專利名稱：污水生物處理系統診斷和修復的方法
污水生物處理系統診斷和修復的方法
技術領域：
本 發明涉及污水處理中的生物處理系統技術領域，具體為一種污水生物處理系統診斷和修復的方法。
背景技術：
厭氧-缺氧-好氧(Α/Α/0)系統，縮寫為污水處理系統，是工業有機廢水常用的處理系統。該系統的本質作用原理是依次利用厭氧微生物、兼性微生物、好氧微生物將廢水中的有機物同化為微生物本身的結構組成或生成CO2等無機成分。因此，在污水處理系統的各個環節中，相應微生物的組成與生理狀態，直接決定著有機廢水的處理效果。廢水處理的最終效果，則是各個處理環節中的微生物相互協同的結果。換言之，要保證廢水的處理質量，就必然要求各處理環節中的微生物必須有針對廢水有機物特征的穩定的微生物組成結構。污水處理系統實際上是一種人工的微生態系統。在這個微生態系統中，由于各環節相互銜接與協同，致使微生態的組成在空間上有演替，在時間上有變更。自然，可以將出現故障的廢水處理系統看作是一個退化的或者遭到破壞的生態系統，如果這個生態系統能夠恢復到正常狀態，那么廢水處理的功能也能夠得到恢復，所以對系統故障的診斷和排除過程實際上也是一個生態修復過程。因此生態恢復的理論和方法對于廢水處理系統的修復具有重要的指導作用。雖然人們對于污水處理反應器的設計和操作的優化上做了大量的研究，并已經積累了一些優化經驗，但是這些經驗都是在忽略微生物群落的作用，只是把反應器中的微生物群落看作是一個黑箱，通過控制溶解氧、水停留時間、污泥齡等參數和監控參數比如NH3-N, NO3^-N, Ρ043_-Ρ等參數，一般能在較低的成本下實現污染控制指標(比如B0D，氮和磷)的達標排放。這樣做，雖然能夠在很多情況下達到反應器的優化和穩定運行的目的，但是因為因為這些優化措施沒有考慮到微生物群落的影響，會損壞了反應器中正常的微生物群落結構，因此優化的效果往往是短期的。例如，高BOD去除率可以采用調整物理化學參數(曝氣量、污泥濃度等)的措施來達到，往往容易達到較高BOD去除率，但反應器中BOD濃度的降低也增加了絲狀菌和有益菌種因碳源發生競爭而導致污泥膨脹發生的可能性，此時如果不再繼續優化微生物群落結構，控制絲狀菌的過量生長，污泥膨脹一旦發生，整個污水處理過程就會崩潰。這說明忽略微生物群落作用的優化措施往往是以犧牲其他來達到的，而這種優化往往也是不穩定的，在經過短期明顯效果后，一般會出現另外一種或者幾種問題，系統不穩定。又比如Manefield等分析比較了兩個焦化廢水工業處理裝置之間效果差異的原因。這兩個廢水裝置處理量、反應器結構和操作基本相同，但是卻存在一個處理效果穩定，而另一個效果不穩定的問題，常規的優化很難發現問題所在，他們從微生物群落角度出發，通過使用RNA-SIP技術，發現了這兩個反應器群落之間苯酚降解同位群存在結構差別在兩個反應器中雖然同一種未培養Acidovorax屬種群的苯酚降解同位群中都占優勢地位，但是在處理效果不穩定的反應器中還含有另外一種優勢苯酚降解種群。這種重要同位群結構上的差別很可能是導致處理裝置不穩定的根本原因。
最近幾年，人們已經意識到在反應器優化的過程中考慮微生物群落結構、優化的必要性。但是由于意識和手段的限制，我們對反應器中微生物菌群結構都是從純培養角度出發的，對于污水處理系統中微生物群落中各個菌群的組成、多度、分布以及它們在運行過程中的生理學特點(如生長動力學和對不同底物的親和力及利用效能等)都缺乏全面而正確的認識。這些知識的缺乏，限制了微生物的群落結構演替在反應器優化中的應用。

發明內容
