專利名稱：一種腈水解酶及其基因序列與應用方法
技術領域：
本發明涉及源自惡臭假單胞菌iPsGudomorms put i da ) XY4 (保藏編號CGMCCNo. 3830)的一種新型腈水解酶的基因序列，以及腈水解酶工程菌的構建、重組腈水解酶的高效表達和分離純化，屬于酶基因工程及酶工程領域。
背景技術：
腈水解酶能夠催化腈類化合物轉化為具有廣泛應用價值的羧酸類化合物，如丙烯酸、扁桃酸、煙酸、異煙酸、亞氨基二乙酸、甘氨酸等。同時該酶可以用于處理含有腈的廢水和腈污染的有毒廢水。腈水解酶作用底物的廣泛性及優良的化學、區域、立體選擇性使其在羧酸合成中表現出巨大應用潛力，在制藥、飼料、食品、環保等領域具有良好的應用前景。 煙酸，又稱為3-吡啶甲酸，是人體必需的13種維生素之一，廣泛應用于食品和飼料添加劑。煙酸作為藥物除了能夠治療糙皮病外，還可以用于治療動脈粥樣硬化、心血管疾病、糖尿病等。另外煙酸可作為形成活性污泥的生化激素、空氣和廢氣的除臭劑。煙酸在染料、感光材料、洗滌劑等方面也有一定的應用。煙酸的生產可采用化學方法和生物方法合成，目前在工業上，仍主要采用化學法來進行煙酸的生產，如氨氧化法、氣相氧化法、電解氧化法和吡啶羥基化法等，所采用原料一般為3-甲基吡唆、2-甲基-5-乙基吡唆、3-氰基吡啶以及哇琳等。如專利CN200810058492. 4公開了以吡啶為溶劑，二氧化硒為氧化劑，3-甲基吡啶為原料合成煙酸的方法，反應溫度為10(Tl50 °C，反應選擇性在98. 5%以上，但產品收率僅4(Γ50%。專利CN95191372. 7公開了以3-甲基吡啶為原料，在釩、鈦氧化物催化劑存在下，按氧3-甲基吡啶摩爾比15 40，水3-甲基吡啶摩爾比1(Γ70條件下進行一步氣相非均相催化氧化反應，煙酸收率為82 86%，但該法反應溫度250-290°C，對設備要求較高，能耗較大，而且收率偏低。從這些情況可以看出，化學合成法產率較低，產品副產物較多，需采用價格昂貴的催化劑，產品的后續分離純化困難，而且能耗偏高，污染較嚴重。因此，化學法應用于煙酸制備仍存在諸多不足之處。相對于傳統化學方法，生物催化法反應條件溫和，環境友好，催化劑易于制備，催化效率較高，選擇性強且成本較低，適合于工業化生產，為煙酸的大規模制備提供了一條行之有效的途徑。自1988年,Mathew等采用能產腈水解酶的菌株TSotZococciAs rhodochrousJI催化3-氰基吡啶合成煙酸，此后陸續報道能產腈水解酶的菌株Λ rhodochrousLL100-21> Rhodococcus sp> Bacillus pallidus Dac521 > Nocardia globerula NHB—2、Rhodococcus sp. NDB 1165 > Rhodobacter sphaeroides LHS-305 等微生物的游離細胞或固定化細胞被應用于催化3-氰基吡啶合成煙酸。為了進一步提高催化劑的穩定性及催化效率，同時為深入了解腈水解酶的分子機理，很多研究者對野生菌腈水解酶的基因進行克隆表達。但是應用于催化3-氰基吡啶轉化為煙酸的野生菌的腈水解酶基因的克隆、表達、酶學性質報導不多。目前國內沒有對惡臭假單胞菌腈水解酶基因的克隆、表達的研究。惡臭假單胞菌putida') XY4 (保藏編號CGMCC No. 3830)為本實驗室篩選到的一株具有腈水解酶活性的菌株，能夠催化3-氰基吡啶產煙酸。此外，惡臭假單胞菌(.Pseudomonas putida ) (保藏編號CGMCC No. 3830)所產的腈水解酶還能夠轉化4-氰基吡唆、2-氯-4氰基吡啶、亞氨基二乙腈、氰基吡嗪、甘氨腈等腈類化合物產生相應的酸。因此惡臭假單胞菌putida) IYA (保藏編號CGMCC No. 3830)腈水解酶基因的克隆及其在大腸桿菌中的高效表達，為其實際應用及作用機理研究顯得非常重要。

發明內容
本發明的目的是提供一種新的腈水解酶及其基因的克隆方法，該腈水解酶由SEQID :2所不的氣基酸序列構成，由SEQ ID :I所不的基因序列編碼。該臆水解酶由一株惡臭假單胞菌產生，該株惡臭假單胞菌于2010年5月11日保藏在北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 3830，分類命名為惡臭假單胞菌putida)TiA0本發明的另一個目的是提供包含本發明基因的質粒及包含本表達質粒的宿主細胞。
