專利名稱：一種谷氨酸脫羧酶及其編碼基因和用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學技術領域，尤其涉及一種谷氨酸脫羧酶及其編碼基因和用途。
背景技術：
谷氨酸脫羧酶(glutamatedecarboxylase,簡稱 GAD ；EC4. I. I. 15)是一種廣泛地存在于植物、動物和微生物中的氨基酸脫羧酶，它可以專一地催化L-谷氨酸的α -羧基脫羧反應生成Y -氨基丁酸(Y-aminobutyricacid,簡稱GABA)。GABA是一種天然存在的非蛋白質氨基酸，是哺乳動物中樞神經系統的一種關鍵的抑制性神經遞質，約50%的中樞神經突觸部位以GABA為遞質，具有抑制中樞神經系統過度興奮、解除神經緊張等生理功能。由于身心緊張會導致人體血壓升高、免疫功能失調、代謝紊亂，因此GABA對人體具有鎮靜 安神、促進睡眠、健腦益智、降低血壓、改善免疫功能、延緩衰老等作用，是一種在食品和醫藥領域具有廣泛應用的天然氨基酸，已被國家衛生部批準為“新資源食品”。GABA雖然在生物體內廣泛存在，但含量卻很低，難以進行分離，需要對其進行合成制備。目前合成GABA的方法主要是化學合成法和生物合成法。與化學合成相比，生物合成GABA主要是利用生物體內的谷氨酸脫羧酶作為催化劑，以L-谷氨酸鈉為底物生產GABA。該法的優點在于合成條件溫和，不需要昂貴的原材料，能耗小，污染小。因此，利用谷氨酸脫羧酶或具有該酶活力的細胞進行GABA的生物制備正得到越來越多的重視。中國專利申請200510049189. 4和中國專利申請200510049187. 5公開了一種生產Y-氨基丁酸的短乳桿菌(Lactobacillus brevis) CGMCCN0. 1306,該菌株具有高效生物合成GABA的能力，對該菌株的gad基因進行克隆，構建重組質粒，轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中，可實現可溶表達。但是，該基因表達的GAD的催化活力不高，不利于該酶在GABA生物制備中的廣泛應用。在工業生產中，往往希望提高反應速率，從而提高生物催化與轉化的效率。GAD作為生物技術富集生產GABA的關鍵酶，提高其催化活性有利于其在大規模生物反應器中的應用。1989年，Leung等首次提出了一種能夠簡便、快速地在DNA序列中制造隨機突變的方法易錯PCR (error-prone PCR)。其基本原理是利用在PCR過程中出現的堿基錯配進行特定基因隨機誘變的技術。它是研究蛋白質結構與功能之間的復雜關系的有力工具，也是在實驗室中改造基因的常用手段。

發明內容
本發明提供了一種谷氨酸脫羧酶，該酶具有高于野生型谷氨酸脫羧酶的酶活力，能高效催化合成Y-氨基丁酸。一種谷氨酸脫羧酶，其氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。本發明還提供了一種編碼所述谷氨酸脫羧酶的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo. 2所示。
所述基因為Q51H，該基因第51位編碼谷氨酰胺(Gln)的密碼子CAA突變為編碼組氨酸(His)的密碼子 CAT (Gln51 — His)。本發明還提供了含有所述基因的表達單元、重組載體或轉化子。所述表達單元的啟動子為T7啟動子、Iac啟動子或araBAD啟動子。在這些啟動子的作用下，谷氨酸脫羧酶可以直接在大腸桿菌宿主細胞中實現胞內可溶表達。
