專利名稱：在釀酒酵母中生成重組基因的制作方法
技術領域：
本發明主要涉及用于在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中生成和檢測重組DNA序列的方法，以及用于實施本發明的質粒和釀酒酵母細胞。
這些方法所涉及的DNA序列包括蛋白質編碼序列和非編碼序列；它們也可以由包含一種以上編碼序列及介于其中的非編碼序列的較長連續區段組成，諸如屬于生物合成途徑的區段。
背景技術：
通過微生物和酶促反應生產物質，諸如酶和其它蛋白質，是重要的經濟話題。酶是具有生物催化活性的蛋白質，不僅負責天然化合物和有機體的新陳代謝，還用于天然和非天然化合物的工業生產。酶或借助酶生產的這些化合物可用于生產藥品、化妝品、食品等。然而，酶的靶特異性及其發揮功能時的特定條件大大阻礙了酶的工業應用。其它蛋白質在人和動物保健領域具有治療用途。醫學上重要的蛋白質的重要類別包括細胞因子和生長因子。
具有新的或改良的功能和特性的蛋白質、酶和途徑可以通過兩種方式獲得或是在大多未知的天然物種中尋找，或是改造目前已知的天然蛋白質或酶。后一種方式可能更加適合于產生不太可能選擇天然進化過程的特性。
定向分子進化是一種有希望的策略，用于產生這些新的所需性質，以及重新設計酶、其它蛋白質、非編碼序列或途徑。傳統上，DNA序列的定向進化已通過下述技術實現，諸如定點誘變、多點或盒式誘變、隨機誘變、及易錯PCR。最近，通過基因改組技術來優化和微調酶或蛋白質的特性受到了廣泛關注。這些定向進化技術可產生這樣的酶，即能夠改善現有工藝、生產新產品、和擴展化學合成的能力。
存在許多不同的誘變方法，諸如隨機誘變、定點誘變、寡核苷酸盒式誘變、或通過易錯PCR進行的點誘變。例如，隨機誘變是通過用諸如亞硝酸、肼等化學制品進行處理，在克隆的DNA片段中生成大量的隨機分布的核苷酸替代突變。易錯PCR已經用于在克隆基因中引入隨機點突變。降低PCR反應保真度的修改包括提高MgCl2濃度、添加MnCl2、或改變四種dNTP的相對濃度。
這些傳統誘變方法集中于對具有離散的和可選擇的基因型的單個基因進行優化。總體策略是克隆一種基因，鑒定基因的離散功能，建立可對其進行監測的測定法，突變基因中的選定位點，并選擇改善基因已知功能的基因突變體。然后可在所需細胞類型中表達具有改良功能的突變體。誘變方法可進行重復循環，以獲得所需的酶特性。
這些傳統方法都隱含序列搜索策略。上述序列搜索技術中所采用的策略有很大不同。在進行飽和定向突誘變時，包括在目的位點處安置每一種可能的排列的過程。對于蛋白質，這種程序由將目的位點處的氨基酸用所有19種其它氨基酸替代，并對由此得到的文庫搜索改良的突變體組成。就序列空間而言，這意味著對一個很小的區域進行了非常徹底的搜索。比較而言，盒式誘變是將隨機肽序列插入蛋白質的特定區域，即對較大的確定的序列空間區域進行較不徹底的采樣。易錯PCR涉及重復拷貝序列，并引入較低但顯著數量的錯誤。在這種情況中，是對較不確定的序列空間區域進行稀疏的采樣。在以上每種策略中，將每一輪選擇得到的最佳突變體用于起動下一輪。
然而，通過傳統誘變方法來發展酶的新特性存在許多限制。首先，它們只適用于已經克隆且功能已經鑒定的基因或序列。其次，這些方法通常只適用于具有離散功能的基因。因此，協同賦予單一表型的多基因通常不能用這種方法來優化。最后，這些方法即便對于單個基因，也僅能探索排列總數中非常有限的數目。由于這些限制，傳統誘變方法不適于著眼多種有用屬性來改進細胞基因組。例如，改進細胞表達蛋白的能力可能需要改變轉錄效率、翻譯和翻譯后修飾、基因產物的分泌或蛋白水解降解。因此可能需要對在一種或多種上述細胞機制中發揮作用的其它基因進行修飾，以便表達具有新特性的蛋白質。試圖對具有這些功能的所有基因進行單獨優化幾乎是不可能的任務。
與傳統誘變方法有關的多數問題可以通過基因改組方法來克服。基因改組能夠隨機重組功能基因的不同序列，使天然相似基因或隨機突變基因的分子混合。DNA或基因改組或者這些技術的變體，已經用于改進酶的活性、穩定性、折疊、及底物識別特性。與傳統誘變方法相比，通過基因改組獲得具有改良表型的突變體的機率顯著更高。基因改組與傳統方法有根本的不同，即基因改組以組合方式重組有利突變。因此它能以更加稀疏的方式搜索更加廣闊的序列空間區域，而且更傾向于生成功能序列。由于它容許序列信息來自一種以上的來源，因此它能夠使更多的每輪選擇得到的有益突變在下一輪中得到保留。盡管傳統方法還容許固定負面突變，然而基因改組方法并非如此。因此，基因改組策略得到更加引人注目的結果也就不令人驚訝了。
DNA或基因改組方法是基于具有一定同源性的區域之間或具有同一性的區段之間的重組事件。芽殖酵母釀酒酵母是用于檢驗真核生物中的遺傳重組的實驗中所采用的重要生物。在簡單的單細胞生物中研究這些過程有一個明顯的優點，就是容易操作DNA序列，而且有可能研究在大比例的細胞中同步誘導的特定重組事件。此外，近幾十年來，在這種生物的發酵技術和基礎遺傳學中已經積累了大量的專業知識，它是目前在分子水平研究得最透徹的真核生物。由于它沒有致病性，擅長分泌，且具有糖基化潛力，所以釀酒酵母是基因克隆和基因表達的優選宿主生物體。因此，本發明的潛在技術問題就是提供用于在釀酒酵母中生成重組鑲嵌基因的方法和手段。
發明描述本發明解決了這一潛在技術問題，即提供了用于在釀酒酵母中生成和檢測重組DNA序列的方法，包括以下步驟a)生成第一二倍體釀酒酵母細胞，其基因組在特定基因座中攜帶包含第一待重組DNA序列的第一重組盒，該序列側翼為至少第一和第二標記序列，并且在等位基因處攜帶包含第二待重組DNA序列的第二重組盒，該序列側翼為至少第三和第四標記序列，b)誘導a)中得到的第一二倍體細胞生成孢子，并c)分離含有其中第一重組DNA序列側翼為至少第一和第四標記序列的重組盒的單倍體細胞，及含有其中第二重組DNA序列側翼為至少第二和第三標記序列的重組盒的單倍體細胞。
本發明提供了基于酵母系統來選擇至少兩種不同DNA序列之間的重組事件。該系統是基于釀酒酵母在單倍體期與雙倍體期之間交替的有性生殖周期。在本發明方法的第一個步驟中，生成這些重組底物雜合子的二倍體釀酒酵母細胞。將待重組DNA序列整合到二倍體酵母細胞基因組的等位基因處。每種待重組DNA序列以重組盒的形式進行整合，重組盒中除了該DNA序列還包含至少兩種位于DNA序列側翼的標記序列，由此兩種重組盒包含至少四種不同的標記序列。
然后使如此得到的雜合子二倍體細胞在誘導減數分裂和孢子形成的條件下生長。減數分裂的一般特點是遺傳重組的頻率升高，這是由早在減數分裂I前期誘導的雙鏈斷裂(DSB)的形成和后續修復起動的。因此酵母減數分裂細胞受到特別的關注，因為它們由于基因組范圍的DSB誘導進行高水平的重組。由此，第一輪減數分裂的產物，作為親本二倍體細胞每次減數分裂產生的四個單倍體細胞或孢子，可含有兩種不同DNA序列之間重組產生的重組DNA序列。
減數分裂過程中兩個不同DNA序列之間的重組還能導致側翼標記序列的交換。因此，通過選擇重組底物側翼的標記序列發生了交換的個別細胞或分子，本方法能夠快速且簡單的鑒定重組DNA序列。因此，第一輪減數分裂后得到的重組體的特征是它們含有和/或表達第一重組盒的至少一種標記序列和第二重組盒的至少一種標記序列。具體而言，重組孢子可以含有第一重組盒的第一標記序列和第二重組盒的第四標記序列，或者含有第一重組盒的第二標記序列和第二重組盒的第三標記序列，由此這兩種類型的重組孢子不僅含有不同的標記組合，還含有不同的重組DNA序列。在容許選擇通過減數分裂過程中的重組而產生的新重組標記配置的條件下，可容易的選擇和辨別含有重組序列的這兩類重組孢子。
本發明的方法可用于野生型或錯配修復缺陷型釀酒酵母細胞。修復受損DNA的過程與遺傳重組的機制是密切相關的，并且知道錯配修復機制對不同序列之間(即部分同源重組)的重組頻率具有抑制作用。因此錯配修復系統的突變大大提高酵母中的總體重組頻率。另一方面，已知野生型釀酒酵母細胞具有錯配修復依賴性重組機制，它是基于兩個重組底物中相隔較遠的錯配。根據將要重組的DNA序列，可使用野生型或錯配修復缺陷型釀酒酵母細胞來獲得重組序列。
本發明方法的優點是可以反復進行，即它允許進行多輪重組。第一輪減數分裂的產物，即包含不同重組DNA序列的相反交配型的單倍體細胞，可再次交配以獲得重組DNA序列雜合的二倍體細胞。在如此獲得的二倍體細胞中再次誘導減數分裂，由此重組DNA序列再次重組，導致每個重組底物側翼的兩種標記序列再次交換。通過最初的第一重組盒中第一DNA序列側翼的標記基因或是最初的第二重組盒中第二DNA序列側翼的標記基因的聯合表達，可容易的鑒定第二次減數分裂后獲得的新的單倍體重組體。
因此，在本發明的一個優選實施方案中，將在本發明方法第一輪中得到的含有具有第一重組DNA序列的重組盒的單倍體細胞與在本發明方法第一輪中得到的含有具有第二重組DNA序列的重組盒的單倍體細胞進行交配，得到第二二倍體細胞。誘導如此得到的第二二倍體細胞生成孢子，導致單倍體細胞的產生。隨后，分離含有其中第三重組DNA序列側翼為至少第一和第二標記序列的重組盒的單倍體細胞，以及含有其中第四重組DNA序列側翼為至少第三和第四標記序列的重組盒的單倍體細胞。
