專利名稱：一種用于檢測輪狀病毒的分子馬達生物傳感器試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明是關于食源性病毒快速檢測技術的一種。
背景技術：
輪狀病毒是嬰幼兒腹瀉主要病原體。輪狀病毒的經典病原檢測方法包括電鏡技術和分離培養。電鏡技術要求每毫升樣本中包含約IO6個病毒顆粒，而且病毒顆粒易于降解，對正確診斷產生影響。分離培養檢測技術的檢測靈敏度較低，需要特殊培養條件，對輪狀病毒的基礎研究和臨床診斷價值有限。以抗原檢測為基礎的檢測方法特異性和靈敏度較低，而且不能有效地進行定量檢測。PCR技術具有更高的靈敏度，不需細胞培養，但是檢測費用高，且操作步驟繁瑣，需要時間長。目前開發的輪狀病毒檢測方法中，提高檢測方法的靈敏度、特異性，開發經濟實用的試劑盒仍是輪狀病毒檢測技術的主要方向。發展快速、高效輪狀病毒檢測新的檢測方法對有效預防輪狀病毒疫情的暴發，鑒定輪狀病毒的污染狀況，評估環境衛生狀況等將發揮重要作用。

發明內容
以受控分子馬達技術為核心，集成核酸探針識別、熒光探針標記與檢測等技術，建立了一個全新概念的快速檢測技術體系。利用ATP酶作為載體對目標物進行檢測具有靈敏度高、特異性強、快速的特點。分子馬達連接上特異的核酸探針，可以實現對特定食品微生物的快速、特異性、高通量的檢測。本發明可將檢測時間縮短至I 1.5h，且檢測靈敏度能達到0.005ng/mL，滿足現有的食源性病毒檢測范圍。


附圖1為分子馬達生 物傳感器模式圖(其中a、b、c、α、β、δ、Υ、ε均為ATP合酶亞基)，I為ε亞基抗體，2為鏈霉親和素(Strptavidin)，3為N-biotin，4為VP7探針，5為輪狀病毒單鏈RNA。附圖2為chix) VP7對不同種菌株的檢測結果，縱坐標表示熒光值，橫坐標表示檢測的樣本，其中I為水，2輪狀病毒,3為甲肝病毒,4為諾如病毒。附圖3為chro VP7對15個添加輪狀病毒食品樣本的檢測結果,縱坐標表不突光值,橫坐標表示檢測的樣本,I 15為食品檢測樣本編號。
具體實施例方式根據輪狀病毒VP7基因設計特異性核酸探針5’-AGCACAACATTATAATCACAGTATAGTTTGGGTCGA-3’，其中探針的5’用生物素進行標記。將該探針通過生物素抗體連接在分子馬達上面，利用分子馬達生物傳感器即可對待測樣本的RNA進行檢測，當樣品為輪狀病毒RNA時，檢測體系的熒光值會發生明顯的變化，通過這一變化即可判斷樣本為陽性。為此，我們設計了一個試劑盒，可以方便、快速對食源性輪狀病毒進行檢測。
試劑盒組成:
權利要求
1.本發明要求保護的內容有:異性核酸探針與FtlF1-ATP合酶連接的方式:在FtlF1-ATP合酶的ε亞基上依次連接ε亞基抗體、生物素、鏈霉親和素、生物素標記的輪狀病毒核酸探針。
2.劑盒檢測體系的反應條件:室溫溫育10min。
3.成buffer、啟動buffer、PBS的配方。合成buffer:甘油20 氯化鎂5mM,Tricine50mM,憐酸氫二鉀 5mM ;啟動 buffer:ADP (1.6mM):上述合成 buffer = 1: 3 (v/v)；PBS:137mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀，10mM磷酸氫二鈉，2mM磷酸二氫鉀。
全文摘要
一種用于檢測食源性輪狀病毒的分子馬達生物傳感器試劑盒，屬于食源性病毒快速檢測領域，主要解決傳統檢測周期過長、所需儀器設備昂貴的問題。本發明的核心技術是利用載色體Chromatophore上的F0F1-ATPase分子馬達生物傳感器，F0F1-ATP合酶由于能快速地旋轉，通過旋轉它建立了催化位點與質子轉運之間的偶聯。首先在ATP合酶的ε亞基上連接VP7探針，將待測樣品和陰性對照分別與生物傳感器結合后，比較其催化ATP合成10分鐘后的ATP產生量，ATP合成的多寡可以通過環境中H+的量進行測量，而H+的多寡通過H-DHPE所體現的熒光強度大小來獲得。本試劑盒可對待測樣本中的食源性輪狀病毒進行快速、靈敏、高通量的檢測，能有效縮短檢測周期，提高工作效率。
文檔編號C12Q1/70GK103088155SQ20121040607
公開日2013年5月8日 申請日期2012年10月23日 優先權日2012年10月23日
發明者張捷, 楊麗君, 張惠媛, 盧曉宇, 許美玲, 顧德周, 劉巖, 汪琦, 張昕, 王佩榮, 陳廣全, 樂加昌 申請人:中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局, 煙臺出入境檢驗檢疫局