所述重組載體的原始載體為pET_28a (+)。本發明還提供了所述谷氨酸脫羧酶在生產Y-氨基丁酸上的應用。該酶具有高于野生型谷氨酸脫羧酶的酶活力，以該酶為催化劑，可將底物(L-谷氨酸鈉或其鹽)高效轉化為Y-氨基丁酸。所述谷氨酸脫羧酶的制備方法為(I)以gad基因為模板，進行易錯PCR擴增，將PCR產物轉入感受態細胞，構建突變文庫；(2)利用誘導物誘導突變文庫表達，獲得表達文庫；(3)對表達文庫進行酶活分析和序列測定，篩選目的突變基因；(4)構建含有目的突變基因的重組工程菌，誘導培養后對獲得的粗酶液進行分離純化，得到谷氨酸脫羧酶。所述gad 基因來自短乳桿菌(Lactobacillus brevis) CGMCC NO. 1306,其核昔酸序列如SEQ ID No. 3所示。該菌株已在中國專利申請200510049189. 4和中國專利申請200510049187. 5中公開，由浙江大學保藏在中國普通微生物保藏管理中心(地址北京市朝陽區北辰西路I號院)，本發明使用的菌株由浙江大學饋贈。所述易錯PCR擴增所使用的引物為上游引物5’-GGGGATCCATGGCTATGTTATATGGTAAAC-3’ ；下游引物5’ -GGGAATTCTTAGTGAGTGAATCCGTATTT-3 ’。所述易錯PCR擴增體系為50 μ L，其中5 μ L IOx易錯PCR緩沖液，14 μ LMg2+ (25mmol · L O 4 μ L dNTP (2. 5mmoI · L Μ6ΤΡ>2. 5mmoI · L ΜΑΤΡ、2· 5mmoI · L MCTP和2. 5mmol · ΓΜΤΤΡ混合物)，I μ L上游弓丨物(IOpmol · μ Γ1)，I μ L下游弓丨物(IOpmol · μ L O , 3 μ L 5mmoI · L 1MnCl2,1 μ L 質粒模板(IOpmoI · L O , 5U Taq DNA 聚合酶，滅菌超純水補至為50 μ L。所述易錯PCR擴增程序為94°C變性5min ;94°C變性30s，57°C退火30s，72°C延伸2min,30 個循環；72°C延伸 5min。易錯PCR是在進行目的基因擴增的同時，通過調整反應條件，如提高鎂離子濃度、加入錳離子、改變體系中四種dNTPs濃度或運用低保真度的DNA聚合酶等，來改變擴增過程中的突變頻率，從而以一定的頻率向目的基因中隨機引入突變，獲得蛋白質分子的隨機突變體。含易錯PCR產物的重組載體轉入感受態細胞后，在未加誘導物的情況下，細胞內的外源基因很難獲得高效表達。IPTG可以作為具有IacZ或tac等啟動子的表達載體的表達誘導物使用。IPTG普遍用于原核表達系統，誘導外源基因表達，使其表達量增高，產物穩定，具有易鑒定、易純化的優點。本發明采用的高通量篩選技術是以分子水平或細胞水平的實驗方法為基礎，以微孔板作為實驗工具載體，以自動化操作系統執行試驗過程，以靈敏快速的檢測儀器采集試驗結果，以計算機分析處理試驗數據，在同一時間檢測數以千萬的樣品，并以得到的相應數據庫支持運轉。具有微量、快速、靈敏和準確等特點。與現有技術相比，本發明的有益效果為

本發明提供的谷氨酸脫羧酶具有高于野生型谷氨酸脫羧酶的酶活力，其催化底物L-谷氨酸鈉轉化為產物Y-氨基丁酸(GABA)的速率是野生型谷氨酸脫羧酶的2. 5倍，更有利于利用谷氨酸脫羧酶進行GABA的生物制備。


圖I為易錯PCR構建突變文庫原理示意圖。圖2為突變位點Gln51在GAD三級結構中的位置圖(以球表示)。圖3為粒pET28a(+)_gad的基因圖譜。圖4為易錯PCR產物及pET_28a(+)載體經酶切純化后的凝膠電泳圖譜。圖5為變體酶和野生型GAD在pH 4. 8條件下的比活力。圖6為變體酶和野生型GAD在不同pH條件下的比活力。
