專利名稱：缺失突變的chiB啟動子及其組成型表達蛋白的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，特別是一種經過基因操作產生的蘇云金芽胞桿菌幾丁質酶編碼基因ChiB突變的啟動子序列及其應用。具體地描述，從蘇云金芽胞桿菌總DNA中克隆出這一幾丁質酶啟動子序列，經過在其分子的5'-端和3'-端缺失部分堿基序列后，獲得比原野生型啟動子縮短的序列，該序列稱為“chiBp A 135”，將其與不同的表達載體連接，轉化不同的蘇云金芽胞桿菌，使該轉基因細胞組成型表達其下游幾丁質酶或其他目的基因的方法和應用。
背景技術：
幾丁質是含量僅次于纖維素的生物高分子物質，廣泛存在于自然界中。幾丁質酶(EC3. 2. I. 14)能特異性水解幾丁質，將幾丁質降解成幾丁單糖以及幾丁二糖[(G1cNAc)2]、幾丁三糖[(GlcNAc)3]等分子大小不同的幾丁寡糖[(GlcNAc)n]。I、幾丁質酶在農業方面具有巨大的應用前景，為控制植物病蟲害提供了很好的選擇。絕大多數植物病原真菌細胞壁都含有大量的幾丁質。不少體外抑菌研究證明，幾丁質酶能抑制病原真菌孢子的萌發和菌絲的生長{Hoondal，2005#1941 ;ffang, 2002#1965}。因此幾丁質酶一直被認為是植物抗真菌病害的潛在物質。許多研究已經將細菌和植物幾丁質酶基因轉移到大豆、馬鈴薯、煙草、萵苣、番茄、葡萄及甜菜等植物中，獲得了表達幾丁質酶活性的轉基因植物。Zhang等{Zhang，2011#2043}在催化植物生長根基細菌的基因組中整合枯草芽胞桿菌幾丁質酶基因用于提高植物抗病原真菌的能力。這些植物與非轉基因植物相比，它們不僅能抗真菌，而且對線蟲、昆蟲和其它一些病原生物也有一定的抗性。最近，Nature報道了脂質幾丁寡糖可作為信號分子刺激植物內生真菌菌絲和菌根的形成，進而促進植物根部發育[3]，這是幾丁寡糖在農業應用方面的最新發現。由于幾丁質是昆蟲甲殼及中腸圍食膜的重要組成成分，幾丁質酶破壞昆蟲這些結構后，可以加速害蟲罹病進程，提高死亡率。白僵菌素是著名的生物殺蟲毒素，Fan等{Fan, 2007#1976}通過在蠶白僵菌中聯合表達外源幾丁質酶來提高其殺蟲活力。另外研究發現幾丁質酶可以殺死或阻止發育階段中的蚊子幼蟲，由此可以設想利用幾丁質酶來控制蚊子和由蚊子傳播的疾病，而不需使用農藥{Dahiya，2006#260}。2、幾丁質酶在工業上也具有重要的經濟價值。它能提高很多有價值產品的產量。鑒于幾丁質衍生物具有重要的藥物價值，幾丁質酶也用于生產幾丁寡聚體、氨基葡萄糖和幾丁單體。如，Hayes等{Hayes, 2008#2331}利用幾丁質酶從貝類廢棄物中生產具有藥用價值的殼聚糖；Wang等{Wang，2006#210}利用枯草芽胞桿菌的幾丁質酶從貝類廢棄物中獲取能抑制癌細胞增生的幾丁寡聚體;Makino等{Makino，2006#2336}利用芽胞桿菌和沙門氏菌的幾丁質酶獲得幾丁寡聚體。幾丁質酶也可直接用于人類衛生保健，例如幾丁質酶用于生產眼藥，可以作為抗真菌類護膚品的添加劑{Dahiya，2006#260}。在貝類加工中，固體廢棄物的主要成份是幾丁質、碳酸鈣和蛋白。因此可以利用產幾丁質酶的真菌生產酵母單細胞蛋白(SCP)。Cody等{Cody，1990#1940}報道曾試圖使用幾丁質酶將幾丁質轉變為乙醇。