通過使上述含有第三和第四重組DNA序列的單倍體細胞進一步進行一輪或多輪交配和減數分裂/生成孢子的循環，可以獲得其它重組DNA序列。每輪重組后，通過第一重組底物側翼的至少一種標記序列和第二重組底物側翼的至少一種標記序列的聯合表達，或者通過起始重組底物中第一或第二DNA序列側翼的兩種標記的聯合表達來鑒定重組體。
因此，本發明方法的一個優點是可以重復將可以個別的或一同的選擇重組單倍體后代并相互交配，將如此得到的二倍體再次生成孢子，并將其后代孢子施加合適選擇條件以鑒定新的重組事件。通過本發明的方法，可容易的生成大型重組突變序列庫，然后可采用合適的選擇或篩選系統來鑒定具有所需功能的變體。
在本發明的一個優選實施方案中，用含第一重組盒的DNA分子和含第二重組盒的DNA分子同時或依次轉化二倍體釀酒酵母細胞，并任選使兩個重組盒整合到釀酒酵母基因組天然染色體上的等位基因處，由此得到第一二倍體釀酒酵母細胞。所用的DNA分子也可以是例如酵母人工染色體(YAC)。YAC的特征為，它們是包含在酵母細胞中穩定維持所必需的所有序列的線性DNA分子，諸如著絲粒、DNA復制起點、端粒以及酵母選擇標記。在導入酵母細胞后，YAC的表現與天然染色體相似，因此可視作酵母基因組的一部分。在本發明的內容中，術語“基因組”包括細胞內存在的穩定維持和遺傳的所有遺傳成分的整體。在將YAC作為DNA分子用于將第一和第二重組盒導入二倍體釀酒酵母細胞時，并非必需將兩個重組盒整合到天然染色體的等位基因中。在將重組盒導入天然染色體的情況中，有可能使用克隆載體，例如質粒，可由此釋放攜帶重組盒的片段。優選的是，兩個重組盒的兩個各自標記序列側翼為與釀酒酵母基因組特定基因座同源的靶向序列。或者，可以使用不含復制起點的DNA分子。在這種情況中，DNA分子必須能夠整合到基因組成分中，并因此含有與釀酒酵母基因組特定基因座同源的靶向序列。
在本發明的另一個優選實施方案中，通過將其基因組在某基因座中攜帶第一重組盒的單倍體細胞與其基因組在等位基因處攜帶第二重組盒的釀酒酵母單倍體細胞融合，由此產生第一二倍體釀酒酵母細胞。
在本發明的另一個優選實施方案中，通過將其基因組在某基因座中攜帶第一重組盒的單倍體細胞與其基因組在等位基因處攜帶第二重組盒的相反交配型釀酒酵母單倍體細胞交配，由此產生第一二倍體釀酒酵母細胞。
在本發明的內容中，術語“交配”和“融合”指含有不同重組盒的兩種單倍體細胞的有目的的或隨機的組合。當選擇和/或分離得到的、具有所需特性的兩種反向交配型單倍體細胞在刺激交配或融合的條件下接觸時，兩種單倍體細胞分別發生有目的的交配或融合。這兩種單倍體細胞可以衍生自相同細胞庫，該細胞庫例如含有待重組DNA序列或已重組DNA序列，或者衍生自不同細胞庫，該細胞庫例如含有待重組DNA序列或已重組DNA序列。
當多種不同的單倍體細胞在刺激交配和融合的條件下接觸時，兩種單倍體細胞分別可發生隨機交配或融合。所述多種單倍體細胞可以衍生自相同細胞庫，該細胞庫例如含有待重組DNA序列或已重組DNA序列，或者衍生自不同細胞庫，該細胞庫例如含有待重組DNA序列或已重組DNA序列。
本發明用于生成和檢測重組DNA序列的方法的優點是，可以重組多于兩種不同序列。例如，如果要重組四種不同DNA序列，那么在本發明方法的第一步中可生成兩組不同的二倍體釀酒酵母細胞。例如，可通過使含有第一和第二待重組DNA序列的單倍體細胞交配或融合，產生第一組二倍體細胞，且可通過使含有第三和第四待重組DNA序列的單倍體細胞交配或融合，產生第二組二倍體細胞。使兩組二倍體細胞生成孢子后，使由第一組二倍體細胞獲得的、含有因第一和第二DNA序列重組而形成的重組DNA序列的單倍體細胞與由第二組二倍體細胞獲得的、含有因第三和第四DNA序列重組而形成的重組DNA序列的單倍體細胞交配。這次交配的產物是在生成孢子后產生攜帶重組DNA序列的單倍體細胞的二倍體細胞，該重組DNA序列包含第一DNA序列、第二DNA序列、第三DNA序列和第四DNA序列的區域。例如，如果要重組三種不同的DNA序列，那么在本發明方法的第一步中，通過例如使含有第一和第二待重組DNA序列的單倍體細胞進行交配或融合，由此生成二倍體釀酒酵母細胞。使這些二倍體細胞生成孢子后，可使如此獲得的、含有因第一和第二DNA序列之間的重組而形成的重組DNA序列的單倍體細胞與含有第三待重組DNA序列的單倍體細胞融合或交配。這次交配的產物是在生成孢子后產生攜帶重組DNA序列的單倍體細胞的二倍體細胞，該重組DNA序列包含第一DNA序列、第二DNA序列和第三DNA序列的區域。這樣，也可重組五種、六種或更多不同DNA序列。
在一個優選的實施方案中，攜帶第一或第二重組盒的單倍體釀酒酵母細胞是如下產生的a)將第一待重組DNA序列插入第一克隆載體上相鄰的第一與第二標記序列之間，并將第二待重組DNA序列插入第二克隆載體上相鄰的第三與第四標記序列之間，由此兩種標記序列各自側翼為與釀酒酵母基因組特定基因座同源的靶向序列，b)由a)中得到的克隆載體中分別切下具有側翼靶向序列的第一重組盒和第二重組盒的片段，由此每個切下的片段待重組DNA，其側翼為各自兩種標記序列，繼而側翼為靶向序列，c)將b)中得到的切下片段分別轉化到釀酒酵母二倍體細胞中，由此靶向序列引導重組盒整合到與其同源的基因座中，以獲得第一盒或第二盒的雜合二倍體細胞，d)分別誘導c)中得到的雜合二倍體細胞生成孢子，并e)分別分離含側翼為第一和第二標記序列的第一盒的單倍體細胞及含側翼為第三和第四標記序列的第二盒的單倍體細胞。
在本發明的一個優選實施方案中，第一或第二克隆載體中各自兩種標記序列側翼為與釀酒酵母基因組染色體III上的BUD31-HCM1基因座同源并引導切下的盒整合到該基因座中的靶向序列。
在本發明的一個優選實施方案中，用于克隆重組盒的克隆載體是質粒。“質粒”指能夠自主復制的染色體外元件。質粒在物理上與含有它的細胞的基因組不相連。多數質粒是環狀雙鏈DNA分子。在另一個實施方案中，克隆載體是YAC。
具體而言，優選使用質粒pMXY9作為克隆第一重組盒的第一克隆載體。質粒pMXY9含有URA3標記基因和CAN1標記基因。在該質粒中，兩種標記基因相鄰。在兩種標記基因之間排列著一些限制性位點，具體是限制酶SmaI、XbaI、BglII和PacI的識別位點，用于插入待重組DNA序列。兩種標記序列側翼為與釀酒酵母基因組染色體III上的BUD31-HCM1基因座同源的靶向序列。
此外，優選使用質粒pMXY12作為克隆第二重組盒的第二克隆載體。質粒pMXY12含有TRP1標記基因和CYH2標記基因。在該質粒中，兩種標記基因相鄰。在兩種基因之間排列著一些限制性位點，具體是限制酶SpeI、SmaI和PacI的識別位點，用于插入待重組DNA序列。兩種標記序列側翼為與釀酒酵母基因組染色體III上的BUD31-HCM1基因座同源的靶向序列。
在本發明的一個優選實施方案中，用于轉化切下的重組盒的二倍體細胞對至少兩種營養素是營養缺陷的，且對至少兩種抗生素是有抗性的。優選的是，二倍體細胞是ura3-1等位基因和trp1-1等位基因的純合子，它們分別使細胞對尿嘧啶和色氨酸是營養缺陷的。此外，優選的是，用于轉化的二倍體細胞是can1-100等位基因和cyh2R等位基因的純合子，它們分別使細胞對刀豆氨酸和環己酰亞胺是有抗性的。
具體而言，優選的是，將釀酒酵母菌株MXY47的二倍體細胞用于轉化，該菌株是等位基因ura3-1、trp1-1、can1-100和cyh2R的純合子，且是msh2::KanMX突變的雜合子。在將菌株MXY47的二倍體細胞用于攜帶重組盒及其側翼靶向序列的第一或第二切下片段的轉化時，則可使得到的轉化體生成孢子，以生成攜帶各自重組盒的單倍體野生型或msh2分離體。
按照本發明，可能優選使用具有功能性錯配修復系統的釀酒酵母細胞來實行本發明的方法。錯配修復系統屬于避免復制時由于DNA聚合錯誤而引起的突變的最大貢獻者。通過編輯遺傳重組的保真度，錯配修復還提高遺傳穩定性。因此知道錯配修復機制對不同序列之間的重組有一定抑制作用。然而，在正常的釀酒酵母二倍體中，檢測到錯配修復的另一個方面，稱為錯配修復依賴性重組(Borts和Haber，Science 2371459-1465，1987)。認為對較大距離的錯配，諸如在不同序列中的，進行錯配修復，產生新的雙鏈斷裂，繼而可刺激第二輪(錯配修復依賴性)重組。在某些情況中，具體是已知所使用的兩種重組底物具有間隔較大的堿基差異時，因此采用具有功能性錯配修復系統的釀酒酵母細胞進行本發明方法會很有用。
在本發明的另一個優選實施方案中，使用錯配修復系統缺陷的釀酒酵母細胞。已經在釀酒酵母中鑒定出多個基因，其產物與細菌錯配修復蛋白質享有同源性，包括MutS蛋白質的6種同系物，即Msh1、Msh2p、Msh3p、Msh4、Msh5和Msh6p，及MutL蛋白質的4種同系物，即Mlh1p、Mlh2p、Mlh3p和Pms1。特別是已知PMS1和MSH2基因對不同序列之間的重組設置了障礙。因此，在msh2和pms1突變體中，相對于野生型細胞中的重組頻率，不同序列之間的減數分裂重組增加。
在本發明的內容中，術語“錯配修復系統缺陷”是指細胞的錯配修復系統(MMR)暫時的或永久的受損。任何能暫時或永久性損傷錯配修復的策略均可實現細胞或生物體的MMR缺陷，包括但不限于參與錯配修復的一種或多種基因的突變，用像紫外線般導致MMR全面受損的試劑處理，用像2-氨基嘌呤般的試劑或含有過量錯配的異質雙鏈處理以暫時飽和和滅活MMR系統，以及通過例如可調控啟動子使其在減數分裂過程中而不是在營養生長過程中暫時失活來誘導參與錯配修復的一種或多種基因的表達或遏制。