具體實施例方式為進一步說明本發明，結合以下實例具體說明一、構建突變文庫突變文庫構建原理如圖I所示，突變針對的突變位點Gln51在GAD三級結構中的位置如圖2所示,所用模板為質粒pET28a(+) -gad,其基因圖譜如圖3所示。根據短乳桿菌(Lactobacillus brevis) CGMCC NO. 1306的谷氨酸脫羧酶基因設計引物上游引物5’-GGGGATCCATGGCTATGTTATATGGTAAAC-3> (下劃線處為 BamHI 的酶切位點)；下游引物5’-GGGAATTCTTAGTGAGTGAATCCGTATTT-3> (下劃線處為 EcoRI 的酶切位點)。以含有GAD1407基因(Gene ID :4412752)的質粒為模板，進行易錯PCR擴增。PCR 擴增體系為 50 μ L，其中5 μ L IOx 易錯 PCR 緩沖液，14 μ LMg2+ (25mmol · L—1)，4 μ LdNTP (2. 5mmol ·ΓΜ6ΤΡ,2. 5mmol ·ΓΜΑΤΡ,2. 5mmol ·L-1ClCTP 和 2. 5mmol ·ΓΜΤΤΡ 混合物)，I μ L 上游引物(IOpmoI · μ L O , I μ L 下游引物(IOpmoI · μ L O , 3 μ L SmmoI · L 1MnCl2,
Iμ L質粒模板(IOpmoI · I/1)，5U Taq DNA聚合酶，滅菌超純水補至50 μ L。PCR 擴增程序為94°C變性 5min ;94°C變性 30s，57°C退火 30s，72°C延伸 2min，30次循環，最后再72°C延伸5min。PCR產物經過電泳檢測，其條帶單一、清晰。將易錯PCR產物用PCR純化試劑盒進行純化回收。純化后的易錯PCR產物用限制性內切酶BamHI、EcoRI和DpnI于37°C進行酶切。酶切條件為DNA 40 μ L、10X greenbuffer 10 μ L, BamHI 2· 5 μ L、EcoRI 2· 5 μ L、DpnI IyUddH2O 44 μ L，37°C 酶切 30 min。酶切后的PCR產物用PCR純化試劑盒進行純化。pET-28a (+)用限制性內切酶BamHI和EcoRI進行雙酶切，酶切條件為DNA80 μ LUOXgreen buffer 10 μ L、BamHI 2· 5 μ L、EcoRI 2· 5 μ L、ddH20 5 yL，37°C 酶切30min。經酶切后的pET-28a(+)進行電泳純化并回收?；厥债a物通過凝膠電泳驗證，其電泳結果如圖4所示。經酶 切、純化后的PCR產物與pET_28a(+)連接。連接條件為10XT4 buffer
2μ L、酶切后的PCR產物8 μ L、酶切后的質粒載體9 μ L、T4連接酶I μ L，連接溫度為22°C，連接25min。采用熱激法將連接產物轉化到大腸桿菌BL21 ( λ DE3)感受態細胞(氯化鈣法)中。轉化產物涂布于含有終濃度為50 μ g/mL卡那霉素的LB固體培養基，37°C培養14h。二、GAD1407突變體的誘導表達通過易錯PCR方法構建的突變體，采用96微孔板進行表達。將LB固體培養基平板上的單菌落逐個挑到每孔含有600 μ L LB培養基(含50mg ^r1Kanamycin)的96孔板(種子板)中，于37°C、200r · mirT1培養過夜。培養好的菌液按每孔10%的接種量，接種到新的每孔含有900 μ L TB培養基(含50mg · L^1Kanamycin)的96孔板(表達板)中。同時，種子板中每個孔加入IOOyL 50%的甘油，-80°C保存。表達板于37°C，200r · mirT1搖床中進行培養，待每個孔中菌液的0D_達到O. 6左右時，每孔加入2μ L O. 5mg -T1的異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)進行誘導。誘導8h后，4°C下，4100r .mirT1離心IOmin,棄上清液，再用PBS緩沖液洗滌2次，相同條件離心收集菌體。三、突變文庫的篩選收集好的菌體放入_80°C冰箱過夜，然后每個孔加入150 μ L的裂解液(PBS緩沖液(pH 7. 4)、Iysozyme O. 5mg · ml,1、DNase 12 U · πιΤΓ1)，于 37°C反應約 30min, 4500r · mirT1離心lOmin，收集上清液用于測定其反應活性，最終篩選得到反應活性最高上清液所對應的菌株，命名為Q51H株。