為了實現本發明的技術目的，本發明的技術方案在于
I、所述的腈水解酶完整基因序列的克隆方法。(I)惡臭假單胞菌putidaYHA (保藏編號 CGMCC No. 3830)腈水解酶基因部分序列(Nit M)的克隆將屬腈水解酶氨基酸序列進行同源比對,采用C0DEH0P軟件進行引物設計，經DNAMAN軟件進一步分析，設計一對簡并引物Pl和P2，以惡臭假單胞菌putida') XY4 (保藏編號CGMCC No. 3830)總DNA為模板克隆Nit M序列
Pl: 5’ -GGGGGMGCTGaarccnacnca-3’
P2: 5， -ACGTCGGGCCTGswrtartgncc-3’
PCR反應在50 μ L體系中進行，反應條件為95°C預變性5 min ；94 °C變性30 s, 55-65°C退火40 s,72 °C延伸40 S，共30個循環；72 °C終延伸10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收，回收片段與PMD19-T載體連接后轉化大腸桿菌(Bscherichia coli) JM109，轉化產物涂布含氨芐抗性的LB平板上。經37 1培養過夜，挑取單菌落接入含有氨芐抗性的LB液體培養基，培養10-14 h后提取質粒，以Pl和P2為引物PCR驗證插入目的片段的質粒進行序列測定。(2)惡臭假單胞菌/7Wiii/a)XY4 (保藏編號 CGMCC No. 3830)腈水解酶基因5’端序列(Nit 5’)的克隆根據分離純化惡臭假單胞菌(Aewi/offioftas putida)Ti^(保藏編號CGMCC No. 3830)所產腈水解酶測得的N端序列設計簡并引物P3，根據上述得到的Nit M序列設計引物P4,以惡臭假單胞菌(Aewt/offlmas putida) XY4 (保藏編號CGMCCNo. 3830)總DNA為模板克隆Nit 5，端序列
P3: 5， -ATGGTRACATAYACNAAYAA-3’
P4: 5’ - TCTACATGCGTCGGCTTCAGCTT-3’
PCR反應在50 μ L體系中進行，反應條件為95 °C預變性5 min ；94 °C變性30 s, 50-60°C退火40 s,72 °C延伸40 S，共30個循環；72 °C終延伸10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收，回收片段與pMD-19 T載體連接后轉化疋coli JM109，轉化產物涂布含氨芐抗性的LB平板上。經37 °C培養過夜，挑取單菌落接入含有氨芐抗性的LB液體培養基，培養10-14 h后提取質粒，以P3和P4為引物PCR驗證插入目的片段的質粒進行序列測定。(3)惡臭假單胞菌putidaYHA (保藏編號 CGMCC No. 3830)腈水解酶基因3’端序列(Nit 3’)的克隆根據上述得到的Nit M序列設計三條特異性引物P5、P6和P7,用上述三條引物和Tail-PCR方法中所用的隨機引物，以惡臭假單胞菌
putida) (保藏編號CGMCC No. 3830)總DNA為模板克隆Nit 3’端序列
P5: 5’ -CGATGGCGGCAGCCTCTACATGAG-3’
P6: 5’ -GACGAAAGCTGAAACCCACTCATGTA-3’
P7: 5’ -CCAGACCCCAACCAAATACGCGATGT-3’
PCR反應在50 μ L體系中進行，反應條件為Tail-PCR方法中所用的條件。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收，回收片段與PMD19-T載體連接后轉化疋coli JM109，轉化產物涂布含氨芐抗性的LB平板上。經37°C培養過夜，挑取單菌落接入含有氨芐抗性的LB液體培養基，培養10-14 h后提取質粒，以P7和NAP (隨機引物)為引物PCR驗證插入目的片段的質粒進行序列測定。(4)腈水解酶基因的生物信息學分析^fNit M序列、5’端序列和3’端序列進行拼接，拼接序列在NCBI上進行分析,獲得腈水解酶的開放閱讀框(OpenReading Frame),進而推導出腈水解酶的氨基酸序列。2、所述的腈水解酶基因的工程菌的構建和表達方法。(I)含編碼腈水解酶基因的表達質粒的構建設計含有NdeI和ECORI酶切位點的引物P8和P9,以惡臭假單胞菌putida ) XY4 (保藏編號CGMCC No. 3830)總DNA為模板克隆腈水解酶全長基因序列