3、幾丁質酶在科學研究中也有重要應用。幾丁質和殼聚糖是廣泛存在于真菌細胞壁的多聚分子。利用幾丁質酶和其它技術的結合可以定位真菌及植物細胞壁中的幾丁質。Grenier等{Grenier, 1991#1939}利用大麥幾丁質酶和膠體金顆粒來定位真菌菌絲及孢子中的殼聚糖。真菌原生質體是研究細胞壁合成、酶的合成、分泌以及生物技術應用的良好實驗材料。而幾丁質是真菌細胞壁的組成成份，利用幾丁質酶和其它細胞壁降解酶能有效的得到真菌原生質體。Hoondal等{Hoondal, 2005#1941}利用腸桿菌(Enterobacter)的幾丁質酶，有效的得到了瑞氏木霉(Trichoderma reesei),佛羅里達側耳(Pleurotus fIorida)和雙孢燕(Agaricus bisporus)等真菌的原生質體。4、高分子量的幾丁寡糖有明顯的抗腫瘤作用，可激活巨噬細胞和淋巴細胞，增強機體免疫力，已用于抗癌的臨床治療以及藥物和保健食品的開發領域[4~6]。 5、在細菌細胞中，有的酶無需誘導便可以表達，稱為組成型表達酶。而細菌幾丁質酶屬于誘導型表達酶，幾丁質酶基因的表達是受本身代謝機制控制，如果環境中沒有幾丁質存在，細胞中的調控機制會關閉這一相關基因。所以，如果細菌細胞可以組成型表達酶，便可以利用普通細菌培養基，使制備酶的方法即簡便又經濟。雖然目前已從多種芽胞桿菌內克隆到幾丁質酶編碼基因(chi)，產幾丁質酶菌株的酶活性不是很高，且需要誘導培養，這些都制約著幾丁質酶的微生物發酵生產技術。

發明內容
本發明的目的之一是克服現有育種技術所存在的效率低且工作量大的不足，提供一種缺失突變的幾丁質酶編碼基因ChiB啟動子及其組成型表達蛋白的應用。若采用傳統的育種技術獲得組成型表達的基因啟動子，主要利用化學及物理誘變劑處理細胞的全部DNA，誘變方法是隨機改變細菌全基因組的DNA分子，且DNA的突變頻率極低，所以需要大量的誘變及篩選，工作量極大，誘變周期很長。而本發明提供了定向分子操作的方法。所利用的科學原理是，細胞中存在一類負調控基因表達的蛋白，稱為阻遏蛋白，該蛋白特異地結合在所調控基因的啟動子負控制元件序列上，該序列通常稱為操縱子區域。若將操縱子區域刪除，則阻遏蛋白失去結合位點，也就失去了負調控基因表達的功能，此時該基因便可以組成型表達。這種定向分子操作的方法只需要很短的時間便可以完成。本發明的目的之二是，利用組成型表達啟動子，在以獲得幾丁質酶為目的的細菌培養過程中不必再添加幾丁質作為誘導物，可以簡化方法，節約成本，獲得更高的酶活性。本發明涉及了缺失的幾丁質酶B基因(ChiB)啟動子，可以在無誘導物存在的培養條件下，提高同源及異源幾丁質酶或其他目的蛋白的表達水平。所述的缺失啟動子的這一功能是完全無預期的發現，在利用缺失方法研究chiB啟動子功能時，獲得所述的缺失啟動子，將該片段連接幾丁質酶基因后，酶的合成量明顯提高，而且不需要幾丁質誘導，可以組成型表達。在實施例中，描述了這一缺失啟動子的分子改造方法及其序列。在另一實施例中，提供了利用所述的缺失啟動子片段構建組成型表達載體的方法，該載體的宿主可以是大腸桿菌(E. coli)或蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,簡稱Bt)。在隨后的2個實施例中，描述了如何不需誘導培養細菌，獲得來自其他細菌的異源￠-半乳糖苷酶。在最后一個實施例中，組成型表達的目的蛋白，是來自地衣芽胞桿菌的幾丁質酶ChiMY和來自Bt的另一幾丁質酶ChiA。本發明提供了缺失啟動子片段的獲得方法，還提供了利用該啟動子在大腸桿菌(E. coli)或蘇云金芽胞桿菌(Bt)中不需誘導制備幾丁質酶的方法，所述的幾丁質酶可以是Bt本身的，也可以是來自其他芽胞桿菌的。