在本發明的一個優選實施方案中，釀酒酵母細胞的錯配修復缺陷是由于參與MMR的至少一種基因的突變。在一個優選的實施方案中，釀酒酵母細胞的MSH2基因有缺陷。優選的是，二倍體細胞是msh2等位基因的純合子，其中MSH2編碼序列以KanMX構建物替換。
在本發明的內容中，術語“重組盒”指包含至少一種重組底物或一種待重組DNA序列且其側翼為至少兩種不同標記序列的DNA序列。第一和第二重組盒在待重組DNA序列及側翼標記序列方面有不同，使得任何一對重組盒包含兩種不同的待重組DNA序列和至少四種不同的側翼標記序列。
在本發明的一個優選實施方案中，通過將各自的待重組DNA序列插入克隆載體上相鄰的兩種標記序列之間，繼而由與釀酒酵母細胞基因組特定基因座同源的靶向序列圍繞，由此產生第一和第二兩種重組盒。靶向序列因此能夠引導包含重組盒的切下片段整合到該特定基因座中。優選通過遺傳工程方法將待重組DNA插入兩種標記序列之間。在本發明的一個優選實施方案中，克隆載體中的兩種標記序列側翼為與釀酒酵母基因組染色體III上的BUD31-HCM1基因座同源的靶向序列。因此，靶向序列能夠引導包含重組盒的切下片段整合到該基因座中。
在本發明的內容中，術語“待重組DNA序列”和“重組底物”指能夠通過減數分裂重組過程而重組的任意兩種DNA序列，由此這些序列之間的重組可歸于同源或非同源重組。
幾種類型的同源重組事件的特點是受損DNA鏈與同源配偶體之間的堿基配對，其中相互作用的范圍可涉及數以百計幾乎完全匹配的堿基對。術語“同源性”是指兩種核酸分子序列之間存在的同一性程度。相反，不合理或非同源重組的特點是沒有或僅有少數互補堿基對的DNA末端的結合。在酵母中，非同源修復和重組事件的發生頻率要顯著低于同源重組事件。
第一和第二待重組DNA是不同的序列，即兩種序列不相同，但顯示某種程度的同源性。這意味著待重組DNA序列至少有一個核苷酸不同。優選的是，待重組DNA序列是共享至少一個或多個同源區的序列，同源區可以很短。同源區應包含至少5-10個核苷酸，優選大于20-30個核苷酸，更優選大于30-40個核苷酸，且最優選大于50個核苷酸。在本發明的一個優選實施方案中，第一和第二待重組DNA序列至少有一個核苷酸不同，具體是大于0.1％，優選大于5％至大于50％。這意味著第一和第二待重組DNA序列可以有55％、60％、65％或甚至更多不同。
重組底物或待重組DNA序列可以具有天然的或合成的來源。因此待重組DNA序列可以衍生自任何天然來源，包括病毒、細菌、真菌包括釀酒酵母、動物、植物和人。在本發明的一個優選實施方案中，第一和第二待重組DNA序列衍生自釀酒酵母以外的生物體。
在本發明的一個優選實施方案中，待重組DNA序列是蛋白質編碼序列，例如編碼可用于工業生產天然和非天然化合物的酶的序列。酶或借助酶生產的那些化合物可用于生產藥品、化妝品、食品等。蛋白質編碼序列也可以是編碼在人和動物保健領域具有治療用途的蛋白質的序列。醫學上重要的蛋白質的重要類別包括細胞因子和生長因子。蛋白質編碼序列的重組可以生成新的突變序列，它編碼的蛋白具有改變的、優選改進的功能和/或新獲得的功能。這樣有可能例如改善蛋白質的熱穩定性，改變蛋白質的底物特異性，改善其活性，生成新的催化位點和/或融合來自兩種不同酶的結構域。待重組蛋白編碼DNA序列可以包括來自不同物種的序列，它們編碼在其天然環境中具有相似或相同功能的相同或相似蛋白質。待重組蛋白編碼DNA序列可以包括來自相同蛋白質或酶家族的序列。待重組的蛋白編碼序列還可以包括編碼具有不同功能的蛋白質的序列，例如編碼催化指定代謝途徑的不同步驟的酶的序列。在本發明的一個優選實施方案中，第一和第二待重組DNA序列選自β-內酰胺酶的Oxa超家族的基因序列。
在本發明的另一個優選實施方案中，待重組DNA序列是非編碼序列，諸如例如在其天然細胞環境內參與調節蛋白質編碼序列表達的序列。非編碼序列的實例包括但不限于啟動子序列、含核糖體結合位點的序列、內含子序列、聚腺苷酸化序列等。通過重組這些非編碼序列，有可能生成突變序列，它在細胞環境中導致對某一細胞過程的調節改變，例如某一基因的表達改變。
根據本發明，重組底物或待重組DNA序列當然可以包含一種以上蛋白質編碼序列和/或一種以上非編碼序列。例如，重組底物可以包含一種蛋白質編碼序列和一種非編碼序列，或者不同蛋白質編碼序列和不同非編碼序列的組合。在本發明的另一個實施方案中，待重組DNA序列因此可由一種或多種編碼序列區段及介于其中和/或側翼的非編碼序列組成。這意味著待重組DNA序列可以是例如在其5’端和/或非翻譯3’區具有調節序列的基因序列，或者是具有外顯子/內含子結構的哺乳動物基因序列。在本發明的另一個實施方案中，待重組DNA序列可由含有一種以上編碼序列及介于其中的非編碼序列的較長連續區段組成，諸如屬于生物合成途徑或操縱子的那些區段。待重組DNA序列可以是已經經歷過一次或多次重組事件，例如同源和/或非同源重組事件，的序列。
重組底物可以包含未突變野生型DNA序列和/或已突變DNA序列。在本發明的一個優選施方案中，有可能將野生型序列與已有的已突變序列進行重組，以生成新的突變序列。
在本發明的內容中，術語“標記序列”是指釀酒酵母細胞中位于重組底物或已重組DNA序列的上游或下游的獨特DNA序列。標記序列在與重組底物或已重組DNA序列相同的DNA分子上的存在，優選連同重組底物另一側上的另一種標記序列，使得可以通過分子或遺傳方法識別和選擇重組底物或已重組DNA序列。因此，在本發明的一個優選實施方案中，每種重組底物的上游必須有一種或多種標記序列，并且每種重組底物的下游也必須有一種或多種標記序列，使得在兩種不同重組底物的雜合子細胞中，總共至少有四種不同的標記序列。這種排列能夠選擇出涉及重組底物的交換體。還可以以重復方式進行多輪重組。在本發明的另一個優選實施方案中，重組底物的每一側上可以存在一種以上的標記。例如可以引入額外標記以提高選擇的嚴謹性。
標記序列可以包含蛋白質編碼或非編碼DNA序列。在本發明的一個優選實施方案中，蛋白編碼標記序列選自營養標記、色素標記、抗生素抗性標記、抗生素敏感性標記、和編碼酶不同亞基的序列，所述酶只有在兩種或多種亞基在同一細胞中表達時才發揮功能。在本發明的另一個優選實施方案中，分子非編碼標記序列包括但不限于引物識別位點即PCR引物與之退火并能夠擴增重組體的序列、內含子/外顯子邊界、啟動子序列、下游受調節基因序列或限制酶位點。
“營養標記”是指所編碼基因產物能夠補償生物體或細胞的營養缺陷，從而可賦予該營養缺陷型生物體或細胞以原養型的標記序列。在本發明的內容中，術語“營養缺陷型”是指生物體或細胞必須在含有營養缺陷型生物體自身不能合成的必需營養素的培養基中培養。營養標記基因的基因產物促進營養缺陷型細胞合成這種缺乏的必需營養素。因此，營養標記基因一表達就不必向培養生物體或細胞的培養基中添加這種必需營養素，因為生物體或細胞已經獲得了原養型。
“色素標記”是指其基因產物參與色素合成的標記基因，它一旦表達將使表達色素標記的細胞染色。沒有色素標記的細胞不合成色素，因此也不會被染色。色素標記因此能夠對含有色素標記的細胞進行快速的表型檢測。
“抗生素抗性標記”是指一旦表達其基因產物就賦予表達抗生素標記基因的細胞以在指定濃度的指定抗生素存在時生長的能力的標記基因，而沒有抗生素抗性標記的細胞則不能生長。
“抗生素敏感性標記”是指一旦表達其基因產物就破壞細胞在指定濃度的指定抗生素存在時生長的能力的標記基因。
在本發明的一個優選實施方案中，第一和第三標記序列的每一種基因產物能夠補償釀酒酵母細胞的營養缺陷。優選的是，第一標記序列為URA3，其基因產物能夠賦予尿嘧啶缺陷型釀酒酵母細胞以尿嘧啶原養型。優選的是，第三標記序列為TRP1，其基因產物能夠賦予色氨酸缺陷型釀酒酵母細胞以色氨酸原養型。
在本發明的另一個優選實施方案中，第二和第四標記序列的基因產物賦予對某抗生素有抗性的釀酒酵母細胞以對該抗生素的敏感性。優選的是，第二標記序列是CAN1，其基因產物能夠賦予刀豆氨酸抗性釀酒酵母細胞以刀豆氨酸敏感性。優選的是，第四標記序列是CYH2，其基因產物能夠賦予環己酰亞胺抗性釀酒酵母細胞以環己酰亞胺敏感性。
在本發明的另一個優選實施方案中，標記序列包含PCR引物的退火位點。優選的是，第一、第二、第三和第四標記序列受到引物KNS11、KNS28、KNS16和KNS29的識別。
在本發明方法的一個優選實施方案中，可通過PCR方法檢測各自標記組合的存在，從而鑒定包含具有第一、第二、第三或第四重組DNA序列的重組盒的單倍體細胞。
在本發明方法的另一個優選實施方案中，包含具有第一、第二、第三或第四重組DNA序列的重組盒的單倍體細胞是如下鑒定的將單倍體細胞涂布在選擇存在各自標記組合的相同DNA分子的培養基上。這意味著將含有第一重組DNA序列的單倍體細胞涂布在選擇存在第一和第四標記序列的培養基上。將包含第二重組DNA序列的單倍體細胞涂布在選擇存在第二和第三標記序列的培養基上。將包含第三重組DNA序列的單倍體細胞涂布在選擇存在第一和第二標記序列的培養基上。將包含第四重組DNA序列的單倍體細胞涂布在選擇存在第三和第四標記序列的培養基上。