P8: 5’ -GGATATCGGATATCCATATGGTTACGTACACGAATAAGTTC-3>
P9: 5’ -CCGGAATTCTCAGCTCTCTTCATGGACCTTAA-3>
PCR反應在50 μ L體系中進行，反應條件為95 °C預變性5 min ；94 °C變性30 s, 50-60°C退火40 s,72 °C延伸40 S，共30個循環；72 °C終延伸10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收，回收片段與PMD19-T載體連接后轉化疋coli JM109，轉化產物涂布含氨芐抗性的LB平板上。經37 °C培養過夜，挑取單菌落接入含有氨芐抗性的LB液體培養基，培養10-14 h后提取質粒，酶切驗證插入目的片段的質粒進行序列測定，測序正確的命名為pMD19T-Nit。將質粒PMD19T-Nit和pET_28a(+)分別進行雙酶切后割膠回收，割膠回收片段連接后轉化大腸桿菌萬.coli Rosetta-gami (DE3)感受態細胞,在含卡那霉素和氯霉素抗性的LB平板培養過夜，挑取單菌落接入含有卡那霉素和氯霉素抗性的LB液體培養基，培養10-14 h后提取質粒，酶切驗證插入目的片段的質粒命名為pET28a(+)-Nit。(2)重組腈水解酶的誘導表達將重組菌體萬.coli Rosetta-gami (DE3)/pET28a(+)-Nit接入含卡那霉素和氯霉素的LB液體培養基中37 1培養過夜，轉接至新鮮的LB培養基中37 °C培養至0D600達0. 8-1. 0，添加終濃度0. 2-1. 3 mM的IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)在25-30 1下進行產酶誘導4-24 h，重組菌株表現出腈水解酶活性。(3)重組腈水解酶的純化及酶學性質將上述獲得的重組菌株的發酵液離心后收集菌體，菌體洗滌后超聲破碎。通過高速離心所得上清液即為無細胞抽提液。采用Akta系統純化重組腈水解酶，Ni-NTA瓊脂糖凝膠柱用緩沖液A沖洗至平衡，然后上樣，待完全吸附后，分別用含緩沖液A和含400 mM咪唑的緩沖液A梯度洗脫，收集各階段洗脫峰，活力組分在50 mM磷酸緩沖液(pH7. 4)中透析過夜后，得到純化的腈水解酶。通過SDS-PAGE分析純化后的腈水解酶的純度和分子量大小，并測定純化酶的酶活及反應最適PH和最適溫度。本發明提供了一種新的腈水解酶基因完整DNA序列的克隆及其序列，腈水解酶工程菌萬.coli Rosetta-gami (DE3) /pET28a (+) -Nit的構建及重組腈水解酶的高效表達和純化。本發明所涉及的腈水解酶為目前國內A PUtida腈水解酶的首例報道。經Blast比對惡臭假單胞菌putida^TiA (保藏編號 CGMCC No. 3830)與已報道putidaMTCC5100腈水解酶氨基酸的同源性僅為40%，與目前所報道的所有腈水解酶同源性最高的僅達62. 1%,說明源于惡臭假單胞菌保藏編號CGMCC No. 3830)的腈水解酶為一種新型腈水解酶。重組菌株萬.coli Rosetta-gami (DE3)/pET28a (+) -Nit表現出較高腈水解酶活性，純化腈水解酶的最適反應溫度為55°C,最適反應pH為7. 5，該酶能有效地將底物3-氰基吡啶轉化為煙酸。此外，重組菌株發酵周期短，催化效率高，適合于工業生產煙酸的需要。


圖I :重組腈水解酶分離純化SDS-PAGE圖譜。泳道I :無細胞抽提液上清；泳道2 :為純化后的腈水解酶；泳道3 :標準蛋白分子量 Marker
圖2 :重組腈水解酶的最適反應溫度(以3-氰基吡啶為底物反應)。圖3 :重組腈水解酶的最適反應pH (以3-氰基吡啶為底物反應)。pH6-7. 5為檸檬酸鈉緩沖液，pH7_8為磷酸鈉緩沖液，pH7. 5-8. 5為Tris-HCl緩沖液，pH8. 0-9. 5為氯化銨緩沖液。