本發明首先提供了一種分子定向育種方法，該方法使幾丁質酶編碼基因chiB啟動子序列縮短，防止了阻遏蛋白對基因表達的抑制；所述的序列縮短的方法是將原啟動子序列中負控制元件上游作為PCR擴增的一端起始點，這樣獲得的擴增產物則是缺失了包括負控制元件序列在內的缺失啟動子序列。經DNA操作后獲得了缺失突變的幾丁質酶編碼基因chiB啟動子序列chiBp A 135,所述序列如序列表SEQ ID No. I所示。構建過程簡述如下I)提取大腸桿菌中的重組質粒pMD-chiBp。 2)設計并合成如下兩條引物ChiBpi 324-F :5’ -GCATGGATCCCCTTATCTTTCTACG-3，BamH I chiBp 下 _135-R 5，-GTCCGTCGACTAAATCGTAACAAAT-3，Sal I兩個引物的5'端分別加入了限制性內切酶BamH I和SalI位點。3)以重組質粒pMD-chiBp為模板，進行PCR反應
反1 組分Mi Aht
紱沖液(IOX)(.含20mmol/LMgCl2)5蜱L
dNTP(2.5mmol/L)2^iL校板 DNAI ~400ng無歯H2O 補足令:50jiL擴增條件94°C變性4min ；touchdown 小程序(94°C變性 40s，46°C退火 45s，72°C延伸35s，共5個循環)，94°C變性35s，50°C退火40s，72°C延伸35s，26個循環72°C維持IOmin04)回收PCR片段，亞克隆到測序載體；再轉化到大腸桿菌感受態細胞，在含氨芐青霉素，終濃度為50-100 ii g/ml的LB固體培養基上培養過夜；挑取平板上生長的白色菌落，接入含氨芐青霉素的LB液體培養基中培養過夜，離心收集菌體按堿裂解法提取質粒，經PCR擴增和BamH I和Sal I雙酶切鑒定陽性克隆。5)對陽性克隆質粒進行測序，確證缺失啟動子片段。本發明同時提供了上述構建的缺失突變的幾丁質酶編碼基因ChiB啟動子序列(如SEQ ID No. I所示)的應用，所述的啟動子序列能夠使與其相連接的核苷酸序列以組成型方式表達，能夠利用這一突變的啟動子在蘇云金芽胞桿菌細胞中組成型、大量表達(制備)目的蛋白，不需要特異添加誘導物。實施本發明的方法時，可以參考下列各個實施例，但這些實施例并不以任何方式限制本發明的范圍及權利要求書的保護范圍。本發明的優點和積極效果本發明提供的定向分子育種的原理及其操作方法，適用于包括幾丁質酶基因在內的其他需要誘導才能夠表達的細菌基因。本發明提供了一段經過分子改造的、缺失的幾丁質酶編碼基因ChiB啟動子序列chiBp A 135，利用該序列及其相連接的幾丁質酶基因序列，能夠在大腸桿菌及蘇云金芽胞桿菌細胞中，不需要誘導以組成型方式制備幾丁質酶的方法。所述的幾丁質酶，可以是蘇云金芽胞桿菌本身的，也可以是來自其他芽胞桿菌的。本發明的積極效果在于培養方法上的 簡便性及其經濟性，當需要利用大腸桿菌及蘇云金芽胞桿菌細胞制備幾丁質酶時，可以不添加幾丁質作為基因表達的誘導物，因為攜帶所述缺失啟動子序列的細菌可以組成型合成酶，且活性比原菌株提高6倍。


圖I為幾丁質酶基因全長啟動子電泳圖。圖2為幾丁質酶基因缺失啟動子電泳圖。圖3為幾丁質酶基因缺失啟動子序列。圖4為含缺失啟動子片段表達載體的構建流程圖。圖5為大腸桿菌中P -半乳糖苷酶活力檢測結果。圖6為芽孢桿菌中P -半乳糖苷酶活力檢測結果。圖7為芽孢桿菌中幾丁質酶活力檢測結果。