本發明的另一個方面涉及生成具有新的或改進的功能和特性的新蛋白質、酶、途徑和非編碼序列的方法，由此通過使用本發明的用于在釀酒酵母中生成和檢測重組DNA序列的方法，對已知的蛋白質編碼序列或已知的非編碼序列進行一輪或多輪重組。
本發明的另一個方面涉及質粒pMXY9。質粒pMXY9包含相鄰的URA3標記基因和CAN1標記基因。在兩種標記基因之間排列的是多接頭序列，包含用于插入待重組DNA序列的多個限制性位點。兩種標記側翼為與釀酒酵母基因組染色體III上的BUD31-HCM1基因座同源的靶向序列。兩種標記基因之間的多接頭序列包含限制酶SmaI、XbaI、BglII和PacI的限制性位點。
本發明的另一個方面涉及質粒pMXY12。質粒PMXY12包含TRP1標記基因和CYH2標記基因。在兩種標記基因之間排列的是多接頭序列，包含用于插入待重組DNA序列的多個限制性位點。兩種標記側翼為與釀酒酵母基因組染色體III上的BUD31-HCM1基因座同源的靶向序列。多接頭序列包含限制酶SpeI、SmaI和PacI的限制性位點。
本發明還涉及釀酒酵母菌株MXY47，其特征是其二倍體細胞是等位基因ura3-1、trp1-1、can1-100和cyh2R的純合子且是msh2::KanMX特別的雜合子。
本發明還涉及含有質粒pMXY9的大腸桿菌菌株JM101及含有質粒pMXY12的大腸桿菌菌株DH5α。
質粒pMXY9和pMXY12及釀酒酵母菌株MXY47于2005年1月3日保藏于DSMZ(Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH，Mascheroderweg 1b，38124 Braunschweig，Germany)，保藏號分別是DSM 17010、DSM 17011和DSM 17026。
本發明的另一個方面涉及可用于執行本發明方法即用于在釀酒酵母中生成和檢測重組DNA序列的試劑盒。在第一個實施方案中，試劑盒至少包含裝有釀酒酵母菌株MXY47的細胞的第一容器，裝有攜帶質粒pMXY9的大腸桿菌菌株JM101K的細胞的第二容器，和裝有攜帶質粒pMXY12的大腸桿菌菌株DH5α的細胞的第三容器。
在第二個實施方案中，試劑盒至少包含裝有釀酒酵母菌株MXY47的細胞的第一容器，裝有質粒pMXY9的DNA的第二容器，和裝有質粒pMXY12的DNA的第三容器。
本發明通過以下序列表、附圖和實施例進行說明。
附圖簡述

圖1顯示了在確定成分培養基上選擇重組體的選擇系統示意圖。重組盒雜合的二倍體親本細胞經誘導發生減數分裂，這里重組盒是側翼為URA3和CAN1基因的重組底物A，以及側翼為TRP1和CYH2基因的重組底物B。將孢子涂布到缺乏尿嘧啶但含有刀豆氨酸的培養基(-Ura+Can)和缺乏色氨酸但含有環己酰亞胺的培養基(-Trp+Cyh)上，以選擇重組細胞3和4，其中發生了涉及重組底物A和B的交換，用(+)表示。親本二倍體和未重組的單倍體1和2不能在這兩種培養基上生長，用(-)表示。下一輪減數分裂可使用重組體3和4，以構建新的二倍體，它在形成孢子后產生新的重組細胞，它們攜帶與細胞1和2中所示相同的側翼標記配置。可在缺乏尿嘧啶但含有環己酰亞胺的培養基(-Ura+Cyh)和缺乏色氨酸但含有刀豆氨酸的培養基(-Trp+Can)上分別選擇具有這些配置的重組孢子克隆。
圖2顯示了質粒pMXY9和pMXY12(上部)，它們是用于將重組盒靶向酵母基因組染色體III上的BUD31-HCM1基因座的載體。這兩種質粒均攜帶與此基因座同源的序列(用5′和3′表示)，位于URA3和CAN1標記(pMXY9)或者TRP1和CYH2標記(pMXY12)的側翼。每對標記序列之間存在含有限制性位點的一段短序列，用于克隆重組底物。下部顯示了重組盒進入BUD31-HCM1基因座的整合。用NotI消化攜帶重組底物A的pMXY9衍生物，以釋放側翼為5′和3′靶向序列的重組盒，并將消化產物轉化到MXY47細胞中。鑒定含有正確靶向插入物的Ura+衍生物，隨后用于構建重組盒雜合子菌株。類似的在pMXY12中構建攜帶TRP7和CYH2標記的重組盒并轉化到MXY47細胞中，隨后選擇色氨酸原養型。
圖3顯示了野生型和msh2菌株中Oxa基因之間的重組頻率作為序列同一性的函數。上部是獨立實驗的平均值±標準偏差。下部是這些數據的圖解。采用以下菌株MXY60、MXY62、MXY64、MXY66、MXY99、和MXY102。
圖4顯示了msh2的超重組效果。對每個獨立試驗(總數＝n)對具有給定共享Oxa基因同源性百分比的菌株對，以及對每次選擇條件，計算msh2/wt比率，并顯示了這些總計值的平均值±標準偏差。下部是這些數據的圖示。采用以下菌株對MXY60和MXY62、MXY64和MXY66、MXY99和MXY102。
圖5顯示了享有78％同源性的Oxa序列之間重組的PCR分析。孢子克隆衍生自野生型(MXY99)和msh2(MXY102)二倍體，它們是在缺乏尿嘧啶但含有刀豆氨酸的培養基或者缺乏色氨酸但含有環己酰亞胺的培養基上選擇得到的。對表現出符合預期交換重組體表型的選定孢子克隆進行菌落PCR。上部，對每種野生型和msh2 Ura+CanR候選物進行兩個反應，一個使用親本特異性引物對(KNS16+KNS28，產物顯示在每種候選物的每對泳道中的第一泳道)，另一個使用重組體特異性引物對(KNS16+KNS29，第二泳道)。下部，對每種野生型和msh2 Trp+CyhR候選物進行類似反應，一個使用親本特異性引物對(KNS11+KNS29，第一泳道)，另一個使用重組體特異性引物對(KNS11+KNS28，第二泳道)。對照反應是對含有已知側翼標記序列配置的適宜親本(P)或重組體(R)基因組DNA進行的。(-)是無DNA的對照。
圖6顯示了第二輪重組的重組頻率。將第一輪重組后得到的野生型和msh2單倍體與MXY64和MXY66進行交配，以產生含有鑲嵌Oxa7-Oxa11重組盒的野生型(MXY81、MXY82、和MXY83)和msh2(MXY86、MXY87、和MXY88)二倍體。Oxa11重組底物純合的野生型(MXY90)和msh2(MXY92)二倍體也可由MXY60和MXY62的重組后代構建而得。使所有二倍體形成孢子，并將孢子突變在用于選擇Ura+CanR和Trp+CyhR重組體的培養基上。
序列表簡述序列表包括以下序列SEQ ID No.1和2分別顯示了用于擴增MSH2的引物MSH2UP和MSH2DN的序列。
SEQ ID No.3至SEQ ID No.6分別顯示了引物MSH2A1、MSH2A2、MSH2A3、和MSH2A4的序列，它們是MSH2特異性分析引物。
SEQ ID No.7和SEQ ID No.8分別顯示了引物K2KANMX和K3KANMX的序列，它們是KanMX特異性分析引物。
SEQ ID No.9和SEQ ID No.10分別顯示了用于擴增LEU2的引物LEU2UP和LEU2DN的序列。
SEQ ID No.11和SEQ ID No.12分別顯示了用于擴增HIS3的引物HIS3UP和HIS3DN的序列。
SEQ ID No.13和SEQ ID No.14分別顯示了用于擴增3′靶向序列的引物KNS1和KNS2的序列。
SEQ ID No.15和SEQ ID No.17分別顯示了用于擴增5′靶向序列的引物KNS3、KNS4、和KNS6的序列。
SEQ ID No.18和SEQ ID No.19分別顯示了用于擴增Oxa7的引物KNS7和KNS8的序列。
SEQ ID No.20和SEQ ID No.21分別顯示了用于擴增Oxa11的引物KNS9和KNS10的序列。
SEQ ID No.22顯示了引物KNS12的序列，它是BUD31下游分析引物。
SEQ ID No.23顯示了引物KNS13的序列，它是BUD31上游分析引物。
SEQ ID No.24顯示了引物KNS14的序列，它是TRP1特異性分析引物。
SEQ ID No.25顯示了引物KNS15的序列，它是URA3特異性分析引物。
SEQ ID No.26和SEQ ID No.27分別顯示了用于擴增CYH2的引物KNS17和KNS18的序列。
SEQ ID No.28顯示了引物KNS30的序列，它是用作測序引物的TRP1特異性正向引物。
SEQ ID No.29顯示了引物KNS31的序列，它是用作測序引物的CAN1特異性反向引物。
SEQ ID No.30顯示了引物KNS33的序列，它是用作測序引物的CYH2特異性反向引物。
SEQ ID No.31和SEQ ID No.32分別顯示了用于擴增Oxa5的引物KNS36和KNS37的序列。
SEQ ID No.33顯示了引物KNS38的序列，它是用作測序引物的URA3特異性正向引物。