本發明的目的在于針對以上所述現有技術存在的不足，提供一種對污水生物處理系統中群落的時間或者空間演替進行系統軌跡分析的污水生物處理系統診斷和修復的方法。為了實現上述目的，本發明是這樣實現的污水生物處理系統診斷和修復的方法，其包括的步驟如下I)確定參比系統；2)對參比系統取樣；3)提取樣品中的DNA，16sRNA V3區進行PCR擴增，然后進行DGGE指紋圖譜分析；4)對DGGE指紋圖譜標準化；5)對DGGE指紋圖譜的主成份分析，鑒定DGGE條帶；6)實時PCR定量確立主成份的演替規律；8)分析診斷，推斷故障具體原因，提出解決方案。所述I)步驟確定的參比系統為處理工藝相同、進水水質及規模大致相同、出水要求相同且系統運行穩定至少半年以上(如若無適合的，也可在實驗自行建立一個運行正常，能滿足設定廢水處理目標的中試系統)的污水生物處理系統；其中進水、出水水質按照城鎮污水處理廠污染物排放標準(GB18918-2002)的相應標準進行測定(注有地方標準的要參照地方標準)，進水水質大致相同是指兩個系統的各指標日均值相差不大(不超過30%)，且日變化幅度大致相同(不超過10%);出水要求相同是指兩個系統均要達到相同的國家或者地方出水水質標準。系統運行穩定主要是指出水各指標能夠達到國家相應出水要求，且日浮動范圍不超過5%。所述2)步驟中，在取樣前對系統進行分區，可以分為氧池、缺氧池、好氧池三個區，系統分區的各個部位(上、中、下)，均要采集污泥樣，以增強樣品的代表性。其中系統分區是按照系統不同反應器或者統一反應器中不同時間點的運行工況的不同進行分區的，可以分為厭氧區(段)、缺氧區(段)、好氧區(段)。所述3)步驟的 PCR 擴增引物括上游引物 GC-341f (5’ -CGCCCGCCGCGCC CCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和下游引物 907r (5’-CCGTCAATTCCTTT [A/G]AGTTT-3’)兩種。且對樣品進行擴增后再進行復原條件PCR (Reconditioning PCR),即將PCR產物稀釋10倍后作為新的模版再進行第二輪PCR擴增，PCR反應體系與第一輪相同，循環3次，以消除PCR產物中單鏈DNA的影響，最后對PCR結果做變性葡聚糖凝膠，凝膠成像，分別建立DGGE指紋圖譜。DGGE指紋圖譜分析的具體條件為使用D Code通用突變檢測系統；變性劑梯度為37-58% (100%變性劑由7mol/L尿素和40%去離子甲酰胺組成)；8%聚丙烯酰胺凝膠，1 X TriS-Acetate-EDTA (TAE，pH8. 4)的電泳緩沖液，在電壓200V，溫度60°C的條件下電泳200min，電泳結束后用IXSYBR Green I (AMRESCO公司)染色，然后用UVI凝膠成
像系統保存實驗結果。所述DGGE 圖譜標準化可以利用 Image J 軟件(http://rsb.info.nih.gov/ij/)將DGGE圖譜條帶的亮度和遷移位置數字化，后利用公式條帶亮度=(直接從膠上讀取的條帶亮度X 100/每個泳道內所有條帶亮度之和)將條帶的亮度標準化；DGGE圖譜的主成份分析是將標準化的條帶亮度數據,在variance-covariance(遺傳變方變積)矩陣的基礎上進行PCA分析(principal component analysis)。用SPSS軟件進行PCA分析。DGGE條帶鑒定是對主成分的電泳進行鑒定，確立主條帶所代表的微生物種屬即優勢菌屬。實時PCR定量確立主成份的演替規律是通過實時PCR定量分析技術，具體操作是對每個反應器或者時間點的每個優勢菌屬進行PCR定量分析，確定優勢菌屬含量，作為一個點，將每個反應器或者每個時間點所對應的點在二維空間連接起來就組成一條空間演替軌跡。探究故障系統空間演替軌跡的操作與參比系統的完全相同，即通過PCR定量分析技術，建立故障系統的空間演替軌跡。故障診斷方式為對比分析故障系統與參比系統確立的主成份的空間演替軌跡。找出故障系統與參比系統中在群落演替中起重要作用的微生物種群及所在位置。