專利名稱：一種從水稻種子生產和分離純化重組人抗胰蛋白酶(OsrAAT)的方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種水稻遺傳密碼子優化的OsrAAT基因、相關載體及其從轉基因水稻種子生產、分離和純化OsrAAT的方法。
背景技術：
·人α1-抗胰蛋白酶(AAT)，也稱為人α 1_蛋白酶抑制劑(α 1-ΡΙ)，是人外周血中最富含絲氨酸的蛋白酶抑制劑。其主要是在肝臟中合成，并在肺中抑制中性粒細胞彈性蛋白酶(Blank、Brantly，1994)。AAT缺乏癥是一種與肺氣腫和肝臟疾病相關的遺傳性疾病(Eriksson, 1996)。靜脈注射增加源自血衆的人α1-抗胰蛋白酶(plasma-derived AAT,pAAT)是治療AAT缺乏癥病人唯一可行的臨床治療方法(Heresi和Stoller，2008)。此外，AAT還有許多的治療用途，如在預防小鼠I型糖尿病、治療皮膚病(Lewis，Shapiro等，2005 ；Brown, 2006)，并在先天免疫系統中發揮著重要的抗炎作用(許、戴等，2001)。目前，商業化生產的pAAT主要是來自人血漿，其產量受到血液供應的限制，而且人源PAAT具有傳播新的或未知病原體的風險，因此確保其安全性顯得非常復雜(Karnaukhova,Ophir等,2006)。除此之外，為了滿足市場需求,生產重組al_抗胰蛋白酶(rAAT)并具有成本效益的替代方法也不斷被開發出來。1983年，大腸桿菌首先被用于生產無活性的rAAT (Bollen等，1983)。之后用大腸桿菌表達系統表過rAAT的最高水平可達到38mg/L(Karnaukhova等,2004)。但是，由于大腸桿菌表達系統缺乏轉錄后的修飾作用，其表達的rAAT也只能用于實驗室研究。作為真核表達系統的酵母可以進行高甘露糖類型的聚糖修飾作用(Cregg, Cereghino等,2000),但這種修飾與人聚糖結構不同。缺失和異常的糖基修飾是妨礙酵母表達系統表達重組多糖蛋白的主要問題。盡管通過分批補料培養酵母來大規模生產rAAT的收率高達到1. 23g/L (Tamer和Chisti，2001)，然而，藥代動力學研究表明，酵母生產的rAAT會被迅速地從血液中清除(Casolaro，Fells等，1987)。也有研究用黑曲霉表達rAAT，因為其糖基化模式是更類似于哺乳動物(Maras，van Die等，1999 ；Gerngross 2004 ;Ward, Lin 等，2004 ;Nevalainen, Te' ο 等，2005)。然而，并沒有研究這個系統中的聚糖修飾作用，而且50mg/L的表達水平是仍然很低。因此這個系統表達的rAAT也僅限于實驗室研究。如小鼠、兔、山羊和綿羊等動物表達系統也成功地表達了 rAAT (Carlson, Rogers等，1989 ；Archibald, McClenaghan 等，1990 ；Massoud, Bischoff 等，1991 ； Wright, Carver等，1991 ；Carver, Wright 等，1992 ；Ziomek, 1998).也從綿羊奶(DalrympIe 和 Garner,1998)和山羊奶(Ziomek，1998)中獲得大規模生產的rAAT。盡管從轉基因綿羊奶中分離的rAAT純度達99. 9%，然而在人類體內，痕量的天然綿羊AAT和α1-抗糜蛋白酶便可以誘導一種全身性抗體應答(Spencer, Humphries等,2005)。也有用植物表達系統生產rAAT,包括水稻細胞(Terashima,Murai等，1999)、轉基因番爺(Agarwal, Singh等,2008)和葉綠體(Nadai, Bally等，2009)。其中，轉基因番茄和葉綠體中rAAT的表達水平分別達到總蛋白質的1. 55%至2%。在水稻細胞中rAAT的產量達到200毫克/升。