具體實施例方式實施例I、芽胞桿菌幾丁質酶chiB基因啟動子序列的分離及分子改造第一步，引物一擴增一獲得全長啟動子片段ChiBp將蘇云金芽胞桿菌以色列亞種Bt75 (ATCC 35646)接種于LB液體培養基中，30°C振蕩培養14h，提取總DNA，取5 ii L DNA樣品，瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度和濃度。設計并合成如下兩條引物，并且為以后的克隆和構建的需要，兩個引物的5'端分另Ij加入了限制性內切酶BamH I和Sal I位點chiBp-F :5’ -GACTGGATCCTTCTAAGTTCTGGAG-3’ (SEQ ID No. 2)BamH IchiBp-R :5’ -TAAGGTCGACTGAATCTGCTAATGC-3’ (SEQ ID No. 3)Sal I以Bt75總DNA為模板，進行PCR反應擴增Bt75chiB基因野生型啟動子片段chiBp，其反應體系(50 u L)如下反應ii分加入..
IOxPCR BufferS^iL
dNTP(^2.5mM)4jliL
'Jjfil(IOpM)1.5>iL
W 物 2(10pM)1.5pL
Taq Plus(5U/pL)0.5pL
校板 DN Al-400ng
.AlWH2O擴增條件94°C變性4min ；touchdown 小程序(94°C變性 40s,46°C退火 45s,72°C延伸35s，共5個循環)，94°C變性35s，50°C退火40s，72°C延伸35s，26個循環后72°C維持IOmin0電泳檢測結果表明(如圖I所示)，圖I :幾丁質酶基因全長啟動子電泳圖。將PCR產物純化回收，回收片段連接到測序載體PMD19-T (Takara公司產品)中；獲得重組質粒pMD-chiBp。將其轉化到感受態的大腸桿菌DH5 a細胞，在含50 100 u g/mL氨芐青霉素的LB固體培養基上培養過夜；挑取白色菌落的轉化子，再接入含氨芐青霉素的LB液體培養基中培養過夜，離心收集菌體，用SanPrep柱式質粒DNA小量提取試劑盒提取質粒，經PCR擴增和限制型內切酶SalI酶切鑒定陽性克隆，送交上海生工生物工程技術服務有限公司測序。結果顯示，chiBp全長606bp,將其序列與Genbank中已有的序列(序列號CP003763. I)比對，顯示該片段包含了 Bt幾丁質酶基因chiB結構基因的前102個堿基和上游調控序列504個堿基。確證pMD-chiBp連接了 chiB全長啟動子片段。第二步，缺失引物——擴增——獲得缺失啟動子片段chiBp A 135為獲得截短缺失的chiB啟動子片段，設計并合成如下兩條引物，為隨后的克隆和構建的需要，兩個引物的5'端分別加入了限制性內切酶BamH I和SalI位點chiBp上 324-F :5’ -GC ATGGATCCCCTTATCTTTCTA CG-3’ (SEQ ID No. 4)BamH IchiBpT_m-R :5，-GTCCGTCGACTAAATCGTAACAAAT—3，(SEQ ID No. 5)Sal I以重組質粒pMD-chiBp為模板，對Bt75chiB基因缺失啟動子片段chiBp A 135進行PCR擴增，該片段全長189bp(-324至-135)。反應體系，擴增程序和基因操作步驟與上述方法一致。電泳檢測結果如圖2所示，證明長度大小正確。連接缺失啟動子的重組質粒命名為pMD-chiBp A 135。圖3為幾丁質酶基因缺失啟動子序列。實施例2、細菌表達載體pCB-chiBp A 135的構建含缺失啟動子片段表達載體的構建流程如圖4所示。