實施例在釀酒酵母錯配修復突變體中生成鑲嵌基因1.材料與方法1.1培養基用標準的豐富培養基YPD(Bio101)進行常規培養，用合成的撤除培養基(Bio101)監測遺傳標記和篩選重組體。為了生成孢子，將細胞在添加所需營養補充物的SPS培養基(50mM鄰苯二甲酸鉀pH5.0、0.5％酵母提取物(Difco)、1％細菌用蛋白胨(Difco)、0.17％酵母氮基、1％醋酸鉀、0.5％硫酸銨)中培養過夜，洗滌，在添加補充物的1％醋酸鉀中重懸，并振搖溫育2天。所有操作均在30℃進行。為了進行四分體分析，用蓋罩大蝸牛(Helixpomatia)β-葡糖醛酸糖苷酶(Sigma)消化子囊，并用裝配有TDM400顯微操作器(Micro Video Instruments，Inc.)的Nikon Eclipse E400顯微鏡進行解剖。其它遺傳方法均如Ausubel等人，《(Current Protocols in Molecular Biology》，1998，John Wiley and Sons，Inc.，New York所述進行。所有酵母轉化均依照Agatep等人的聯機技術要點使用LiAc方法進行(http://tto.trends.com)。
1.2酵母菌株本研究中采用的或生成的所有酵母菌株列于表1和表2。所有酵母菌株都是易于生成孢子的W303背景的同基因衍生物。作為重組盒的轉化宿主，二倍體MXY47通過如下轉化和遺傳雜交構建。用LEU2片段(用序列表中所列的引物對LEU2UP/LEU2DN對W303菌株U474進行制備性PCR獲得)轉化單倍體D184-1B(S.Gangloff饋贈，CEA，France)，產生Leu+單倍體MXY13。用HIS3片段(用引物對HIS3UP/HIS3DN對ORD4369-25D進行制備性PCR獲得)轉化單倍體D184-1C(S.Gangloff饋贈)，產生His+單倍體MXY25。單倍體MXY18和MXY22分別是在10μg/ml環己酰亞胺上選擇得到的D184-1B和D184-1C的隱性環己酰亞胺抗性(cyh2R)衍生物；通過測序和分離分析驗證了賦予環己酰亞胺抗性的CYH2基因座存在突變圖譜(兩個不同核苷酸改變導致第38位谷氨酰胺變為賴氨酸)。將MXY18和MXY25雜交，得到二倍體MXY29；將MXY13和MXY22雜交，得到二倍體MXY33。將單倍體分離體MXY29-6D和MXY33-8C雜交，得到MXY38，它是leu2-3、112和his3-11、15標記的雜合子及cyh2R突變的純合子。用引物MSH2UP和MSH2DN通過PCR由RBT348(R.Borts饋贈，University of Leicester)擴增得到msh2::KanMX盒，并用它轉化MXY38，得到MXY47。在200μg/mlG418(Invitrogen)上選擇轉化體，并通過用引物MSH2A1、MSH2A2、MSH2A3、和MSH2A4進行的菌落PCR(見下文)和四分體分析，即分析四種孢子，進行驗證，以確認標記分離。
表1單倍體酵母菌株
表2二倍體酵母菌株
1.3質粒構建以細菌菌株XL1-Blue MRF′(ΔmcrA)183(mcrCB-hsdSMR-1mrr)173 endA1supE44 thi-1 recA1 gyA96 relA1 lac[F′proAB laclqZΔM15 Tn10(Tetr])和JM110 (rpsL[Strr]thr leu thi-1 lacY galK galT ara tsx dam dcm supE44Δ[lac-proAB][F’traD36 proAB laclqZΔM15])作為克隆宿主。用標準方法構建質粒(Ausubel等人)。本研究中采用的或構建的所有質粒在表3中列出。克隆中所用的限制酶、T4 DNA連接酶和其它酶購自New England BioLabs。DNA片段和質粒用Qiagen和Macherey-Nagel的試劑盒純化。
用引物對KNS3/KNS4通過制備性PCR由W303基因組DNA擴增對應于BUD31基因座的上游(“5′靶”)序列，并作為KpnI/XhoI片段克隆到經KpnI/XhoI消化的pKSII(+)(Stratagene)中，從而產生pMXY1；用引物對KNS1/KNS2類似擴增下游(“3′靶”)靶向序列，并作為XbaI/NotI片段克隆到經XbaI/NotI消化的pKSII(+)(Stratagene)中，從而產生pMXY2。作為BglII/EcoRI片段從pJH53(R.Borts饋贈)中切下TRP1標記，并與經BamHI/EcoRI消化的pMXY1連接，得到pMXY3；通過XhoI/HindIII消化從pRED316(R.Borts饋贈)中切下UR43標記，并與經XhoI/HindIII消化的pMXY1連接，得到質粒pMXY4。作為SmaI片段由pRED316分離CAN1標記，并與經HpaI消化的pMXY2連接，得到質粒pMXY5。將用引物對KNS4/KNS6由基因組DNA再次擴增得到的序列作為KpnI/XhoI片段連接到經KpnI/XhoI消化的pMXY3和pMXY4中，由此替換各自質粒中的5′靶向序列，得到pMXY7和pMXY6。通過這一步驟加入了克隆后期所需的引物KNS3中缺乏的限制性位點。將包含5′靶和URA3標記的pMXY6的KpnI/SmaI片段與經KpnI/SmaI消化的pMXY5連接，得到URA3-CAN1重組盒載體pMXY9。將包含5′靶和TRP1標記的pMXY7的KpnI/SpeI片段與經KpnI/SPeI消化的pMXY2連接，得到pMXY11。最后，用引物對KNS17/KNS18由W303基因組DNA通過制備性PCR擴增CYH2標記，用BamHI和PvuI消化，與經BglII/PacI消化的pMXY11連接，得到TRP1-CYH2重組盒載體pMXY12。所有質粒構建體通過電穿孔導入細菌宿主，并通過限制性分析加以證實，通過對所有克隆連接處進行測序進一步確認pMXY9和pMXY12。
通過制備性PCR由宿主質粒(W.Schoenfeld提供)擴增β-內酰胺酶重組底物，對于Oxa5(登記號X58272)使用引物對KNS36/KNS37，對于Oxa7(登記號X75562)使用引物對KNS7/KNS8，而對于Oxa11(登記號Z22590)使用引物對KNS9/KNS10。用PacI消化Oxa7和Oxa11的PCR產物，并與經SmaI/PacI消化的pMXY9連接，分別產生pMXY13和pMXY14。還用SpeI和PacI消化Oxa11的PCR產物，并與經SpeI/PacI消化的pMXY12連接，產生pMXY22。用BamHI和PacI消化Oxa5的PCR產物，并與經BglII/PacI消化的pMXY9連接，產生pMXY24。所有構建體通過限制性分析加以證實。
表3質粒
1.4重組體的篩選與鑒定為了第一輪重組，用NotI消化攜帶重組盒的質粒，并將所有消化產物用于轉化MXY47。選擇尿嘧啶(對于pMXY9衍生物)或色氨酸(對于pMXY12衍生物)原養型，并通過菌落PCR證實所導入構建體對BUD31-HCM1基因座兩個染色體拷貝其中之一的靶向，對于URA3-CAN1衍生物，使用引物KNS12/KNS13/KNS15，而對于TRP1-CYH2衍生物，使用引物KNS12/KNS13/KNS14，它們能由完整的或斷裂的BUD31-HCM1基因座擴增片段。使經過轉化的雜合子生成孢子，采用四分體分析來鑒定攜帶重組盒的野生型或msh2單倍體。將適合的對立交配型的單倍體涂布到YPD平皿上，培養過夜，在相同的YPD平皿上混合，并交配過夜。將交配平板以復制方式轉接-Ura-Trp培養基，用來選擇二倍體細胞，第二天將其大量接種到添加了補充物的SPS中并培養過夜。將預培養物離心，洗滌，將細胞重懸于添加了補充物的1％醋酸鉀并溫育2天。
收獲孢子，定量，并在某些情況中解剖以確認所有標記的正確分離。用酶解酶-20T(ICN Biomedicals)消化子囊以釋放孢子，將孢子懸浮液超聲處理(Branson 250型數字超聲儀)，并將適當稀釋液涂布到YPD上以測定細胞活力，涂布到含有60ug/ml刀豆氨酸(Sigma)的尿嘧啶撤除培養基上以選擇Ura+CanR重組體，和涂布到含有3ug/ml環己酰亞胺(Sigma)的色氨酸撤除培養基上以選擇Trp+CyhR重組體。對每種培養基上生長的孢子菌落計數，并進行表型和分子檢測以確定它們是否為真正的重組體。為了表型分析，將有代表性數量的候選重組體在與選擇所用相同的培養基上再次劃線，隨后以復制方式轉接-Ura、-Trp、環己酰亞胺(10μg/ml)、刀豆氨酸(60μg/ml)、和交配型檢測平皿。
還將孢子涂布到-Ura-Trp培養基上以測定每份孢子制劑的二倍體頻率，它在所有情況中低于活細胞總數的4％。為了分子分析，采用特異擴增親本或重組片段的合適引物對對基因組總DNA進行分析PCR(見下文)。將特定選擇的重組頻率表述成特定選擇培養基上活細胞的頻率，并對展示假陽性表型的非重組體進行校正。在多數情況中，通過分析性PCR可知這種假陽性因CAN1或CYH2標記的突變失活引起。
為了第二輪重組，將第一輪重組衍生的合適重組體進行交配，并選擇Ura+Trp+二倍體。生成孢子程序與第一輪重組相同，只是將孢子涂布到YPD、用于選擇Ura+CyhR重組體的含環己酰亞胺的尿嘧啶撤除培養基、和用于選擇Trp+CanR重組體的含刀豆氨酸的色氨酸撤除培養基上。對候選重組體同樣進行表型和分子分析。