具體實施例方式實施實例I
本實施例說明腈水解酶基因部分序列(Nit M)的克隆方法。惡臭假單胞菌)XY4(保藏編號CGMCC No. 3830)Nit M序列的克隆^PsGudomorms屬腈水解酶氨基酸序列進行同源比對,采用C0DEH0P軟件進行弓丨物設計，經DNAMAN軟件進一步分析，設計一對簡并引物Pl和P2,以惡臭假單胞菌iPseudomoimsputida ) (保藏編號CGMCC No. 3830)總DNA為模板克隆Nit M序列
Pl: 5’ -GGGGGMGCTGaarccnacnca-3’
P2: 5， -ACGTCGGGCCTGswrtartgncc-3’
PCR反應在50 μ L體系中進行，反應條件為95 °C預變性5 min ；94 °C變性30 S，60°C退火40 s，72 °C延伸40 s，共30個循環；72 °C終延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收，回收片段與PMD19-T載體用T4連接酶在16 °C連接12 h，連接產物42°C熱擊90 s轉化F. coli JM109，轉化產物涂布含氨芐抗性(100 mg/L)的LB平板上。經37 °C培養過夜，挑取3個菌落接入含氨芐抗性(100 mg/L) LB液體培養基，培養10 h后提取質粒，以Pl和P2為引物經PCR驗證插入目的片段的質粒進行序列測定。實施實例2本實施例說明腈水解酶基因5’端序列(Nit 5’)的克隆方法。惡臭假單胞菌putida)XY4 (保藏編號 CGMCC No. 3830)的 Nit 5’序列的克隆根據分離純化惡臭假單胞菌putida) XY4 (保藏編號CGMCCNo. 3830)所產腈水解酶測得的N端序列設計簡并引物P3，根據上述得到的Nit M序列設計弓丨物P4,以惡臭假單胞菌iPsoudomorms putida^JX^ (保藏編號CGMCC No. 3830)總DNA為模板克隆Nit 5’端序列
P3: 5， -ATGGTRACATAYACNAAYAA-3’
P4: 5’ - TCTACATGCGTCGGCTTCAGCTT -3’
PCR反應在50 μ L體系中進行，反應條件為95 °C預變性5 min ；94 °C變性30 s, 55°C退火40 s，72 °C延伸40 s，共30個循環；72 °C終延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收，回收片段與PMD19-T載體用T4連接酶在16°C連接12 h，連接產物42 °C熱擊90 s轉化疋coli JM109，轉化產物涂布含氨芐抗性(100 mg/L)的LB平板上。經37°C培養過夜，挑取3個菌落接入含有氨芐抗性(100 mg/L)LB液體培養基，培養10 h后提取質粒，以P3和P4為引物經PCR驗證插入目的片段的質粒進行序列測定。實施實例3
本實例說明腈水解酶基因3’端序列的克隆方法。根據上述得到的Nit M序列設計三條特異性引物P5、P6和P7，用上述三條引物和Tail-PCR方法中所用的隨機引物，以惡臭假單胞菌putida) TiA (保藏編號CGMCC No. 3830)總DNA為模板克隆Nit 3，端序列
P5: 5’ -CGATGGCGGCAGCCTCTACATGAG-3’
P6: 5’ - GACGAAAGCTGAAACCCACTCATGTA-3’
P7: 5’ -CCAGACCCCAACCAAATACGCGATGT-3’
PCR反應在50 μ L體系中進行，反應條件為Tail-PCR方法中所用的條件。以Ρ5與非特異性引物API、ΑΡ2、AP3、AP4分別進行第一輪PCR。選取P5與AP2擴增的PCR產物為模板，P6和NAP為引物進行第二輪擴增。以第二輪PCR產物為模板，P7和NAP為引物進行第三輪PCR。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收，回收片段與PMD19-T載體用T4連接酶在16 °C連接12 h，連接產物42 °C熱擊90 s轉化￡ coli JM109，轉化產物涂布含氨芐抗性(100 mg/L)的LB平板上。經37 °C培養過夜，挑取3個菌落接入含有氨芐抗性(100mg/L)的LB液體培養基，培養10 h后提取質粒，以P7和NAP為引物經PCR驗證插入目的片段的質粒進行序列測定。實施實例4