結合故障系統存在問題，找出系統問題原因，完成對系統故障的診斷。進而利用系統診斷采取相應的處理措施，對系統進行修復。本發明將PCR-DGGE和實時定量PCR等分子生態學技術與主成分分析(principalcomponent analysis, PCA)相結合可以對系統中群落的時間或者空間演替進行系統軌跡分析。PCR-DGGE能夠同時測定空間上或者時間上多個微生物群落的結構。PCR-DGGE指紋圖譜中每一條帶遷移位置和亮度的數字化可以將指紋圖譜與高維空間中的一個點相對應，將這些點沿著時間或者空間方向連接起來就可以得到系統的群落空間演替軌跡。這些高維空間的系統軌跡非常復雜，為了便于分析比較，還必須借助PCA分析對系統軌跡的主要特征進行提取，然后在一個二維或者三維空間里把系統軌跡直觀地展現出來。在PCA分析的基礎上，再對那些主成分DGGE條帶進行鑒定，就可以知道哪些種群是推動群落演替進行的重要種群。進一步可以用實時定量PCR對這些重要種群在演替過程中的動態變化進行定量測定，以消除PCR的偏好性以及DGGE的分辨能力等方法偏差對于實驗結果的影響。與現有技術相比，本發明有如下優點對于污水生物處理系統問題診斷，現有技術主要是通過改變運行方式，例如改變水力停留時間(HRT )、污泥齡(SRT )、曝氣量等方式，實現對各種污染物(比如B0D，氮和磷)的達標排放，這種方式雖然在很多情況下能夠實現反應器的控制，他們因為微生物群落間的相互作用和交流，往往會同時損壞了反應器中正常的微生物群落結構，影響了微生物正常功能的發揮，因此效果往往是短期的。本發明針對現有技術的不足，提出了一種污水生物處理系統診斷和修復的方法。利用參比系統和故障系統微生物群落空間演替的不同對故障系統出現的問題進行診斷和排除，是一種準確、高效的污水生物處理系統診斷和修復方法。
圖I為本發明污水生物處理系統診斷和修復方法流程圖；圖2為Α/Α/0生物處理工藝流程示意圖；圖3為參比系統的PCR-DGGE圖譜示意圖；圖4-1、4-2、4_3為參比系統與故障系統的微生物空間演替軌跡的實時PCR定量分析圖。
具體實施方式以下結合附圖和具體實施例對本發明進行詳細的描述說明。在本實施中，一個Α/Α/0污水處理廠，工藝流程圖如圖I所示。在投入運行后，出現了 TP去除效率低的故障。現利用該方法按以下步驟進行對故障系統進行診斷和修復。I)確立有機廢水處理的參比系統在這里我們在實驗室構建了一套裝置作為參比系統。等系統穩定運行半年后，進 行取樣，進行PCR-DGGE分析。確定的參比系統為與待檢測的系統的處理工藝相同、進水水質及規模大致相同、出水要求相同且系統運行穩定至少半年以上(如若無適合的，也可在實驗自行建立一個運行正常，能滿足設定廢水處理目標的中試系統)的污水生物處理系統；其中進水、出水水質按照城鎮污水處理廠污染物排放標準(GB18918-2002)的相應標準進行測定(注有地方標準的要參照地方標準)，進水水質大致相同是指兩個系統的各指標日均值相差不大(不超過30%)，且日變化幅度大致相同(不超過10%);出水要求相同是指兩個系統均要達到相同的國家或者地方出水水質標準。系統運行穩定主要是指出水各指標能夠達到國家相應出水要求，且日浮動不大(不超過5%)。2)對參比系統取樣；在取樣前對系統進行分區，可以分為氧池、缺氧池和好氧池三個區，系統分區的各個部位(上、中、下)，均要采集污泥樣，以增強樣品的代表性。其中系統分區是按照系統不同反應器或者統一反應器中不同時間點的運行工況的不同進行分區的，可以分為厭氧區(段)、缺氧區(段)和好氧區(段)。3)提取樣品中的DNA，16sRNA V3區進行PCR擴增，然后進行DGGE指紋圖譜分析，如圖3所示；依據參比系統進行16sRNA V3區PCR-DGGE分析，對參比系統中各個環節進行取樣，即在厭氧池、缺氧池、好氧池各區分別取污泥樣品。