最近發現，谷物作物的胚乳細胞是很有潛力的可用于生產重組蛋白質的表達系統。水稻胚乳已被用來表達各種重組藥物蛋白，如人乳鐵蛋白(Suzuki, Kelleher等，2003)、人溶菌酶(Yang, Guo等,2003)、rhIGF-Ι融合和人粒細胞-巨噬細胞群激活因子(Ning, Xie等，2008 ；Xie, Qiu等，2008)。最近，水稻種子成功地應用于大規模生產的重組人血清白蛋白(He，Ning等，2011)。這些研究表明，水稻胚乳是具有成本效益和安全性的藥物蛋白質表達平臺。盡管使用不同的表達系統來表達rAAT已經取得了進步，然而大規模生產植物源重組人抗胰蛋白酶仍受到表達水平的限制。而且，至今未見有關使用水稻胚乳來大規模生產重組人抗胰蛋白酶的報道，也未見有關從水稻種子中分離純化重組人抗胰蛋白酶方法的報道
發明內容

本發明的一個目的是提供一種水稻遺傳密碼子優化的重組人抗胰蛋白酶基因，以提高人抗胰蛋白酶基因在水稻種子的表達水平；本發明稱0srAAT(0ryZasatiVa AAT)基因，具有如SEQ ID NO.1所示的序列。進一步地，本發明還提供了含有上述OsrAAT基因的載體，優選水稻胚乳細胞特異性表達載體，更優選具有如圖3所示的結構的載體。本發明的另一個目的是提供上述載體在制備OsrAAT轉基因水稻種子中的應用。本發明的另一個目的是提供一種制備OsrAAT轉基因水稻種子的方法，包括以下步驟(I)制備具有如SEQ ID NO.1所示序列的OsrAAT基因； (2)構建水稻胚乳細胞特異性表達的OsrAAT表達載體和選擇性標記基因載體；(3)將步驟2所獲得載體共轉化到水稻品種的愈傷再生組織中；(4)培養所述愈傷再生組織，經篩選和誘導獲得OsrAAT轉基因水稻植株；(5)培養OsrAAT轉基因水稻植株，獲得OsrAAT轉因水稻種子。其中，所述OsrAAT表達載體優選具有如圖3所示的結構。其中，所述選擇性標記基因載體優選具有如圖4所示的結構。本發明的再一個目的是提供一種從OsrAAT轉基因水稻種子中分離純化OsrAAT的方法，包括以下步驟(I)以OsrAAT轉基因水稻種子為原料制備OsrAAT提取液；(2)以陰離子交換層析對OsrAAT提取液進行初級純化，獲得初級OsrAAT洗脫液，其中所述陰離子交換層析的介質為DEAE sepharose FF;(3)以陽離子交換結合金屬螯合的復合層析對初級OsrAAT洗脫液進行中級純化，獲得中級OsrAAT洗脫液,其中所述復合層析的介質為MacroprepCHT-1 ；(4)以陰離子交換結合疏水作用的復合層析對中級OsrAAT洗脫液進行末級純化，獲得純化的OsrAAT,其中所述復合層析的介質為Capto Adhere。進一步地，上述方法包括以下步驟(I)以OsrAAT轉基因水稻種子為原料，將稻谷脫殼成半精米并研磨成80-100目的米粉，將所述米粉與提取緩沖液以重量(kg)/體積(L)為1: 5-1 10的比例混合，常溫下提取I小時后將得到的混合物經濾布式板框壓濾機壓濾，得到澄清的OsrAAT提取液；其中所述提取緩沖液的成分為20-25mM磷酸鹽緩沖液、l-4mM巰基乙醇，pH6. 9-7.1 ；(2)采用DEAE sepharose FF填料的層析柱進行初級分離純化,采用8_12個柱體積的PH為6. 9-7.1的20-25mM磷酸鹽緩沖液，以100-180cm/h的流速平衡柱子；以步驟I的OsrAAT提取液作為上樣樣品，其中樣品電導為2-3. 5ms/cm, pH為6. 80-7. O.;用pH為6. 8-7.1的IOO-1lOmMPB緩沖液以100_180cm/h的流速洗脫樣品，收集含有OsrAAT的洗脫液，獲得初級OsrAAT洗脫液；(3)采用Macroprep CHT-1層析柱進行次級純化分離，采用8-12個柱體積的pH為6. 9-7. 2的5-12mM磷酸鹽緩沖液以100_150cm/h的流速平衡柱子，以稀釋四倍的步驟2中的初級OsrAAT洗脫液為上樣樣品，其中樣品電導為2-3. 5mS/cm，pH為6. 8-7. O ;用pH為