本實例說明腈水解酶完整基因序列的克隆方法。將腈水解酶M序列、5’端序列和3’端序列進行拼接，拼接序列在NCBI進行分析獲得開放閱讀框(OpenReading Frame),基因全長1113bp,編碼370個氨基酸。設ii^一對含有NdeI和ECORI酶切位點的引物P8和P9，以惡臭假單胞菌麗was putida)XY4 (保藏編號CGMCC No. 3830)總DNA為模板克隆腈水解酶基因全長序列
P8: 5’ -GGATATCGGATATCCATATGGTTACGTACACGAATAAGTTC-3>
P9: 5’ -CCGGAATTCTCAGCTCTCTTCATGGACCTTAA-3>
PCR反應在50 μ L體系中進行，反應條件為在95 °C預變性5 min ；94 °C變性30 s，55°C退火40 s，72 °C延伸Imin 30s，共30個循環；72 °C終延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收，回收片段與PMD19-T載體用T4連接酶在16 °C連接12 h，連接產物42 °C熱擊90 s轉化萬.coli JM109，轉化產物涂布含氨芐抗性(100 mg/L)的LB平板上。經37 °C培養過夜，挑取3個菌落接入含氨芐抗性(100 mg/L) LB液體培養基，培養10h后提取質粒，用NdeI和ECORI雙酶切質粒，驗證插入目的片段的質粒進行序列測定，測序正確的命名為pMD19T-Nit。實施實例5
本實施例說明重組質粒的構建程序。本研究所采用的表達質粒是pET_28a(+),帶有T7啟動子和His_tag標記,將質粒 pET-28a(+)和pMD19T-Nit分別用NdeI和ECORI進行雙酶切后割膠回收，回收片段用T4連接酶在16 °C連接12 h，連接產物42 °C熱擊90 s轉化E coli Rosetta-gami (DE3)感受態細胞，在含卡那霉素(10 mg/L)和氯霉素(35 mg/L)的LB平板培養12 h，挑取3個菌落接入含卡那霉素(10 mg/L)和氯霉素(35 mg/L)的LB液體培養基，培養10 h后提取質粒，用NdeI和ECORI雙酶切驗證插入目的片段的重組質粒命名為pET28a (+)-Nit，含有重組質粒的重組菌體命名為萬· co7iRosetta-gami (DE3)/pET28a(+)-Nit。實施實例6
本實施例說明重組腈水解酶的誘導表達。將重組菌體疋coli Rosetta-gami (DE3)/pET28a(+)-Nit 接入含卡那霉素(10mg/L)和氯霉素(35 mg/L)LB液體培養基中37 °C培養12 h，轉接至新鮮的LB培養基中37°C培養至0D600達O. 1，添加終濃度O. 2 mM的IPTG (異丙基硫代-β -D-半乳糖苷)在30°〇下進行產酶誘導4. 5 h，重組菌株表現出最高腈水解酶活性。實施實例7
本實施例說明重組腈水解酶的分離純化與酶學特征。將重組菌體的發酵液于4°C，5000 rpm離心5 min，去除上清。離心收集的細胞懸浮于緩沖液A (50 mM磷酸鈉、500 mM氯化鈉，pH7. 4)中，制備成菌懸液。菌懸液在冰浴中用超聲破碎儀破碎，200 W功率下工作30min，每個循環工作2 s停4s。樣品用結晶紫進行染色，在顯微鏡下進行觀察，直到顯示細胞完全裂解為止。細胞破碎液4 1下20，000 rpm離心10 min，所得上清液即為無細胞抽提液。無細胞抽提液用O. 45 μ m濾膜過濾制備成上樣樣品，采用Akta系統純化重組腈水解酶。先將Ni-NTA瓊脂糖凝膠柱用緩沖液A沖洗至平衡，沖柱流速2 mL/min，而后上樣，上樣流速為I mL/min，待完全吸附后，用緩沖液A、含400mM咪唑的緩沖液梯度洗脫，洗脫流速2 mL/min，收集各階段洗脫峰，活力組分在50 mM磷酸緩沖液(PH7. 4)透析過夜后，得到純化的腈水解酶。純化后重組腈水解酶達到電泳純(圖I)，表觀分子量為42000道爾頓。以3-氰基吡啶為底物時，腈水解酶的最適反應溫度為55° C (圖2)，最適反應pH為7. 5 (圖3)。在最適反應條件下，純化重組腈水解酶能在20 min內將50mM 3-氰基吡啶全部轉化為煙酸，酶活為157. 55 μ mo I /(mg· min)。