菌株篩選采用郁凱等在文獻(A high-throughput colorimetricassay tomeasure the activity of glutamate decarboxylase, Enzyme andMicrobialTechnology，2011，49 :272-276)中公開的高通量篩選方法。四、對篩選得到的突變體基因進行測序將步驟(三)獲得的Q51H菌株于37 °C，200 r ^mirT1培養過夜。收集菌體并按常規的堿裂解方法提取質粒。提取得到的質粒送往上海生工進行測序，獲得質粒中的突變基因Q51H的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，推導其編碼的酶的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。五、變體酶Q51H和野生型GAD的表達和純化分別將含有Q5IH突變基因和野生型gad基因的重組工程菌接種到20mL含有50 μ g/ · πιΓ1卡那霉素的LB液體培養基中，370C，180r · mirT1振蕩過夜培養；以I %的接種量接種到含有50 μ g -mr1卡那霉素的IOOmL TB液體培養基(胰蛋白胨12g 酵母提取物 24g · L-1、甘油 4ml · L'KH2PO4 17mmol · L'K2HPO4 72mmol · L-1)中，37。。，180 r · mirT1培養至 OD600 為 0. 6 0. 8 ;加入 IPTG (終濃度為 0. 5mmol · Γ1)，25°C，150r · mirT1 繼續誘導8h。誘導結束后，41下4000\8離心101^11，收集菌體沉淀。用pH 7. 4的磷酸緩沖液洗滌兩次，除盡培養基后再用原發酵液體積1/10的破胞緩沖液重懸細胞，在冰浴中超聲破胞90次(300W，工作3s，間隙6s)，12000 Xg離心IOmin收集上清，即得到含有GAD的粗酶液。采用Ni-NTA親和層析對所得的粗酶液進行分離純化。經上樣(loading)、清洗(washing)和洗脫(eluting)，收集洗脫液，透析除去小分子即得到純酶。適當稀釋后，以考馬斯亮藍法測定純酶的濃度。所用緩沖液配制如下裂解緩沖液(disruptionbuffer) 2mmol · I71 憐酸二氫鉀、IOmmol · L-1 憐酸氫二納、2. 7mmol · L 1KCK Immol · L 1 苯甲基橫酸氣(PMSF)、137mmol · L 1NaCl, pH 7· 4。
洗柱緩沖液(washbuffer) :20mmol · TT1Tri s~Hd .SOOmmol .L-1NaCUOmmol · L-1咪唑，pH 7. 8。洗脫緩沖液(elutionbuffer) :20mmol · L^1Tris-HcI>500mmoI · L^1NaCl>400mmo1 · L—1 咪唑，pH 7. 8。五、變體酶催化活力的測定取10 μ L 純酶，加入于 48°C預熱的 400 μ L 底物溶液(pH 4· 0、4· 4、4· 8、5· 2、5· 6、 6.0,0. Imol *L 1 朽1 樣酸-憐酸氧二納緩沖液，含 O. Olmmol *L 1PLP, 5OmmoI *L 1 底物 L-MSG),迅速混勻后在48°C反應IOmin,反應結束后迅速放入沸水中水浴IOmin以終止反應,離心，收集上清液，采用高效液相色譜法測定反應生成的GABA的量，以測定變體酶Q51H的比活力。在同樣條件下，以野生型GAD的反應作為對照。在采用HPLC法測定前需要對樣品進行柱前衍生化處理。衍生化方法為100 μ L反應液加100 μ L O. 5mol · Γ1碳酸氫鈉溶液，調節pH > 7. 5，混勻后加入200 μ L的丹磺酰氯丙酮溶液(4g/L，約15mmol噸―1)，于40°C下避光衍生Ih以上。衍生后的樣品經0. 22 μ m微孔濾膜過濾后進樣。HPLC 操作條件如下色譜分離柱為 Hypersil 0DS2 C18(250mmX4. 6mm) (Thermo公司)，紫外檢測波長為254nm，進樣量為10 μ L，控制柱溫25°C，流動相A為甲醇，流動相B為四氫呋喃甲醇醋酸鈉(0.05 mo I · ΛρΗ 6.2) (5 75 420，V/V/V)。梯度洗脫程序見表I。表I HPLC梯度洗脫程序