用試劑盒提取實施例I構建的重組質粒pMD-chiBp A 135，經BamH I和SalI酶切后，釋放出缺失啟動子片段chiBp A 135，與經過同樣酶切的表達載體pCB相連。pCB質粒是本室構建的質粒探測性載體，其構建方法已經于2012年5月在國際刊物《CurentMicrobiology》Vol. 64(5) :492-500, 2012，上發表。構建時選用嗜熱脂肪地芽胞桿 菌(B. stearothermophilus)的P _半乳糖苷酶基因bgaB (約2kb)作為報告基因,報告基因上游沒有任何啟動子序列，故插入任一有功能的啟動子，則可以在芽胞桿菌細胞中表達出3 -半乳糖苷酶。隨后將連接產物用CaCl2法轉化到大腸桿菌DH5 a，從轉化子中提取重組質粒并進行PCR擴增及酶切鑒定。將驗證正確的重組質粒命名為pCB-chiBp A 135。大腸桿菌轉化子命名為E. coli (pCB-75Bp A 135)。將該質粒再轉化進蘇云金芽胞桿菌Bt75中。芽胞桿菌轉化的具體方法為首先制備Bt75菌株感受態。方法為，將Bt75菌株接種于3mL的液體LB培養基中，30°C、200rpm活化12h ;再以1%接種量轉接活化的Bt75菌于3mL液體LB培養基中，30°C、200rpm培養3 3. 5h至0D_為I. 0左右；無菌條件下取ImL菌液，9000rpm離心3min,棄上清；將沉淀重懸于0. 75mL預冷的無菌ddH20,4°C下9000rpm離心3min收集菌體；再用0. 2mL預冷的無菌ddH20漂洗一次菌體；最后將細胞沉淀重懸于80uL預冷的20%PEG6_中，獲得Bt75感受態細胞，準備用于電轉化。將5 IOuL重組質粒pCB-chiBp A 135DNA加入Bt75感受態細胞懸液中，混勻后置于預冷的電擊杯中，冰浴IOmin ;使用lKV/mm左右的電壓電擊混合液，電擊完畢后將電擊杯冰浴lmin，之后加入ImL SOC液體培養基，在37°C、200rpm震蕩條件恢復培養3h，恢復培養 結束后將菌液涂布在含有紅霉素抗性(終濃度為50ii g/mL)的LB固體培養基平板上，37°C培養過夜。獲得的正確轉化子稱為Bt75 (pCB-chiBp A 135)。實施例3、pCB_chiBp A 135在大腸桿菌中組成型表達P -半乳糖苷酶基因一bgaB將含有全長啟動子的對照菌株E. coli (pCB-chiBp)和含有缺失啟動子的實驗菌株E. coli (pCB-chiBp A 135)，同時在含有50 u g/mL氨芐青霉素抗性的LB培養基中37°C、200rpm振蕩過夜培養12h后，以1%的接種量轉接LB培養基，于48h測3 -半乳糖苷酶酶活力。具體操作為取0. 15mL的細菌培養液放入I. 5mL的離心管，加入0. 45mL的10/9Zbuffer，再加入6uL 10%的TritonX-100，混勻后置于冰上直至溫浴；55 °C溫浴3 5min，加入0. 15mL ONPG溶液(4mg/mL)，并開始計時。當混合液變成黃色時加入0. 3mL的Na2CO3(IM)終止反應，并計時。IOOOrpm離心lOmin，在A42tl波長下測量上清液的吸光值。測定結果顯示，含有野生型啟動子的對照菌株E. coli (pCB-chiBp)在無誘導物的LB培養基培養條件下，酶活僅達到0. 4U，而含有缺失啟動子的實驗菌株E. coli (pCB-chiBp A 135)，利用缺失啟動子表達的P -半乳糖苷酶活力，同樣在無誘導物的培養條件下，酶活達到4U，約是野生型啟動子的10倍。具體結果見圖5。