權利要求
1.一種來源于惡臭假單胞菌putida) ViA (編號CGMCC3830)的新型腈水解酶，其完整的DNA序列和氨基酸序列如SEQ ID NO: I和SEQ ID NO: 2所示。
2.—種權利要求I所述的腈水解酶基因的克隆方法，其特征為，采用如下步驟完成(1)惡臭假單胞菌putida)m(編號CGMCC3830)腈水解酶基因部分序列(Nit M)的克隆 PsGudomorms屬腈水解酶氨基酸序列進行同源比對,采用C0DEH0P軟件進行引物設計，經DNAMAN軟件進一步分析，設計一對簡并引物Pl和P2，以惡臭假單胞菌(.Pseudomonas putida ) XY4 (編號 CGMCC3830)總 DNA 為模板克隆 Nit M 序列Pl: 5’ -GGGGGMGCTGaarccnacnca-3’P2: 5， -ACGTCGGGCCTGswrtartgncc-3’PCR反應在50 μ L體系中進行，反應條件為95 °C預變性5 min ；94 °C變性30 s, 55-65°C退火40 s,72 °C延伸40 S，共30個循環；72 °C終延伸10 min ;PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收，回收片段與PMD19-T載體連接后轉化大腸桿菌(Escherichia co7i) JM109，轉化產物涂布含氨芐抗性的LB平板上；經37°C培養過夜，挑取單菌落接入含有氨芐抗性的LB液體培養基，培養10-14 h后提取質粒，Pl和P2為引物PCR驗證插入目的片段的質粒進行序列測定；(2)惡臭假單胞菌iPsGudomormsputida )XY4(編號CGMCC3830)腈水解酶基因5’端序列(Nit 5’)的克隆根據分離純化惡臭假單胞菌編號CGMCC3830)所產Nit酶測得的N端序列設計簡并引物P3，根據上述得到的Nit M序列設計引物P4，以惡臭假單胞菌iPsGudomorms putida) XY4 (編號CGMCC3830)總DNA為模板克隆Nit 5’端序列P3: 5， -ATGGTRACATAYACNAAYAA-3’P4: 5’ - TCTACATGCGTCGGCTTCAGCTT -3’PCR反應在50 μ L體系中進行，反應條件為95 °C預變性5 min ；94 °C變性30 s, 50-60°C退火40 s,72 °C延伸40 S，共30個循環；72 °C終延伸10 min ;PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收，回收片段與PMD19-T載體連接后轉化大腸桿菌疋coli JM109，轉化產物涂布含氨芐抗性的LB平板上；經37 °C培養過夜，挑取單菌落接入含有氨芐抗性的LB液體培養基，培養10-14 h后提取質粒，P3和P4為引物PCR驗證插入目的片段的質粒進行序列測(3)惡臭假單胞菌putida) XY4 (編號CGMCC3830)腈水解酶基因3’端序列(Nit 3’)的克隆根據上述得到的Nit M序列設計三條特異性引物P5、P6和P7，以此三條引物和Tail-PCR方法中所涉及的隨機引物API、AP2、AP3、AP4和NAP，P. putidaCGMCC3830總DNA為模板克隆Nit 3，端序列P5: 5’ -CGATGGCGGCAGCCTCTACATGAG-3’P6: 5’ - GACGAAAGCTGAAACCCACTCATGTA-3’P7: 5’ -CCAGACCCCAACCAAATACGCGATGT-3’PCR反應在50 μ L體系中進行，反應條件為Tail-PCR方法中所用的條件；PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收，回收片段與PMD19-T載體連接后轉化大腸桿菌疋coliJM109，轉化產物涂布含氨芐抗性的LB平板上；經37 1培養過夜，挑取單菌落接入含有氨芐抗性的LB液體培養基，培養10-14 h后提取質粒，P7和NAP (隨機引物)為引物PCR驗證插入目的片段的質粒進行序列測定；(4)腈水解酶基因的生物信息學分析將腈水解酶的M序列、5’端序列和3’端序列進行拼接，拼接序列在NCBI進行分析獲得Nit酶的開放閱讀框(OpenReading Frame),進而推導出腈水解酶的氨基酸序列。
