專利名稱：鮭亞科魚類特異性鑒定方法及其試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學和核酸檢測技術領域。具體地，本發明涉及鮭亞科魚類特異性鑒定方法及其試劑盒。
背景技術：
鮭科(Salmonidae)魚類屬典型冷水魚類，隸屬于硬骨魚綱，鮭形目，是世界三大養殖魚類之一。鮭科魚含有豐富的蛋白質、脂肪和維生素，膽固醇含量很低，而且含有ω3脂肪酸(EPA、DHA和DPA)，肉質鮮美，營養價值極高，深受消費者青睞。一般將鮭科分為三個亞科，包括娃亞科(Salmoniae),白娃亞科(Coregoninae)和茵魚亞科(Thymallidae)。其中鮭亞科魚類有5屬，即大馬哈魚屬(Oncorhynchus)、紅點鮭屬(Salvelinus)、哲羅鮭屬(Hucho taimen)、細鱗鮭屬(Brachymystax)和鮭屬(Salmo),囊括了鮭科中多數的食用性魚類，因此需求最大，經濟價值最高，市場上常見的以“三文魚”為商品名的鮭鱒魚類，如大 西洋鮭、虹鱒、大麻哈魚，以及哲羅鮭、紅點鮭、細鱗大麻哈魚等均屬于鮭亞科魚類。至2009年世界三文魚產量達到366. 4萬噸，我國三文魚進口量達到了 22萬噸，消費需求日益增長。但是目前國內外市場上“三文魚”商品名稱混亂，尤其是很多國家食品監管部門在市場上發現近緣魚種假冒替代現象時有發生，僅美國在2002年就有34%水產品亂貼標簽或假冒其它種類產品。為保證保費者權益，規范三文魚銷售市場，使產品“名副其實”，建立一種鮭亞科魚類的鑒定方法尤為重要。由于經濟利益驅動，一些不法商在食品的加工過程中，常常以價格低廉的原料替代或摻入高價格的原料，或者根本就不添加標注的原料成分。在加工產品的造假摻假過程中，經常會使用有毒有害物質(如染色饅頭等)，危害人民身體健康。本發明旨在開發出方便快捷地檢測食品、飼料及魚類加工制品中鮭亞科魚成分的方法，確保食品質量安全。

發明內容
本發明的目的在于提供鮭亞科魚類特異性鑒定方法及其試劑盒。在本發明的第一方面，提供一種鑒定鮭亞科魚類的方法，所述方法包括以待測樣品的DNA為模板，以SEQ ID NO: I和SEQ ID NO: 2所示的引物進行PCR擴增；若發生特異性擴增，則表明待測樣品中包含鮭亞科魚類。在一個優選例中，以SEQ ID NO: I和SEQ ID NO: 2所示的引物以及SEQID NO: 3所示的突光探針(如Taqman探針)進行實時突光PCR檢測。在另一優選例中，所述的待測樣品是食品或飼料。在另一優選例中，所述方法的檢測靈敏度為O. 01%。在本發明的第一方面，提供一種引物，所述弓I物是弓I物對，其序列如SEQID NO: I和SEQ ID NO:2 所示。在本發明的第一方面，提供一種熒光探針，所述的探針序列如SEQ ID N0:3所示。在本發明的第一方面，提供所述的引物或所述的熒光探針的用途，用于從待測樣品中鑒定娃亞科魚類。在本發明的第一方面，提供一種鑒定鮭亞科魚類的試劑盒，其中包括所述的引物；和/或所述的熒光探針。在一個優選例中，所述試劑盒中還包括含有鮭亞科魚類的DNA的檢測標準品。在另一優選例中，所述試劑盒中還包括選自以下的試劑DNA提取試劑，Taq酶，PCR緩沖液，DNA聚合酶，和/或說明鑒定鮭亞科魚類的方法的使用說明書。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖I、應用實時熒光PCR檢測方法來進行特異性實驗的熒光PCR檢測圖譜。 圖2、鮭亞科魚的PCR擴增結果以及標準曲線。其中，A為虹鱒(Oncorhynchusmykiss), B 為白點鮭(Salvelinus leucomaenis), C 為尖吻細鱗鮭(Brachymystax Ienok),D為大西洋鮭(Salmo salar)。