實施例4、重組質粒pCB-chiBp A 135在芽胞桿菌中組成型表達P -半乳糖苷酶基因一bgaB將含有全長啟動子的對照菌株Bt (pCB-chiBp)和含有缺失啟動子的實驗菌株Bt (pCB-chiBp A 135)在含有50 u g/mL紅霉素抗性的LB培養基中30°C、200rpm振蕩過夜培養12h后，以1%的接種量轉接基本培養基(M)和誘導培養基(C)。基本培養基中除無機鹽外加入1%蛋白胨。誘導培養基中除無機鹽外加入1%幾丁質粉末。培養48h后，分別檢測對照Bt菌株和實驗Bt菌株3 -半乳糖苷酶酶活力。方法與實施例3所述一致，只是增加破細胞壁的步驟，即加入0. 315mL 10/9的Z buffer后加0. 075mL溶菌酶(4mg/mL)和
0.06mL P -巰基乙醇(29uL/mL),混勻后于37°C溫浴30min。后續步驟完全一樣。測定結果顯示，含有全長啟動子的對照菌株Bt (pCB-chiBp)在無誘導物的基本培養基中，酶活僅達到I. 2U左右，而含有缺失啟動子的實驗菌株Bt (pCB-chiBp A 135)，同樣在基本培養基中的酶活力達過7. 5U，約為全長啟動子表達酶的6倍，呈現組成型表達。具體結果見圖6。實施例5、重組質粒pCB-chiBp A 135在芽胞桿菌中組成型、超量表達2種幾丁質酶基因一chiMY，chiA實施例4中測定結果描述可以看出，缺失啟動子片段的重組質粒pCB-chiBp A 135，能夠在芽胞桿菌中組成型超量表達與之相連的外源基因-bgaB。本實施例中，描述了另外2個不同的結構基因-來自地衣芽胞桿菌幾丁質酶基因chiMY和來自蘇云金芽胞桿菌幾丁質酶基因chiA，在缺失啟動子chiBp A 135調控下的組成型、超量表達2種幾丁質酶。
I)利用下列一對引物，首先克隆地衣芽胞桿菌幾丁質酶基因的結構基因chiMY。chiMY75~F:AAATGTCGACTAAGGAGGAAAAATAGATGAACATCGT (SEQ ID No. 6)SailchiMY75~R GGGTGCATGCTACTCAGACTCCTT (SEQ ID No. 7)SphI擴增條件94°C變性4min ；touchdown 小程序(94°C變性 45s，40°C退火 50s，72°C延伸2min，共4個循環)，94°C變性40s，45°C退火45s，72°C延伸2min，26個循環后72°C維持 IOmin。2)利用下列一對引物，克隆蘇云金芽胞桿菌Bt75幾丁質酶A基因的結構基因chiAchiA-F:GGGGTCGACTAATTAATTAAAGGAGTGTTGATATG (SEQ ID No. 8)SalIchiA-R:GGGGCATGCTAAATCGTGGTATTGGGAC (SEQ ID No. 9)SphI擴增條件94°C變性4min，94°C變性 35s，48°C退火 40s，72°C延伸 lmin35s，30 個循環后，72°C維持IOmin。將上述得到的各個結構基因片段通過各自的酶切位點與構建好的表達載體pCB-chiBp A 135 連接。首先，將連接產物用CaCl2法轉化進大腸桿菌，轉化子經PCR及酶切鑒定后，將得到的正確重組質粒分別命名為PDM和pDA。然后，將驗證正確的2個重組質粒分別電轉化進蘇云金芽胞桿菌Bt75菌株中。培養轉化子后，按照Joshi等的方法測定幾丁質酶活力，具體方法是將芽胞桿菌轉化子在無幾丁質誘導物的基本培養基中培養3天，SOOOrpm離心IOmin,取200uL上清液加入200uL含10%膠體幾丁質的磷酸鹽緩沖液(pH6. 