蛋白。
6.權(quán)利要求5所述的重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)后，未破菌直接固定化、或破菌后粗蛋白直接固定化、又或破菌后粗蛋白經(jīng)純化得純蛋白再固定化，進(jìn)而形成固定化酶。
7.權(quán)利要求6所述的重組蛋白是由源自Synechocystissp.PCC6803的膽綠素還原酶基因編碼，其具有序列表 中SEQ ID N0.:4所不的氣基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種膽紅素生產(chǎn)方法技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開利用固定化酶促合成膽紅素的方法。該方法包括如下步驟a)分別克隆血紅素加氧酶基因和膽綠素還原酶基因；b)于大腸桿菌中分別表達(dá)重組的血紅素加氧酶和膽綠素還原酶；c)提取血紅素加氧酶的粗提物或其純酶以及膽綠素還原酶的粗提物或其純酶；d)固定化血紅素加氧酶的粗提物或其純酶以及膽綠素還原酶的粗提物或其純酶；e)同時用固定化血紅素加氧酶和固定化膽綠素還原酶催化，以血紅素和氧氣為底物，在氧化型輔酶II輔助下制備膽紅素。
文檔編號C12P17/16GK103114110SQ20121039568
公開日2013年5月22日 申請日期2012年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月17日
發(fā)明者張琦 申請人:邦泰生物工程(深圳)有限公司