6.8-7.1的IOO-1lOmMPB緩沖液以100_180cm/h的流速洗脫樣品，收集含有OsrAAT的洗脫液，獲得中級OsrAAT洗脫液； (4)采用Capto Adhere層析進行精純，用8-12倍柱體積的pH為7. 5-8. 2的8_12mM磷酸鹽緩沖液以100-180cm/h的流速平衡柱子，以中級OsrAAT洗脫液為上樣樣品，其中樣品電導為 2-3. 5ms/cm, pH 為 6. 8-7.1 ;用 pH 為 6. 6-7. O 的 46mMPB, 400mMNaCl 緩沖液以100-180cm/h的流速洗脫樣品，收集含有OsrAAT的洗脫液，獲得純化的OsrAAT。進一步地,上述分離純化OsrAAT的方法包括以下步驟(I)以OsrAAT轉基因水稻種子為原料，將稻谷脫殼成半精米并研磨成80-100目的米粉，將所述米粉與提取緩沖液以重量/體積為Ikg IOL的比例混合，常溫下提取I小時后將得到的混合物經濾布式板框壓濾機壓濾，得到澄清的迦rAAT提取液；其中所述提取緩沖液的成分為20mM磷酸鹽緩沖液、ImM巰基乙醇，pH7. O ；(2M^2OmUtJDEAE sepharose FF 填料裝于 Econo-column 15/20 層析柱上，用200ml pH為7. O的20mM磷酸鹽緩沖液，以150cm/h的流速平衡柱子；以OsrAAT提取液作為上樣樣品，其中樣品電導為2. 6ms/cm，pH為6. 95 ;用pH為7. O的108mMPB緩沖液以150cm/h的流速洗脫樣品，收集含有OsrAAT的洗脫液，獲得初級OsrAAT洗脫液；(3)將 20ml 的 Macroprep CHT-1 填料裝于 Econo-column 15/20 層析柱上，用200ml pH為7. O的IOmM磷酸鹽緩沖液以150cm/h的流速平衡柱子，以稀釋四倍的步驟2中初級OsrAAT洗脫液為上樣樣品，其中樣品電導為3. 0ms/cm, pH為6. 90 ;用pH為7. O的108mMPB緩沖液以150cm/h的流速洗脫樣品，收集含有OsrAAT的洗脫液，獲得中級OsrAAT洗脫液；(4)將 IOml 的 Capto Adhere 裝于 Econo-column 15/20 層析柱上，用 200mlpH 為
8.O的IOmM磷酸鹽緩沖液以150cm/h的流速平衡柱子，以中級OsrAAT洗脫液為上樣樣品，其中樣品電導為3. 0ms/cm，pH為6. 90 ;用pH為6. 8的46mMPB，400mMNaCl緩沖液以150cm/h的流速洗脫樣品，收集含有OsrAAT的洗脫液，獲得純化的OsrAAT。


圖1是質粒p0sPMP02的結構示意圖。圖2是質粒p0sPMP131的結構示意圖。圖3是質粒p0sPMP132的結構示意圖。
圖4是質粒p0sPMP135的結構示意圖。圖5是Western雜交結果。顯示9株不同的轉基因水稻表達的OsrAAT均聚集在其胚乳細胞中。圖6是Southern雜交結果圖。其中，分別用EcoR1、HindIII以及同時用EcoRI和HindIII進行酶切。圖7顯示了不同植株中OsrAAT的表達水平。圖8是以陰離子交換層析作為初級純化，用不同填料進行層析的電泳圖譜；其中，圖8A 為 DEAE sepharose FF 填料，圖 8B 為 Macroprep DEAE 填料，圖 8C 為Capto Q填料；M :分子標記,S :上樣樣品,FT :穿透峰,Elu OsrAAT洗脫峰，Elul :雜質洗脫·峰，Elu2 =OsrAAT洗脫峰，CIP :在位清洗。圖9是以復合填料作為初級純化,用Macroprep CHT-1層析時的電泳圖譜；其中，M :分子標記，S :上樣樣品，FT :穿透峰，Elu =OsrAAT洗脫峰，CIP :在位清洗。