0)，50°C水浴Ih ;加入200uL l%NaOH溶液終止反應,混勻后8000rpm離心IOmin ;取400uL上清液于新的EP管中，加入等體積的DNS試劑，混勻后沸水浴5min，以沒有反應的培養液做對照，測OD535值。檢測結果證明，缺失啟動子可以使連接的2個不同來源的幾丁質酶編碼結構基因，在無誘導物條件下組成型表達幾丁質酶，酶活性都達到每毫升7U。而原出發菌株，在無誘導物條件下，酶活性都僅達到每毫升IU左右。具體結果見圖7。
SEQUENCE LISTING
<1 io> IW+JT 大學
<120>缺失突變_ chiB扇動子及其紺成S表達蛋ei_應爾 <160> 9
<170> PateutIn veiiion 3.3
<210> I <211> 勝<212> DNA<213> 蘇ZC.金芽進桿菌(Bacillus imringifflsis)
<400> I
tctcaacttg ctatgccatt acaagttgaa ctcatacaat tttttctcaa atttaattac60
aaagagcctt ttcctcccta atcaatattt tatttteata tatagtttgt attcaagcct 120
111tgtattg agaaggtctt tttcaa丄-tta ataaagcgtt tacactaaat etttg 180
ttacgattt189
<210> 2 <211> 25 <212'- DKA <213>人IE介成 <400> 2
gacIggatcc ItciaagtIc tggag25
<210> 3 <211> 25 <212> DNA <213>人[:介成 <400> 3
tmggtegm tgaatcigci aatgc26
<210>4
<2!1>25
-DDNA <213>人L合成
<400>4
gcatggatcc CCttatclii ctacg25
<210>5

權利要求
1.ー種分子定向育種方法，該方法使幾丁質酶編碼基因ChiB啟動子序列縮短，防止了阻遏蛋白對基因表達的抑制；所述的序列縮短的方法是將原啟動子序列中負控制元件上游作為PCR擴增的一端起始點，這樣獲得的擴增產物則是缺失了包括負控制元件序列在內的缺失啟動子序列。
2.一種經權利要求I所述的方法獲得的缺失突變的幾丁質酶編碼基因chiB啟動子序列chiBp Δ 135,所述序列如序列表SEQ ID No. I所示。
3.—種權利要求2所述的缺失突變的幾丁質酶編碼基因chiB啟動子序列chiBp Λ 135的應用，所述的啟動子序列能夠使與其相連接的核苷酸序列以組成型方式表達，能夠利用這ー突變的啟動子在蘇云金芽胞桿菌或大腸桿菌細胞中組成型、大量表達目的蛋白。
全文摘要
一種缺失突變的幾丁質酶編碼基因chiB啟動子及其組成型表達蛋白的應用。本發明首先提供了一種DNA定向分子育種方法，經所述的方法進行DNA操作后獲得的缺失突變的幾丁質酶編碼基因chiB啟動子序列——chiBp△135，如序列表SEQ ID No.1所示。所述的啟動子序列，可以使與其相連接的目的基因的核苷酸序列以組成型方式表達。可以利用這一突變的啟動子在蘇云金芽胞桿菌或大腸桿菌細胞中組成型、大量表達目的蛋白。
文檔編號C12N15/70GK102978209SQ20121040886
公開日2013年3月20日 申請日期2012年10月24日 優先權日2012年10月24日
發明者陳月華, 羅洋, 謝池楚, 李蓬飛, 蔡峻 申請人:南開大學