取樣時將污泥的上、中、下層按等比例混勻，然后提取污泥樣品中的微生物，提取樣品DNA，對樣品DNA分別進行PCR擴增再對PCR產物進行“Reconditioning PCR”。最后對PCR結果做變性葡聚糖凝膠，凝膠成像，建立DGGE指紋圖譜，如圖3示。其中PCR擴增引物括上游引物GC-341f(5，-CGCCCGCCGCGCCCCGC GCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-CCTACGGGAGGCAGCAG-3，)和下游引物907K 5’-CCGTCAATTCCTTT [A/G]AGTTT-3’)兩種。且對樣品進行擴增后再進行復原條件PCR(Reconditioning PCR),即將PCR產物稀釋10倍后作為新的模版再進行第二輪PCR擴增，PCR反應體系與第一輪相同，循環3次，以消除PCR產物中單鏈DNA的影響，最后對PCR結果做變性葡聚糖凝膠，凝膠成像，分別建立DGGE指紋圖譜。DGGE指紋圖譜分析的具體條件為使用D Code通用突變檢測系統；變性劑梯度為37-58% (100%變性劑由7mol/L尿素和40%去離子甲酰胺組成)；8%聚丙烯酰胺凝膠，I X Tris-Acetate-EDTA (TAE, pH8. 4)的電泳緩沖液，在電壓200￥，溫度601的條件下電泳2001^11，電泳結束后用1\5￥81 Green I (AMRESCO公司)染色，然后用UVI凝膠成像系統保存實驗結果。4 )對DGGE指紋圖譜標準化；DGGE 圖譜標準化可以利用 Image J軟件(http://rsb. info. nih. gov/i j/)將DGGE圖譜條帶的亮度和遷移位置數字化，后利用公式條帶亮度=(直接從膠上讀取的條帶亮度X 100/每個泳道內所有條帶亮度之和)將條帶的亮度標準化；5)對DGGE指紋圖譜的主成份分析，鑒定DGGE條帶；DGGE圖譜條帶的亮度和遷移位置標準化。根據標準化后條帶的亮度數據，通過PCA分析找到DGGE圖譜中主成分電泳條帶共7條。這個條帶代表了厭氧池到好氧池群落演替的重要種群。重點對主成分電泳進行鑒定，確立條帶所代表的微生物種屬。在本實例中選取的參比系統中確定了聚磷菌Rhodocyclus屬、反硝化菌Pseudomonaceae屬、聚糖菌GB
坐寸ο6)實時PCR定量確立主成份的演替規律；通過實時PCR定量分析技術，建立參比系統和故障系統的PCR定量分析空間演替軌跡對比，如圖4示。從圖中可以看出，故障系統中在厭氧池中聚磷菌、反硝化菌、聚糖菌的數量上存在較大的差距。在參比系統中其三成分含量分別為89X 106、0、0cOpy/ugDNA ；而在故障系統中三者的含量發生了很大的變化，其含量分別變為3. 5X106、2.6X103、34X 106copy/ugDNA(注低于檢測下限以O計)。這意味著故障系統厭氧池生存環境不適合聚磷菌，導致其數量大大減少，而反硝化菌和聚糖菌數量卻大大增長。7)分析診斷，推斷故障具體原因，提出解決方案。如圖4所示，利用參比系統確立的主成份的空間演替軌跡對存在故障的水處理系統進行分析診斷，并進行系統修復。在系統厭氧池中三種微生物數量上的差別可以看出是系統中反硝化菌和聚糖菌過量，與聚磷菌發生碳源爭奪，導致厭氧池厭氧釋磷效果大大降低，從而影響系統的除磷效果。分析反硝化菌過多的原因，可能是系統污泥回流量過大，導致在厭氧池中的硝酸鹽氮增多，反硝化菌發生反硝化反應，與聚磷菌爭奪碳源。而系統中的聚糖菌數量過多也可能是系統污泥回流量的增高，改變了厭氧池中的環境，有利于聚糖菌的生存繁殖。根據上述分析將污泥回流量由50%降低到40%后，系統出水TP達標；詳見下表統運行效果(均值)
權利要求