具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究和試驗，首次揭示一種可特異性鑒定鮭亞科魚類的引物，所述引物對含有鮭亞科魚類DNA的樣品可發生特異性擴增(獲得陽性結果)，而對沒有鮭亞科魚類DNA的樣品不發生特異性擴增(獲得陰性結果)。為了簡化PCR擴增方法，本發明人還設計了配合所述引物的、用于進行實時熒光PCR的熒光探針。采用所述的引物配合熒光探針，可良好地應用于鑒定鮭亞科魚類，并且具有良好的再現性、靈敏度。目前開發有效的鑒定各種魚類成分的方法的難點在于這些成分通常在外觀、品質上非常相近，導致人們難分真偽。即使采用一些基因或蛋白水平上的技術，也由于許多魚類在親緣關系上較近，難以找到符合標準的、檢測準確性高、實用性強的檢測靶標。為此，本發明人經過深入的研究和大量的篩選，找到了合適的檢測靶標，基于此開發了實時熒光PCR檢測鮭亞科魚類的方法。本發明人通過對引物的篩選，獲得一類可特異性鑒定鮭亞科魚類的引物，其對于鮭亞科魚類的DNA發生特異性擴增，而對沒有鮭亞科魚類的DNA不發生特異性擴增。因此，本發明提供一種引物，所述的引物具SEQ ID NO: I和SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列。本發明的這些弓I物還可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或其他化學發光物質進行標記。本發明還提供一種探針，所述的探針具SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；較佳地，所述的探針是熒光探針，從而便于實時熒光檢測。利用本發明的引物及探針，只需進行常規的PCR反應和/或瓊脂糖凝膠電泳，并通過判斷相應的PCR產物的有無，就可以準確、快速地判斷待測樣品是否含有鮭亞科魚類，而且所需的樣品量很少。基于本發明所提供的適用于鑒定鮭亞科魚類的特異性引物及探針，本發明還提供了一種鑒定鮭亞科魚類的方法，所述方法包括以待測樣品的DNA為模板，以SEQ ID NO: I和SEQ ID N0:2所示的引物進行PCR擴增；若發生特異性擴增，則表明待測樣品中包含鮭亞科魚類。聚合酶鏈反應(PCR)技術是本領域技術人員熟知的技術，其基本原理是體外酶促合成特異DNA片段的方法。本發明的方法可采用常規的PCR技術進行。作為本發明的優選方式，利用所述引物，采用實時熒光PCR方法來進行鮭亞科魚類的鑒定。TaqMan探針法是高度特異的定量PCR技術，其核心是利用Taq酶的3' —5'外切核酸酶活性，切斷探針，產生熒光信號。由于探針與模板是特異性結合，所以熒光信號的強弱就代表了模板的數量。TaqMan探針根據其3'端標記的熒光淬滅基團的不同分為兩種普通的TaqMan探針和熒光探針。熒光探針的淬滅基團采用非熒光淬滅基團(Non-Fluorescent Quencher),本身不產生突光,可以大大降低本底信號的強度。同時探針上還連接有熒光修飾基團。獲取待測樣品的DNA的方法是本領域技術人員所熟知的技術，例如可采取傳統的
酚/氯仿/異戊醇法，或者可采用一些商購的DNA提取試劑盒，這類試劑盒是本領域技術人員熟知的。本發明還涉及一種用于鑒定鮭亞科魚類的試劑盒，所述試劑盒中含有SEQID NO: I和SEQ ID NO:2所示的引物；更佳地，所述的試劑盒中還含有SEQ IDN0:3所示的探針。此外，所述的試劑盒還可含有其它鑒定鮭亞科魚類的試劑，如(但不限于)(A)各種PCR反應用試劑，例如但不限于Taq酶，PCR緩沖液，dNTP，DNA聚合酶等；或(B)各種提取DNA(即制備PCR反應模板)所需的試劑，例如但不限于酹、氯仿、異戊醇、NaCl等；或(C)提取DNA的試劑盒。