1.5分子生物學方法依照Ausubel等人的標準微量制備程序由YPD過夜培養物制備基因組DNA，作為制備性或分析性PCR的模板。克隆或測序所用片段的制備性PCR如下進行以Oxa質粒DNA(約50pg)或酵母基因組DNA(約0.5μg)作為模板，50μl反應體系含有2.5U Herculase聚合酶(Stratagene)、1x Herculase反應緩沖液、0.2mM每種dNTP、和100ng每種引物。擴增如下進行94℃2min；30個循環，94℃ 10s，55℃ 30s，72℃ 30s；68℃ 10min。用修改后的菌落PCR來驗證重組盒整合到BUD31基因座處(http://www.fhcrc.orq/labs/hahn/methods/mol bio meth/pcr yeast colony.html)，擴增條件如下95℃ 5min；35個循環，95℃ 1min，55℃ 1min，68℃ 1min；72℃ 10min。如下進行分析性PCR以鑒定Oxa插入物的特征，100μl反應體系含有約0.5μg由候選重組體和對照菌株制備的基因組DNA、1.5U Taq聚合酶(Roche)、1x反應緩沖液、0.2mM每種dNTP、和100ng每種引物，擴增條件與菌落PCR相同，只是延伸改為68℃ 2min。所有擴增反應均在Mastercycler gradient 5331(Eppendorf)上進行。
為了重組Oxa插入物的序列分析，先用引物對KNS16/KNS29(針對Ura+CanR重組體)或KNS11/KNS28(針對Trp+CyhR)進行制備性PCR，然后用Qiaquick PCR試劑盒(Qiagen)進行純化。根據情況選擇引物KNS30、KNS31、KNS33、或KNS38用Genome Express(Meylan，FR)對PCR產物進行測序。用Clone Manager軟件(Sci Ed Central)比對和分析重組體序列。PCR和測序中使用的寡核苷酸(表3)均購自Proligo France。
2.結果2.1酵母減數分裂同源重組系統的開發開發了利用釀酒酵母來促進不同DNA序列之間體內重組的策略。這種策略的關鍵特色包括使用減數分裂細胞，其中發生高水平的基因組范圍內的重組；還有滅活錯配修復(MMR)系統，它通常限制不同序列之間的重組。將待重組序列，即重組底物，導入還攜帶側翼標記序列的兩種載體其中之一，生成重組盒。將這些重組盒導入酵母基因組，位于染色體III上的一個基因座(BUD31-HCM1間隔)，它位于已知在減數分裂中具有重組活性的區域中。使重組盒雜合的二倍體生成孢子，并將孢子涂布到選擇具有特定側翼標記配制的細胞的培養基上，由此能夠選擇其中發生了涉及重組底物的交換的重組體(圖1)。
構建了兩種通用重組盒載體，pMXY9和pMXY12，它們分別含有URA3和CAN1以及TRPI和CYH2標記，位于可用于導入重組底物的限制性位點的側翼(圖2)。URA3標記賦予尿嘧啶原養型，而CAN1標記賦予刀豆氨酸敏感性。如果缺乏此標記，細胞將對藥物有抗性。TRP1標記賦予色氨酸原養型，而CYH2標記賦予環己酰亞胺敏感性。如果缺乏此標記，細胞將對藥物有抗性。兩種重組盒每種繼而側翼為能夠通過轉化感受態細胞將整個插入物靶向BUD31-HCM1基因座的序列(圖2)。還構建了作為初始轉化宿主的菌株MXY47(表2)。該二倍體是msh2::KanMX突變的雜合子，且在表型上是錯配修復系統的野生型。它還是ura3-1、trp1-1、can1-100、和cyh2R標記的純合子，它們能夠用來監測重組盒標記的存在；而且是his3-11、15和leu2-3、112標記的雜合子。用攜帶重組盒的片段轉化MXY47，作為Ura+或Trp+原養型來選擇初始轉化體(分別是MXY9和MXY12衍生物)，并用能夠識別所導入構建物內部或外部序列的引物進行分析性PCR以驗證靶向作用。使初始轉化體生成孢子，解剖四分體孢子，并通過復制平板來鑒定攜帶重組盒的野生型或msh2分離體。將合適的單倍體互相交配，以生成重組底物雜合的MSH2/MSH2(野生型)和msh2/msh2二倍體。在生成重組體的第一輪減數分裂重組中，使這些二倍體生成孢子，并將游離孢子涂布到缺乏尿嘧啶但含有刀豆氨酸的培養基上，以選擇具有URA3-CYH2側翼標記配置的重組體(Ura+CanR孢子菌落)；或者涂布到缺乏色氨酸但含有環己酰亞胺的培養基上，以選擇TRY1-CAN1配置(Trp+CyhR孢子菌落)。親代二倍體和未重組單倍體子代不能在這些培養基上生長。測定選擇性培養基上孢子菌落出現的頻率，將候選重組孢子菌落通過復制平板在檢測培養基上進行表型鑒定并采用適合引物對通過PCR進行分子鑒定，選擇證實是重組體的樣本進行測序。
本策略可以反復進行，因為可以鑒定攜帶重組插入物的細胞并進行多輪減數分裂重組從而增加多樣性。在第二輪中，將Ura+CanR和Trp+CyhR單倍體進行交配，并重復孢子生成和選擇過程，只是在用于選擇具有URA3-CAN1側翼標記配置的重組體(Ura+CyhR孢子菌落)的缺乏尿嘧啶但含有環己酰亞胺的培養基上或者在用于選擇TRY1-CYH2配置(Trp+CanR孢子菌落)的缺乏色氨酸但含有刀豆氨酸的培養基上選擇新的重組體。還可以修改本文詳述的策略，從而包括更多的標記以增加選擇的嚴謹性。此外，還可以通過用側翼序列特異性引物進行的PCR直接選擇重組體。
2.2對具有不同序列差異性的Oxa基因對之間的重組進行的表型選擇選擇屬于β-內酰胺酶Oxa超家族的基因做為底物來測試系統選擇重組體的可行性。在野生型和msh2背景中評價了下列Oxa對之間的重組Oxa11-Oxa11，它們在800bp的開放讀框內享有100％同源性；Oxa7-Oxa11，95％；Oxa5-Oxa11，78％。誘導通過適合單倍體之間雜交生成的二倍體進入減數分裂。由減數分裂培養物制備孢子，將系列稀釋液涂布到YPD上以測定細胞活力，并涂布到缺乏尿嘧啶但含有刀豆氨酸的培養基(-Ura+Can)上及缺乏色氨酸但含有環己酰亞胺的培養基(-Trp+Cyh)上以選擇重組體。
2.3具有不同序列同源性的Oxa基因之間的重組頻率圖3所示數據表明，在野生型背景中，序列異源性增加對交換重組具有強烈抑制效果，而且這種效應通過msh2突變受到減輕但未消除。一般來說，在所檢測的兩個差異性水平，msh2突變使重組頻率相對于野生型菌株的觀測結果升高了約一個數量級。然而，單獨滅活MSH2不能完全補償對具有較高程度異源性的重組底物之間重組的抑制作用。例如，含享有78％同源性的Oxa插入物的msh2菌株(MXY102)的重組頻率比含具有100％同源性的Oxa插入物的野生型菌株(MXY60)的重組頻率要低至少10倍(Ura+CanR)和25倍(Trp+CyhR)，這說明除了MSH2依賴性錯配修復外，還有其它因素妨礙更高差異性序列之間的交換重組。值得注意的是，在78％差異性水平上，msh2重組體出現的頻率仍有大約2x10-4，說明在差異甚至更大的底物之間也可以發生重組。
2.4 msh2超重組效應msh2對同源和部分同源重組的影響可通過以下方法量化首先計算每次實驗中指定選擇的指定同源性百分比的msh2與野生型重組體的比率，然后計算由此測定的比率全體的平均值和標準偏差。結果見圖4。msh2突變的存在使同源性為95％和78％的序列的部分同源重組頻率提高，而100％同一的序列之間的重組有較不顯著但仍可定量的增加。此外，msh2增加部分同源重組的程度對兩種選擇有所不同對于含有部分同源Oxa插入物的菌株，MSH2的失活提高Trp+CyhR重組體頻率的程度遠遠高于它提高Ura+CanR重組體頻率的程度。原則上，兩種類型的重組體(Ura+CanR和Trp+CyhR)的頻率應當相等，但這些數據顯示，系統中存在由msh2突變結合序列差異性程度的變化引起的或增強的偏倚。用于測試插入物和側翼標記序列對所獲得重組體類型的相對影響的實驗指出，這種偏倚是側翼標記的特性，但是尚不能說明重組底物在指導減數分裂重組事件結果中的影響(數據未顯示)。
2.5選定重組體的PCR分析圖5顯示了對Ura+CanR和Trp+CyhR孢子菌落進行PCR分析的實例，所述孢子來自含具有22％差異性的Qxa基因的野生型和msh2二倍體(分別是MXY99和MXY102)。對于每種菌株，對10個表現出每種重組體表型的孢子菌落進行分析。以每個菌落的提取物作為擴增模板，使用特異性擴增親本分子的引物對和特異性擴增重組分子的引物對。在每種情況中，只有預期的重組插入物得到了擴增，說明選定的孢子菌落含有通過親代Oxa重組底物之間重組生成的序列。這些結果還說明重組分子可以由孢子生成培養物直接回收，甚至不需要進行遺傳選擇步驟。這里，位于UPA3、CAN1、TRP1、和CYH2基因中的引物識別位點代表位于每種重組底物側翼的分子標記序列。
