專利名稱：一種用于檢測甲肝病毒的分子馬達生物傳感器試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明是關于食源性病毒快速檢測技術的一種。
背景技術：
傳統甲肝病毒(HAV)的檢測方法是通過細胞培養，但甲肝病毒不僅增殖時間長、增殖能力低，且不形成細胞病變，難以滿足檢測的要求。20世紀80年代建立的RT-PCR和ICC/PCR(integrated cell culture,PCR)等檢測技術提高了檢測的靈敏度和特異性,在甲肝病原監測中有很好的應用，但其檢測時間仍需5-6h，且容易受PCR擴增產物污染而產生假陽性的可能，這類技術仍然需要依據放射性物質標記的RNA探針或通過凝膠電泳中的特定RNA條帶來判斷檢測結果，且整個過程需要擴增、電泳等步驟，操作繁瑣。不僅費時費力，給使用亦帶來很大不便。因 此急需可靠有效的快速檢測方法，縮短窗口期，避免因食源性甲肝病毒感染而引起的甲型肝炎的發生和流行。

發明內容
本發明核心技術是利用載色體Chromatophore上的FOFl-ATPase分子馬達生物傳感器，集成核酸探針識別、熒光探針標記與檢測等技術，建立了一個全新概念的快速檢測技術體系。利用ATP酶作為載體對目標物進行檢測具有靈敏度高、特異性強、快速的特點。在FtlF1-ATPase分子馬達連接上特異的核酸探針，可以實現對特定食品微生物的快速、特異性、高通量的檢測。本發明可將檢測時間縮短至lh，且檢測靈敏度能達到0.01ng/mL，滿足現有的食源性病毒檢測范圍。


附圖1為分子馬達生物傳感器模式圖(其中a、b、c、α、β、δ、Υ、ε均為ATP合酶亞基)，I為ε亞基抗體,2為鏈霉親和素(Strptavidin), 3為N_biotin, 4為甲肝病毒特異性探針，5為甲肝RNA鏈。附圖2為chix) HAV對不同種病毒的檢測結果，縱坐標表示熒光值，橫坐標表示檢測的病毒種類。附圖3為chro HAV對13個添加甲肝病毒食品樣品和2個不含有甲肝病毒食品樣品的檢測結果，縱坐標表示熒光值，橫坐標表示檢測的樣本，I 15為食品檢測樣本編號。
具體實施例方式根據甲肝病毒各型設計具有各型共有的特異性的核酸探針5’-AGCGGCGGATATTGGTGAGTTGTTAAGAC-3’，其中探針的5’用生物素進行標記。將該探針通過生物素抗體連接在分子馬達上面，利用突光探針DHPE標記的載色體Chromatophore上的FtlF1-ATPase分子馬達生物傳感器即可對待測樣本的RNA進行檢測。當樣品為甲肝病毒RNA時，檢測時與生物傳感器結合的同時啟動ATP合成，體系的熒光值會發生明顯的變化，通過這一變化即可判斷樣本為陽性。為此，我們設計了一個試劑盒，可以方便、快速對甲肝病毒進行檢測。試劑盒組成:
權利要求
1.本發明要求保護的內容有:異性核酸探針與FtlF1-ATP合酶連接的方式:在FtlF1-ATP合酶的ε亞基上依次連接ε亞基抗體、生物素、鏈霉親和素、生物素標記的甲肝病毒特異性探針。
2.劑盒檢測體系的反應條件:室溫溫育lOmin。
3.成buffer、啟動buffer、PBS的配方。合成buffer:甘油20 氯化鎂5mM,Tricine50mM,憐酸氫二鉀 5mM ;啟動 buffer:ADP (1.6mM):上述合成 buffer = 1: 3 (v/v)；PBS:137mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀， IOmM磷酸氫二鈉，2mM磷酸二氫鉀。
全文摘要
一種用于檢測甲肝病毒的分子馬達生物傳感器試劑盒，屬于食源性病毒快速檢測領域，主要解決傳統檢測方法培養增殖周期長、增殖能力低，不形成細胞病變，難以滿足檢測要求。本發明的核心技術是利用載色體Chromatophore上的F0F1-ATPase分子馬達生物傳感器，F0F1-ATP合酶由于能快速地旋轉，通過旋轉它建立了催化位點與質子轉運之間的偶聯。首先在ATP合酶的ε亞基上連接甲肝病毒各型的共有序列特異性探針，將待測樣品和陰性對照分別與生物傳感器結合后，比較其催化ATP合成10分鐘后的ATP產生量，ATP合成的多寡可以通過環境中H+的量進行測量，而H+的多寡通過H-DHPE所體現的熒光強度大小來獲得。本方法具有反應時間短，抗原抗體結合充分，操作使用方便等特點，縮短了反應時間，提高了檢測靈敏度。本試劑盒可對待測食品樣本中的甲肝病毒進行快速、靈敏、高通量的檢測。
文檔編號C12R1/93GK103088153SQ201210406050
公開日2013年5月8日 申請日期2012年10月23日 優先權日2012年10月23日
發明者張捷, 許美玲, 張雷, 張惠媛, 劉巖, 盧曉宇, 顧德周, 汪琦, 張昕, 王佩榮, 陳廣全, 樂加昌 申請人:中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局, 臨沂出入境檢驗檢疫局