專利名稱：一種用于檢測諾如病毒的分子馬達生物傳感器試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明是關于食源性病毒快速檢測技術的一種。
背景技術：
諾如病毒是弓I起人類病毒性腸胃炎暴發的重要病原。諾如病毒無論在散發病例中還是暴發疫情中都占有重要地位，從國內外近年對食品諾如病毒的檢出情況看，食源性病毒對食品安全的威脅較嚴重。目前檢測諾如病毒的方法主要有電鏡技術、PCR技術、ELISA技術、基因芯片等方法。PCR技術是目前諾如病毒檢測的主要方法，但是需要病毒富集、RNA提取、引物設計、PCR反應、擴增產物的鑒定等步驟，整個過程所需時間長。并且根據我國目前的經濟水平，電鏡技術、PCR技術，基因芯片技術用于醫療機構常規檢測尚難推廣。ELISA方法雖然簡單易操作，不需要貴重設備，但其在靈敏度和特異性上有一定的不足。在門診就診病例中有不少諾如病毒感染者，國境口岸亦成為諾如病毒感染性疾病輸入的主要途徑。因此，快速、高效地排查和確認方法可避免疫情大規模擴散，盡快研制快速、特異性高、靈敏度高的食源性諾如病毒檢測技術對保障國境口岸的生物安全、醫療門診確診具有非常重要的意義。

發明內容
以受控分子馬達技術為核心，集成核酸探針識別、熒光探針標記與檢測等技術，建立了一個全新概念的快速檢測技術體系。利用ATP酶作為載體對目標物進行檢測具有靈敏度高、特異性強、快速的特點。分子馬達連接上特異的核酸探針，可以實現對特定食品微生物的快速、特異性、高通量的檢測。本發明可將檢測時間縮短至lh，且檢測靈敏度能達到0.005ng/mL，滿足現有的食品微生物檢測范圍。


附圖1為分子馬達生物傳感器模式圖(其中a、b、c、α、β、δ、Υ、ε均為ATP合酶亞基)，I為ε亞基抗體，2為鏈霉親和素(Strptavidin)，3為N-biotin，4為NV探針，5為諾如病毒RNA。附圖2為chroNV對不同種食源性病毒的檢測結果,縱坐標表不突光值,橫坐標表示檢測的樣本，其中I為水，2為甲肝病毒,3為輪狀病毒。附圖3為chro NV對13個添加諾如病毒食品樣本、2個不含有諾如病毒食品樣本的檢測結果，縱坐標表示熒光值，橫坐標表示檢測的樣本，I 15為食品檢測樣本編號。
具體實施例方式根據諾如病毒ORFl和0RF2之間的一段高度保守區基因設計特異性核酸探針5’-AGGAGATYGCGATCYCCTGTCCAYA，其中探針的5’用生物素進行標記。將該探針通過生物素抗體連接在分子馬達上面，記做Chro NV0利用分子馬達生物傳感器即可對待測樣本的RNA進行檢測，當樣品為諾如病毒RNA時，檢測體系的熒光值會發生明顯的變化，通過這一變化即可判斷樣本為陽性。為此，我們設計了一個試劑盒，可以方便、快速對食品中的沙門氏菌進行檢測。試劑盒組成:
權利要求
1.本發明要求保護的內容有:異性核酸探針與FtlF1-ATP合酶連接的方式:在FtlF1-ATP合酶的ε亞基上依次連接ε亞基抗體、生物素、鏈霉親和素、生物素標記的諾如病毒核酸探針。
2.劑盒檢測體系的反應條件:室溫溫育lOmin。
3.成buffer、啟動buffer、PBS的配方。合成buffer:甘油20 氯化鎂5mM,Tricine50mM,憐酸 氫二鉀 5mM ;啟動 buffer:ADP (1.6mM):上述合成 buffer = 1: 3 (v/v)；PBS:137mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀，IOmM磷酸氫二鈉，2mM磷酸二氫鉀。
全文摘要
一種用于檢測食源性諾如病毒的分子馬達生物傳感器試劑盒屬于食源性病毒快速檢測領域，主要解決傳統檢測方法時間過長、靈敏度低、特異性不強的問題。本發明的核心技術是利用載色體Chromatophore上的F0F1-ATPase分子馬達生物傳感器，F0F1-ATP合酶由于能快速地旋轉，通過旋轉它建立了催化位點與質子轉運之間的偶聯。首先在ATP合酶的ε亞基上連接諾如病毒核酸探針，將待測樣品和陰性對照分別與生物傳感器結合后，比較其催化ATP合成10分鐘后的ATP產生量，ATP合成的多寡可以通過環境中H+的量進行測量，而H+的多寡通過H-DHPE所體現的熒光強度大小來獲得。本試劑盒可對待測樣本中的諾如病毒進行快速、靈敏、高通量的檢測。
文檔編號C12Q1/68GK103088154SQ20121040605
公開日2013年5月8日 申請日期2012年10月23日 優先權日2012年10月23日
發明者張捷, 王小晉, 陸琳, 張惠媛, 許美玲, 顧德周, 劉巖, 盧曉宇, 汪琦, 張昕, 王佩榮, 陳廣全, 樂加昌 申請人:中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局, 淮安出入境檢驗檢疫局