2.6第一輪減數分裂部分同源重組體的序列分析差異度為5％和22％對衍生自野生型和msh2二倍體(分別為MXY64和MXY66)的、含有共享95％同源性的重組底物且滿足表型和分子(PCR)檢驗要求的Oxa7-Oxa11減數分裂重組體進行序列分析。用對側翼標記特異的引物擴增重組片段，并用接近翻譯起始和終止位點的引物進行測序。總共分析了55個衍生自Oxa7-Oxa11二倍體的單倍體后代來自MXY64的14個Ura+CanR和13個Trp+CyhR重組體，及來自MXY66的14個Ura+CanR和14個Trp+CyhR重組體。在測序樣品長度中觀察到一些現象1)對于野生型和msh2重組體二者，交換發生的位置遍及整個編碼區，對特定區間沒有明顯偏愛。5′區發生的交換與3′區發生的交換同樣可能。同時，對于指定菌株，通過-Ura+Can或經-Trp+Cyh選擇得到的孢子菌落的交換位點的分布沒有明顯區別。2)交換區間中不中斷的同源性的長度也不重要在兩個距離很近的多態性之間(MXY66 Trp+CyhR#7、#8、和#13的位點543-552，其中位點1指ATG翻譯起始位點的腺苷殘基)和兩個間隔最遠的多態性之間(例如MXY66 Trp+CyhR#15的位點163-265)都檢測到交換。3)由野生型和msh2背景分離得到的重組Oxa插入物含有全長重組序列，有可能能夠編碼新的功能性Oxa蛋白質。也就是說，所有交換都以這種一種方式發生，即保留了完整的開放讀碼框，在交換區間中或在任何其它區間中沒有凈余的核苷酸插入或刪除。4)盡管多數重組序列的結構與局部同源區中兩個Oxa序列之間的簡單交換一致，然而由msh2背景分離得到的一些重組體展示更大復雜性。衍生自四個重組體(MXY66 Ura+CanR #16和#31及MXY66Trp+CyhR #5和#9)的序列展示更高鑲嵌程度，好象它們是由一次以上的交換事件產生的。實際上，對這其中兩個重組體的分析是復雜的，因為對電泳圖譜的檢查揭示了在測序區域內的多個位點存在兩個重疊峰，每個位點都對應于Oxa7-Oxa11多態性。這個觀察結果說明測序的分子群是異質的，對此最可能的解釋是msh2重組孢子中存在未修復或部分修復的異質雙鏈DNA。這種解釋與已知的msh2突變引起減數分裂后分離(PMS)頻率升高是一致的。這MXY66 Ura+CanR #16和#31這兩種情況中，一個或多個已修復位點側翼為未修復的異質雙鏈區段，這與 Gluck和Fabre(EMBOJ.193408)所揭示的msh2背景中小段錯配修復活性是一致的。同時觀察到msh2重組序列中與小段錯配修復無關的PMS的一些其它例子，說明這種候選錯配修復系統在矯正異質雙鏈DNA中的錯配時可能并不非高度有效。根據測序電泳圖譜得出，未矯正的異質雙鏈DNA的范圍變化很大，從約50個堿基的小范圍到幾乎覆蓋整個ORF的范圍。在野生型重組序列中，尚未發現存在PMS或小段錯配修復的證據。總之，這些發現提示在msh2減數分裂中產生的差異程度大于野生型減數分裂。
同樣由含有共享78％同源性的重組底物的野生型和msh2二倍體(分別為MXY99和MXY102)衍生減數分裂重組體。總共分析了衍生自Oxa5-Oxa11二倍體的重組后代的24個重組序列來自MXY99的5個Ura+CanR和3個Trp+CyhR重組體，及來自MXY102的9個Ura+CanR和7個Trp+CyhR重組體。通過對這些序列進行檢查，提示以下幾點趨勢1)在通過-Trp+CyhR選擇從野生型和msh2兩種菌株中得到的重組Oxa序列在整個ORF內不同位置展示交換，在整個共享同源性內可能輕微趨向于中間250bp區域(第333-573位核苷酸)。相反，在通過-Ura+CanR選擇從野生型和msh2兩種菌株中得到的重組體在交換位置上表現出顯著的偏好在5個野生型中的3個和9個msh2序列中的8個序列中，交換發生在共享同源性的區域的最后80個堿基內，即ORF的后10％。2)對于-Trp+Cyh選擇，絕對同源性區間中的交換范圍經鑒定為11至20個核苷酸，指示對具有序列同一性的這些較大區域的偏愛。相反，對于-Ura+Can選擇，交換區間較短，范圍為3至17個核苷酸(14個所涉及區間中的13個為13個核苷酸或更短)。3)對于所牽涉序列共享95％同源性的重組，得到的新序列同樣由完整的ORF組成，且可能編碼新的Oxa蛋白質。4)根據對電泳圖譜的檢查得出，在野生型重組體中未發現PMS的情況，但在一些msh2重組體中發現非常短的未修復異質雙鏈，包括7個Trp+CyhR重組體中的3個。這些區域最多包括67個核苷酸，小于在Oxa7-Oxa11重組體中觀察到的一些區域。總之，這些觀察結果指實，能夠由差異至少22％的重組底物選擇得到的重組序列，且這些序列編碼新的蛋白質。
2.7 Oxa7-Oxa11第二輪重組體的序列分析為了測試酵母系統以反復方式增加序列多樣性的能力，用第一輪減數分裂得到的Oxa7-Oxa11重組單倍體細胞構建了二倍體，并將這些新的二倍體進行第二輪減數分裂。在MXY64和MXY66的經過測序的Ura+CanR和Trp+CyhR后代中，選擇在相同區間發生交換的適當重組體對，構建新的二倍體，其中總的序列同源性水平又為95％。構建了3種野生型(MXY81、MXY82和MXY83)和3種msh2(MXY86、MXY87和MXY88)二倍體。同樣由MXY60和MXY62的適當重組后代構建僅含Oxa11序列插入物的對照野生型和msh2二倍體，產生MXY90和MXY92。使這些二倍體生成孢子，并將孢子涂布到缺乏尿嘧啶但含有環己酰亞胺的培養基(-Ura+Cyh)或者缺乏色氨酸但含有刀豆氨酸的培養基(-Trp+Can)上，以選擇第二輪重組體。如圖6所示，在所有這些菌株中觀察到的-Ura+CyhR和-Trp+CanR孢子菌落的頻率與MSH2基因的抗重組作用是一致的。兩種類型的菌落在野生型純合子MXY90的后代中的發現頻率大于10-5，而在具有Oxa插入物異源性的野生型二倍體的后代(MXY81、MXY82和MXY83)中降低了5-10倍。具有不同Oxa插入物的MSH2基因的失活(MXY86、MXY87和MXY88)使Ura+CyhR和Trp+CanR孢子菌落的頻率提高了2-6倍，與攜帶相同Oxa插入物的msh2二倍體(MXY92)水平相似。雖然所使用的培養基與第一輪重組體選擇時所使用的不同，但是野生型和msh2第二輪重組體的選擇頻率與第一輪重組體的相當。
選擇野生型(MXY81和MXY83)和msh2(MXY86)兩種背景中的Ura+CyhR和Trp+CanR孢子菌落進行測序。共測了14個野生型和7個msh2的Oxa插入物。在多數情況中，交換在第二輪重組中發生在新的區間，就位置和區間大小而言同樣沒有明顯偏好在整個Oxa ORF中發現了涉及不同區間的交換，范圍大到101個核苷酸，小到5個核苷酸。在一種情況(MXY83Trp+CyhR單倍體)中，第二輪交換發生在第一輪交換區間中，由此恢復了完整的Oxa11序列。由msh2二倍體回收得到的重組體比由野生菌株回收得到的重組體具有更大多樣性。對于msh2二倍體MXY86，觀察到一些孢子菌落表現出廣泛的PMS和序列鑲嵌現象，這與重組中間物中形成大段雜質雙鏈體是一致的。而且，異質雙鏈區段中的一些錯配得到了修復，再次與小段錯配修復活性是一致的。總之，在質量上，即在產生序列多樣性方面(例如交換區間的分布和PMS的發生率，及在數量上，即在提高總體部分同源(5％差異性)重組頻率方面，msh2背景中的第二輪重組都與第一輪重組同樣有效。
<110>麥克西斯法國股份有限公司(Mixis France S.A.)<120>在釀酒酵母中生成重組基因<130>18248<140>
<141>
<160>33<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>20<212>DNA<213>釀酒酵母<400>1agaactccag cactccgtat 20<210>2<211>20<212>DNA<213>釀酒酵母<400>2gagacctatc gccatcttca 20<210>3<211>20<212>DNA<213>釀酒酵母<400>3tcggttctta ctgccaagtg 20<210>4<211>20<212>DNA<213>釀酒酵母<400>4gagtggcaag aacttgtagc 20<210>5<211>20<212>DNA<213>釀酒酵母<400>5catgacgatg aggacatcac 20<210>6<211>20
<212>DNA<213>釀酒酵母<400>6cgttcggacc taacatctct 20<210>7<211>20<212>DNA<213>釀酒酵母<400>7atgcttgatg gtcggaagag 20<210>8<211>20<212>DNA<213>釀酒酵母<400>8tatgcctctt ccgaccatca 20<210>9<211>20<212>DNA<213>釀酒酵母<400>9aggtcgcctg acgcatatac 20<210>10<211>20<212>DNA<213>釀酒酵母<400>10tgaagaggag gtcgactacg 20<210>11<211>20<212>DNA<213>釀酒酵母<400>11ccacctagcg gatgactctt 20<210>12<211>20<212>DNA<213>釀酒酵母<400>12cgcctcgttc agaatgacac 20<210>13
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權利要求