T/min |0 [δ [20 [21 [27 [28 [30 J%~20 20 50 Τ00 100 20 20 B%~80 80 50 0 0 80 80由圖5和圖6可見，在同樣的處理條件下，變體酶Q51H的比活力高于野生型GAD的比活力。其原因有可能是Q51H突變提高了酶的催化活力，也可能是該突變促進了酶的可溶表達。雖然具體原因有待通過測定野生酶和突變酶的催化反應動力學數據才能確定，但無論是何種原因，突變酶比活力的提高對于GAD在GABA大規模生物制備中的應用都是有利的。六、變體酶動力學參數測定測定在不同底物濃度(L-MSG, I IOOmmol *L_1)下的反應初速度。根據米氏方程，以1/[S]對1/[V]作圖，計算相應的KjPVmax值。然后根據Kcat = Vmax [E。]，[E0]為酶初始濃度，單位為μ mol/L,計算求得KMt。計算結果見表2。表2野生型GAD與突變酶Q51H的酶學參數
權利要求
1.一種谷氨酸脫羧酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。
2.一種編碼如權利要求I所述谷氨酸脫羧酶的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQID No. 2 所示。
3.一種含有如權利要求2所述基因的表達單元。
4.如權利要求3所述的表達單元,其特征在于，啟動子為T7啟動子、Iac啟動子或araBAD啟動子。
5.一種含有如權利要求2所述基因的重組載體。
6.如權利要求5所述的重組載體，其特征在于，原始載體為pET-28a(+)。
7.一種含有如權利要求2所述基因的轉化子。
8.如權利要求I所述谷氨酸脫羧在生產Y-氨基丁酸中的應用。
9.如權利要求I所述谷氨酸脫羧酶的制備方法，包括 (1)以gad基因為模板，進行易錯PCR擴增，將PCR產物轉入感受態細胞，得到突變體文庫； (2)利用誘導物誘導突變文庫表達，獲得表達文庫； (3)對表達文庫進行酶活分析和序列測定，篩選目的突變基因； (4)構建含有目的突變基因的重組工程菌，誘導培養后對獲得的粗酶液進行分離純化，得到谷氨酸脫羧酶。
所述gad基因來自短乳桿菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO. 1306,其核昔酸序列如SEQ ID No. 3 所示； 所述易錯PCR擴增所使用的引物為 上游引物5 ’ -GGGGATCCATGGCTATGTTATATGGTAAAC-3，； 下游引物5’ -GGGAATTCTTAGTGAGTGAATCCGTAITT-3’。
全文摘要
本發明公開了一種谷氨酸脫羧酶及其用途，該谷氨酸脫羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發明還公開了一種編碼該谷氨酸脫羧酶的基因及含有該基因的表達單元、重組載體和轉化子。本發明又公開該谷氨酸脫羧酶在生產γ-氨基丁酸中的應用。本發明谷氨酸脫羧酶的催化速率是野生型谷氨酸脫羧酶的2.5倍，能高效合成GABA，為利用谷氨酸脫羧酶進行γ-氨基丁酸的生物制備創造了更有利的條件。
文檔編號C12N15/10GK102911927SQ20121043191
公開日2013年2月6日 申請日期2012年11月2日 優先權日2012年11月2日
發明者梅樂和, 林玲, 胡升, 雷引林, 金志華, 姚善涇 申請人:浙江大學寧波理工學院