1.污水生物處理系統診斷和修復的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)確定參比系統； 2)對參比系統取樣； 3)提取樣品中的DNA，16sRNAV3區進行PCR擴增，然后進行DGGE指紋圖譜分析； 4)對DGGE指紋圖譜標準化； 5)對DGGE指紋圖譜的主成份分析，鑒定DGGE條帶； 6)實時PCR定量確立主成份的演替規律。
2.按照權利要求I所述的污水生物處理系統診斷和修復的方法，其特征在于，所述I)步驟確定的參比系統為處理工藝相同、進水水質及規模大致相同、出水要求相同且系統運行穩定至少半年以上的污水生物處理系統，系統運行穩定主要是指出水各指標能夠達到國家相應出水要求，且日浮動范圍不超過5%。
3.按照權利要求I所述的污水生物處理系統診斷和修復的方法，其特征在于，所述2)步驟中，在取樣前對系統進行分區，分為厭氧區、缺氧區和好氧區。
4.按照權利要求I所述的污水生物處理系統診斷和修復的方法，其特征在于，所述3)步驟的 PCR 擴增引物括上游引物 GC-341f(5，-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和下游引物 907r (5，-CCGTCAATTCCTTT[A/G]AGTTT_3’)兩種。
5.按照權利要求4所述的污水生物處理系統診斷和修復的方法，其特征在于，在對樣品進行擴增后再進行復原條件PCR，將PCR產物稀釋10倍后作為新的模版再進行第二輪PCR擴增，PCR反應體系與第一輪相同，循環3次，以消除PCR產物中單鏈DNA的影響，最后對PCR結果做變性葡聚糖凝膠，凝膠成像，分別建立DGGE指紋圖譜。
6.按照權利要求I所述的污水生物處理系統診斷和修復的方法，其特征在于，所述DGGE圖譜標準化是利用Image J軟件將DGGE圖譜條帶的亮度和遷移位置數字化，后利用公式條帶亮度=直接從膠上讀取的條帶亮度XlOO/每個泳道內所有條帶亮度之和將條帶的亮度標準化。
7.按照權利要求I所述的污水生物處理系統診斷和修復的方法，其特征在于，DGGE圖譜的主成份分析是將標準化的條帶亮度數據，在遺傳變方變積矩陣的基礎上進行PCA分析；找到DGGE圖譜中主成分的電泳條帶。
8.按照權利要求I所述的污水生物處理系統診斷和修復的方法，其特征在于，DGGE條帶鑒定是重點對主成分電泳進行鑒定，確立主條帶所代表的微生物種屬。
9.按照權利要求I所述的污水生物處理系統診斷和修復的方法，其特征在于，實時PCR定量確立主成份的演替規律是通過實時PCR定量分析，跟蹤監測廢水處理工藝中各環節中主成分微生物種群的空間或時間演替，最終確立各主成份在水處理系統中的空間演替軌跡。
全文摘要
本發明公開了一種污水生物處理系統診斷和修復的方法，其步驟如下1)確定參比系統；2)對參比系統取樣；3)提取樣品中的DNA，16sRNA V3區進行PCR擴增，然后進行DGGE指紋圖譜分析；4)對DGGE指紋圖譜標準化；5)對DGGE指紋圖譜的主成份分析，鑒定DGGE條帶；6)實時PCR定量確立主成份的演替規律。本發明通過對比分析微生物空間演替出現問題，找出運行系統存在問題，對故障系統進行診斷，提出系統修復建議。該方法主要應用于污水處理系統中問題診斷、功能恢復以及功能優化。
文檔編號C12Q1/68GK102876803SQ20121040579
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月22日 優先權日2012年10月22日 公開號201210405791.發明者王志宏, 陳大志, 黃力彥, 羅曉棟, 吳艷, 劉妍, 姚創, 岳建雄, 譚艷來, 陳振比, 洪瑞申, 李文強, 佘瓊虹, 羅哲珠 申請人:廣東省工程技術研究所