1.用于在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中生成和檢測重組DNA序列的方法，包括以下步驟a)生成第一二倍體釀酒酵母細胞，其基因組在特定基因座中攜帶包含第一待重組DNA序列的第一重組盒，該序列側翼為至少第一和第二標記序列，并且在等位基因處攜帶包含第二待重組DNA序列的第二重組盒，該序列側翼為至少第三和第四標記序列，b)誘導a)中得到的第一二倍體細胞生成孢子，并c)分離含有其中第一重組DNA序列側翼為至少第一和第四標記序列的重組盒的單倍體細胞，及含有其中第二重組DNA序列側翼為至少第二和第三標記序列的重組盒的單倍體細胞。
2.依照權利要求1的方法，還包括以下步驟a)通過將1c)中得到的含有第一重組DNA序列的單倍體細胞與1c)中得到的含有第二重組DNA序列的單倍體細胞進行交配，從而生成第二二倍體細胞，b)誘導a)中得到的第二二倍體細胞生成孢子，并c)分離含有其中第三重組DNA序列側翼為至少第一和第二標記序列的重組盒的單倍體細胞，并且分離含有其中第四重組DNA序列側翼為至少第三和第四標記序列的第四重組盒的單倍體細胞。
3.依照權利要求1或2的方法，其中通過將2c)中得到的單倍體細胞與其它單倍體細胞進行至少一輪新的交配，誘導所得到的二倍體細胞生成孢子，并根據兩種標記序列間的分子連鎖分離含有重組DNA序列的單倍體細胞，從而得到另一重組DNA序列。
4.依照權利要求1-3任一項的方法，其中通過用含有第一重組盒的DNA分子和含有第二重組盒的DNA分子同時或相繼轉化二倍體釀酒酵母細胞，并任選使兩種重組盒整合到釀酒酵母基因組的等位基因中，從而生成第一二倍體細胞。
5.依照權利要求4的方法，其中含有第一或第二重組盒的DNA分子是酵母人工染色體(YAC)。
6.依照權利要求4的方法，其中含有第一或第二重組盒的DNA分子是克隆載體，由此兩種標記序列各自側翼為與釀酒酵母基因組特定基因座同源的靶向序列。
7.依照權利要求1-3任一項的方法，其中通過將其基因組在某基因座中攜帶第一重組盒的單倍體釀酒酵母細胞與在等位基因處攜帶第二重組盒的單倍體釀酒酵母細胞進行融合，從而產生第一二倍體細胞。
8.依照權利要求1-3任一項的方法，其中通過將其基因組在某基因座中攜帶第一重組盒的單倍體釀酒酵母細胞與在等位基因處攜帶第二重組盒的單倍體釀酒酵母細胞進行交配，從而產生第一二倍體細胞。
9.依照權利要求7或8的方法，其中攜帶第一或第二重組盒的單倍體細胞通過以下步驟生成a)將第一待重組DNA序列插入第一克隆載體上相鄰的第一與第二標記序列之間，并將第二待重組DNA序列插入第二克隆載體上相鄰的第三與第四標記序列之間，由此兩種標記序列各自側翼為與釀酒酵母基因組特定基因座同源的靶向序列，b)由a)中得到的克隆載體中分別切下攜帶第一重組盒和第二重組盒的片段，由此每個重組盒包含側翼為各自兩種標記序列的待重組DNA序列，且每種盒繼而側翼為靶向序列，c)將b)中得到的攜帶側翼為靶向序列的重組盒的片段分別轉化到二倍體釀酒酵母細胞中，由此靶向序列引導所述盒整合到與其同源的基因座中，以獲得第一盒或第二盒的雜合二倍體細胞，d)分別誘導c)中得到的雜合二倍體細胞生成孢子，并e)分別分離含第一盒并表達第一和第二標記序列的單倍體細胞及含第二盒并表達第三和第四標記序列的單倍體細胞。
10.依照權利要求9的方法，其中第一克隆載體是質粒pMXY9且第二克隆載體是質粒pMXY12。
11.依照權利要求4-6、9或10任一項的方法，其中用于轉化的二倍體釀酒酵母細胞是至少兩種營養素的營養缺陷型。
12.依照權利要求11的方法，其中二倍體細胞是ura3-1等位基因和trp1-1等位基因的純合子，這分別使它們成為尿嘧啶和色氨酸的營養缺陷型。
13.依照權利要求4-6或9-12任一項的方法，其中用于轉化的二倍體細胞對至少兩種抗生素有抗性。
14.依照權利要求13的方法，其中二倍體細胞是can1-100等位基因和cyh2R等位基因的純合子，這分別使它們對刀豆氨酸和環己酰亞胺有抗性。
15.依照權利要求4-6或9-14任一項的方法，其中轉化使用釀酒酵母菌株MXY47的二倍體細胞，它們是等位基因ura3-1、trp1-1、can1-100和cyh2R的純合子且是msh2∷KanMX突變的雜合子。
16.依照權利要求1-15任一項的方法，其中釀酒酵母細胞具有功能性錯配修復系統。
17.依照權利要求1-15任一項的方法，其中釀酒酵母細胞的錯配修復系統存在暫時的或永久的缺陷。
18.依照權利要求17的方法，其中錯配修復系統暫時的或永久的缺陷是由下述原因引起的參與錯配修復系統的一種或多種基因存在突變和/或可誘導表達或遏制，用飽和錯配修復系統的試劑處理，和/或用全面損壞錯配修復的試劑處理。
19.依照權利要求1-18任一項的方法，其中第一和第二重組盒整合到釀酒酵母基因組染色體III上的BUD31-HCM1基因座中。
20.依照權利要求1-19任一項的方法，其中第一和第二待重組DNA序列有至少一個核苷酸不同。
21.依照權利要求1-20任一項的方法，其中第一和第二待重組DNA序列衍生自釀酒酵母以外的生物體且包括釀酒酵母。
22.依照權利要求1-21任一項的方法，其中第一和第二待重組DNA序列包含一種或多種非編碼序列和/或一種或多種蛋白質編碼序列。
23.依照權利要求1-22任一項的方法，其中標記序列選自營養標記、色素標記、抗生素抗性標記、抗生素敏感性標記、引物識別位點、內含子/外顯子邊界、編碼酶特定亞基的序列、啟動子序列、下游受調節基因序列和限制酶位點。
24.依照權利要求23的方法，其中第一和第三標記序列是營養標記，其基因產物可補償釀酒酵母細胞的營養缺陷。
25.依照權利要求24的方法，其中第一標記序列是URA3，其基因產物可賦予尿嘧啶營養缺陷型釀酒酵母細胞以尿嘧啶原養型。
26.依照權利要求24的方法，其中第三標記序列是TRP1，其基因產物可賦予色氨酸營養缺陷型釀酒酵母細胞以色氨酸原養型。
27.依照權利要求23的方法，其中第二和第四標記序列是抗生素敏感性標記，其基因產物可賦予對抗生素有抗性的釀酒酵母細胞以對該抗生素的敏感性。
28.依照權利要求27的方法，其中第二標記序列是CAN1，其基因產物可賦予刀豆氨酸抗性釀酒酵母細胞以對刀豆氨酸的敏感性。
29.依照權利要求27的方法，其中第四標記序列是CYH2，其基因產物可賦予環己酰亞胺抗性釀酒酵母細胞以對環己酰亞胺的敏感性。
30.依照權利要求1-29任一項的方法，其中通過PCR方法檢測各自標記組合的存在，從而鑒定含有攜帶第一、第二、第三或第四重組DNA序列的重組盒的單倍體細胞。
31.依照權利要求1-29任一項的方法，其中通過將單倍體細胞涂布在選擇相同DNA分子上各自標記組合的分子連鎖的培養基上，從而鑒定含有攜帶第一、第二、第三或第四重組DNA序列的重組盒的單倍體細胞。
32.依照權利要求31的方法，其中將含第一重組DNA序列的單倍體細胞涂布在選擇相同DNA分子上第一與第四標記序列的分子連鎖的培養基上。
33.依照權利要求31的方法，其中將含第二重組DNA序列的單倍體細胞涂布在選擇相同DNA分子上第二與第三標記序列的分子連鎖的培養基上。
34.依照權利要求31的方法，其中將含第三重組DNA序列的單倍體細胞涂布在選擇相同DNA分子上第一與第二標記序列的分子連鎖的培養基上。
35.依照權利要求31的方法，其中將含第四重組DNA序列的單倍體細胞涂布在選擇相同DNA分子上第三與第四標記序列的分子連鎖的培養基上。
36.質粒pMXY9，含有相鄰的URA3標記基因和CAN1標記基因，由此兩種標記序列位于用于插入待重組DNA序列的多接頭序列的側翼，且由此兩種標記側翼為與釀酒酵母基因組染色體III上的BUD31-HCM1基因座同源的靶向序列。
37.依照權利要求36的質粒pMXY9，其中多接頭序列包含限制酶SmaI、XbaI、PacI和BglII的限制性位點。
38.質粒pMXY12，含有相鄰的TRP1標記基因和CYH2標記基因，由此兩種標記序列位于用于插入待重組DNA序列的多接頭序列的側翼，且由此兩種標記側翼為與釀酒酵母基因組染色體III上的BUD31-HCM1基因座同源的靶向序列。
39.依照權利要求38的質粒pMXY12，其中多接頭序列包含限制酶SmaI、SpeI和PacI的限制性位點。
40.釀酒酵母菌株MXY47，其特征在于其二倍體細胞是等位基因ura3-1、trp1-1、can1-100和cyh2R的純合子及msh2∷KanMX突變的雜合子。
41.含有質粒pMXY9的大腸桿菌菌株JM101。
42.含有質粒pMXY12的大腸桿菌菌株DH5a。
43.一種試劑盒，至少包含裝有釀酒酵母菌株MXY47的細胞的第一容器，裝有含有質粒pMXY9的大腸桿菌菌株JM101的細胞的第二容器，和裝有含有質粒pMXY12的大腸桿菌菌株DH5α的細胞的第三容器。
44.一種試劑盒，至少包含裝有釀酒酵母菌株MXY47的細胞的第一容器，裝有質粒pMXY9的DNA的第二容器，和裝有質粒pMXY12的DNA的第三容器。
全文摘要
本發明涉及用于在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中生成和檢測重組DNA序列的方法，以及用于實施本發明方法的質粒和釀酒酵母細胞。
文檔編號C12N1/15GK1938426SQ200580010383
公開日2007年3月28日 申請日期2005年1月28日 優先權日2004年1月30日
發明者凱瑟琳·史密斯, 羅納·博茨 申請人:麥克西斯法國股份有限公司