3.—種權利要求I所述的腈水解酶基因的工程菌的構建和表達的方法，其特征為，具體步驟如下(I)含編碼腈水解酶基因的表達質粒的構建設計分別含有NdeI和ECORI酶切位點的引物P8和P9，以惡臭假單胞菌putida)TiA (編號CGMCC3830)總DNA為模板克隆Nit基因P8: 5’ -GGATATCGGATATCCATATGGTTACGTACACGAATAAGTTC-3>P9: 5’ -CCGGAATTCTCAGCTCTCTTCATGGACCTTAA-3>PCR反應在50 μ L體系中進行，反應條件為95 °C預變性5 min ；94 °C變性30 s,50-60°C退火40 s，72 °C延伸40 s，共30個循環；72 °C終延伸10 min ;PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收，回收片段與PMD19-T載體連接后轉化大腸桿菌疋coli JM109，轉化產物涂布含氨芐抗性的LB平板上；經37°C培養過夜，挑取單菌落接入含有氨芐抗性的LB液體培養基，培養10-14 h后提取質粒，酶切驗證插入目的片段的質粒命名為pMD19T-Nit，對該質粒進行序列測定；將質粒pMD19T-Nit和pET-28a(+)分別用NdeI和ECORI雙酶切后割膠回收，回收片段連接后轉化大腸桿菌疋coli Rosetta-gami (DE3)感受態細胞，在含卡那霉素和氯霉素抗性的LB平板培養過夜，挑取單菌落接入含有卡那霉素和氯霉素抗性的LB液體培養基，培養10-14 h后提取質粒，酶切驗證插入目的片段的質粒命名為pET28a(+)-Nit ；(2)重組腈水解酶的誘導表達將重組菌體萬.coliRosetta-gami (DE3) /pET28a(+)-Nit接入含卡那霉素和氯霉素的LB液體培養基中37 1培養過夜，轉接至新鮮的LB培養基中37 °C培養至0D600達0. 8-1. 0，添加終濃度0. 2-1. 3 mM的IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)在25-37 1下進行產酶誘導4-24 h，重組菌株表現出腈水解酶活性；(3)重組腈水解酶的純化及酶學性質將上述獲得的重組菌體發酵液離心后收集菌體，菌體洗滌后超聲破碎，高速離心所得上清液即為無細胞抽提液；采用Akta系統純化重組腈水解酶，Ni-NTA瓊脂糖凝膠柱用緩沖液A沖洗至平衡，然后上樣，待完全吸附后，分別用含緩沖液A和含400 mM咪唑的緩沖液A梯度洗脫，分別收集各階段洗脫峰，通過SDS-PAGE分析純化后的腈水解酶的純度和分子量大小，并測定純化酶的酶活及反應最適PH和最適溫度。
全文摘要
本發明涉及一種新型腈水解酶及其基因的克隆和表達。從惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)XY4(編號CGMCC No.3830)的總DNA獲得腈水解酶基因SEQ ID NO:1，該基因全長1113個核苷酸，編碼370個氨基酸SEQ ID NO:2。本發明還公開了重組腈水解酶的構建、高效表達和純化的方法，以及純化重組腈水解酶的最適作用溫度和pH。以質粒pET28a(+)為表達載體，以E.coliRosetta-gami(DE3)為表達宿主，實現腈水解酶基因的高效表達。重組腈水解酶最適作用溫度為55℃，最適作用pH為7.5，能高效轉化3-氰基吡啶為煙酸，具有較大的工業化生產潛力和經濟價值。
文檔編號C12N15/55GK102936590SQ20121043309
公開日2013年2月20日 申請日期2012年11月5日 優先權日2012年11月5日
發明者許正宏, 朱小燕, 李恒, 史勁松, 龔勁松, 錢建瑛 申請人:江南大學