圖10是以疏水層析作為中級純化，用不同填料進行層析時的電泳圖譜；其中圖1OA 為 Phenyl sepharose HP 填料，圖1OB 為 Phenyl sepharose FF HS 填料，圖1OC為Octyl sepharose FF填料；M :分子標記,S :上樣樣品,FT :穿透峰,Elu OsrAAT洗脫峰，CIP :在位清洗。圖11是以復合填料作為中級純化，用不同填料進行層析時的電泳圖譜；其中，圖1lA 為 Macropr印 CHT-1 填料，圖1lB 為 Capto MMC 填料，圖1lC 為 CaptoAdhere ；M :分子標記,S :上樣樣品,FT :穿透峰,Elu :OsrAAT洗脫峰,Elul :雜質洗脫峰，Elu2 =OsrAAT洗脫峰，CIP :在位清洗。圖12是以復合填料作為末級純化，用Capto Adhere層析時的電泳圖譜；其中，M :分子標記，S :上樣樣品，FT :穿透峰，Elu =OsrAAT洗脫峰，CIP :在位清洗。圖13是以親和填料作為末級純化，用不同填料進行層析是的電泳圖譜；其中，圖13A 為 AAT-select 填料，圖 13B 為 ConA sepharose 6B 填料;M :分子標記，S :上樣樣品,FT :穿透峰,Elu OsrAAT洗脫峰，clean 圖14是含有rAAT的粗體液依次經過陰離子交換層析、陽離子結合金屬螯合作用層析、陰離子結合疏水作用層析進行純化的電泳圖譜；其中使用的填料從左到右依次為DEAE sepharose FF、Macroprep CHT-J^PCaptoAdhere ；M :分子標記，S :上樣樣品，FT :穿透峰，Elu OsrAAT洗脫峰。圖15是純化后獲得的OsrAAT的HPLC純度圖譜(HPLC-SEC)。圖16是對OsrAAT生物活性的分析結果；其中，左圖是條帶轉移的SDS-PAGE分析結果，右圖是Western雜交結果；M :分子標記，1: 132-17T1代植株的OsrAAT，2 :人血漿AAT，3 :添加了豬彈性蛋白酶的OsrAAT，4 :添加了豬彈性蛋白酶的人血漿AAT，5 :水稻中華11的提取物。圖17是OsrAAT的豬彈性蛋白酶抑制活性的測定結果。
具體實施例方式以下通過結合附圖詳細說明本發明的特點和優點。所提供的實施例僅是對本發明方法的舉例說明，而不以任何方式限制本發明揭示的其余內容。
以下實施例中使用的Macroprep CHT-1填料,生產商是伯樂(BIO-RAD)公司；DEAEFast Flow、Macroprep-DEAE、Capto Q、Phenyl sepharose HP、Phenylsepahrose FF HS、Octyl sepharose FF>Capto MMC>Capto Adhere>MT~seIect> ConA sepharose 6B填料，生產商是通用電氣(GE Healthcare)公司；Econo_columnl5/20層析柱,購自伯樂(BIO-RAD)公司；XK16/20層析柱，購自通用電氣(GE Healthcare)公司；其他實施材料和試劑除特別說明之處均為普通市售。實施例1水稻特異性表達重組人抗胰蛋白酶載體的構建及轉基因水稻植株的獲得人AAT基因(Genbank登記號NM001002235)，由Heron Blue生物技術公司根據水稻偏好的遺傳密碼子合成，將46. 5%的人α1-抗胰蛋白酶(AAT)遺傳密碼子進行優化并使18. 1%的人α1-抗胰蛋白酶核苷酸發生改變，具體如SEQID NO.1所示，但是其相應的氨基酸序列沒有變化；本實施例選用水稻特異性啟動子Gtl3a及其信號肽來介導重組人抗胰蛋白酶基因在水稻胚乳細胞中的表達，具體參考
發明者楊代常, 施倩妮, 張莉平 申請人:武漢禾元生物科技有限公司