此外，所述的試劑盒中還可含有鑒定鮭亞科魚類的使用說明書和/或標準操作程序。本發明所述的試劑盒可實現快速檢測、批量檢測鮭亞科魚類的目的。本發明的主要優點在于(I)首次揭示一種可特異性鑒定鮭亞科魚類的引物，所述的引物特異性良好，對于鮭亞科魚類能夠實現特異性擴增，而對于鮭亞科魚類以外的其它通常用作仿制鮭亞科魚類的物質則不能特異性擴增。并且，所述引物具有良好的再現性、結果穩定可靠。(2)利用所述的引物或含有所述引物的檢測試劑盒，可快速、大批量地檢測鮭亞科魚類，從待測樣品中快速準確地區分真假鮭亞科魚類，并且所需樣品量少，操作簡單。(3)較佳地，本發明應用熒光實時熒光PCR技術，可快速實現食品中鮭亞科魚類源性成分的準確鑒定。(4)本發明的方法的推廣應用對保障產品的質量，保護消費者知情權和選擇權，維護正常的經濟秩序等提供了技術支持。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
I.材料與方法魚類或樣品材料的獲得鮭科魚類包括鮭亞科，白鮭亞科和茴魚亞科的共七個屬魚類。魚樣收集購買自中國鮭魚產區及世界范圍內的三文魚產區，如表I。
表I、鮭科魚樣的收集
權利要求
1.一種鑒定鮭亞科魚類的方法，其特征在于，所述方法包括 以待測樣品的DNA為模板，以SEQ ID NO: I和SEQ ID N0:2所示的引物進行PCR擴增；若發生特異性擴增，則表明待測樣品中包含鮭亞科魚類。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，以SEQID NO: I和SEQ ID N0:2所示的引物以及SEQ ID NO: 3所示的熒光探針進行實時熒光PCR檢測。
3.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述的待測樣品是食品或飼料。
4.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法的檢測靈敏度為O.01%。
5.一種引物，其特征在于，所述引物是引物對，其序列如SEQ ID ΝΟ:1和SEQ ID NO:2所示。
6.一種熒光探針，其特征在于，所述的探針序列如SEQ ID NO:3所示。
7.權利要求5所述的引物或權利要求6所述的熒光探針的用途，用于從待測樣品中鑒定鮭亞科魚類。
8.一種鑒定鮭亞科魚類的試劑盒，其特征在于，其中包括權利要求5所述的引物；和/或權利要求6所述的熒光探針。
9.如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括含有鮭亞科魚類的DNA的檢測標準品。
10.如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括選自以下的試劑DNA提取試劑，Taq酶，PCR緩沖液，DNA聚合酶，和/或說明鑒定鮭亞科魚類的方法的使用說明書。
全文摘要
本發明涉及鮭亞科魚類特異性鑒定方法及其試劑盒。本發明首次揭示一種可特異性鑒定鮭亞科魚類成分的引物及探針，所述引物及探針針對含有鮭亞科魚類DNA的樣品可發生特異性擴增，而對沒有鮭亞科魚類DNA的樣品不發生特異性擴增。因而，所述引物可良好地應用于鑒定鮭亞科魚類，并且具有良好的再現性、靈敏度。
文檔編號C12N15/11GK102876802SQ20121040328
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月19日 優先權日2012年10月19日
發明者李想, 樊祥, 李進波, 韓麗, 潘良文, 李輝 申請人:中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局