專利名稱：玉米油份含量相關(guān)的衣被蛋白復(fù)合體(copⅱ)基因位點及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及玉米油份含量相關(guān)的衣被蛋白復(fù)合體(COPII)基因位點及應(yīng)用，屬于玉米育種和分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
高油玉米的籽粒油份含量超過6%，高油玉米不僅是人類健康食品與優(yōu)質(zhì)動物飼料，而且還是重要的工業(yè)原料。玉米油富含較多的油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸，對人體健康具有重要作用，因此又稱為健康油。同時利用高油玉米籽粒作為飼料可以顯著提高牲畜的產(chǎn)肉率。而且高油玉米秸桿富含粗蛋白和其他營養(yǎng)成分，也是食草動物良好的青貯飼料。
玉米籽粒油脂常以三酰甘油(TAG)即在甘油骨架上附連三個脂肪酸的形式存在。 其基本過程乙酰輔酶A經(jīng)乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)催化形成丙二酰單酰輔酶A.這是脂肪酸合成的第一關(guān)鍵步驟，也是調(diào)控整個脂肪酸合成的限速步驟。然后脂肪酸合成酶(FAS) 以丙二酰單酰輔酶A為底物進行連續(xù)的聚合反應(yīng)，以每次循環(huán)增加2個碳鏈的頻率合成酰基碳鏈。而不斷增加的酰基碳鏈又與酰基載體蛋白(ACP)結(jié)合，ACP負責(zé)轉(zhuǎn)運脂肪酸合成途徑中的中間產(chǎn)物。經(jīng)過數(shù)次聚合反應(yīng)后，脂肪酸的合成在酰基-ACP硫酯酶或酰基轉(zhuǎn)移酶的作用下終止。終止聚合反應(yīng)后，不同碳鏈長度的酰基ACP，在酰基輔酶A合成酶的作用下生成酰基輔酶A，并從質(zhì)體轉(zhuǎn)運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或胞質(zhì)中。最后利用儲存在胞質(zhì)中的酰基輔酶A， 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中通過3種不同的酰基轉(zhuǎn)移酶(甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶GPAT、溶磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶LPAAT、二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶DGAT)。在甘油上附連脂肪酸以合成三酰甘油，并儲存在不連續(xù)分布的亞細胞器油體中。另外，脂肪酸合成后經(jīng)過不同的修飾方式合成長鏈脂肪酸和多不飽和脂肪酸。
近年來，隨著大量植物全基因組測序的完成，植物基因組學(xué)的研究已經(jīng)呈現(xiàn)出由簡單質(zhì)量性狀向復(fù)雜的數(shù)量性狀轉(zhuǎn)移的趨勢，特別是大量SNP標(biāo)記的開發(fā)以及生物信息學(xué)的迅猛發(fā)展，應(yīng)用關(guān)聯(lián)分析方法發(fā)掘植物數(shù)量性狀基因已成為目前國際植物基因組學(xué)研究的熱點之一。關(guān)聯(lián)分析(Association Analysis),又稱連鎖不平衡作圖(LD Mapping)或關(guān)聯(lián)作圖(Association Mapping),是一種以連鎖不平衡為基礎(chǔ)鑒定某一群體內(nèi)目標(biāo)性狀與遺傳標(biāo)記或候選基因關(guān)系的分析方法(Flint-Garcia et al，2003)。跟連鎖分析相比， 關(guān)聯(lián)分析具有以下優(yōu)點(I)連鎖分析需要構(gòu)建基于兩親本雜交的Fl衍生群體(F2、BC、 RIL等)，關(guān)聯(lián)分析可用現(xiàn)有的群體，大大縮短研究年限；(2)連鎖分析每次只能分析同一位點的2個等位基因，關(guān)聯(lián)分析可以同時分析同一位點的多個等位基因；(3)連鎖分析所用的群體小，加上群體來自兩親本，在群體內(nèi)發(fā)生的重組次數(shù)少，這樣往往導(dǎo)致連鎖作圖的精度低，例如玉米的作圖精度一般為10 30cM(Salvi，2005 ;Flint_Garcia，2005，而關(guān)聯(lián)分析的精度可大大提高，例如玉米自交系的精度為1500bp，達到單基因水平(Remington， 2001)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的
AM508群體由473個普通玉米自交系和35個高油玉米自交系組成(所述的群體材料，均為常見的玉米市售材料，可通過常規(guī)商業(yè)渠道購買得到)。候選基因重測序材料: 155份我國骨干自交系材料。從授粉15天后的AM508份自交系中隨機選擇368份自交系， 構(gòu)建200bp大小插入片段文庫，采用90bp末端配對的RNA測序技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組測序。每個個體的reads數(shù)為73. 8±0. 7百萬堿基，共產(chǎn)生了 2445. 9Gb的原始數(shù)據(jù)。
全基因關(guān)聯(lián)分析以AM508群體為材料,利用Illumina MaizeSNP50BeadChip對 56，110個位點進行了基因型檢測。從授粉15天后的508份材料中隨機選擇的368份材料則構(gòu)建200bp大小插入片段文庫，采用90bp末端配對的RNA測序技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組測序，每個個體的reads數(shù)為73. 8±0. 7百萬堿基，共產(chǎn)生了 2445. 9Gb的原始序列。
使用高質(zhì)量的SNP，分別對這兩個群體采用線性混合模型校正群體層化效應(yīng)和親緣關(guān)系后與油脂相關(guān)性狀進行了高密度標(biāo)記的全基因組關(guān)聯(lián)分析。為了綜合這兩個群體的結(jié)果，本研究研究使用了統(tǒng)一的閾值篩選顯著性的位點(建議水平顯著性閾值為1/N =1.78X IO-6以及5%基因組顯著性閾值為0. 05/N = 8. 94X10^)。為了在較多的顯著關(guān)聯(lián)信號中鑒定到唯一可能的因果突變基因，計算同一染色體上的顯著性信號位點間兩兩的連鎖不平衡，過濾掉r2小于O. 02的標(biāo)記。在定位到的單一的顯著性信號中。
衣被蛋白復(fù)合體基因(COPII)位于玉米第8條染色體(GRMZM2G003022)。利用368 份材料關(guān)聯(lián)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，位于玉米參考基因組上chr8. S_38521846的SNP位點，突變?yōu)镚/ T，其中G為主要等位基因，T為最小等位基因，最小等位基因的頻率為O. 06，該SNP位點與玉米油份顯著相關(guān)，該SNP位點與玉米衣被蛋白復(fù)合體基因(COPII)基因(GRMZM2G003022) 緊密連鎖。
玉米基因序列通過比對B73參考序列獲得,利用Primer Premier 5和Primer 3 設(shè)計引物擴增全長，利用MUSCLE軟件和BioEdit軟件進行多序列處理和比對，利用TASSEL2.O. I軟件提取SNP和InDel，同時通過1000次排列檢驗計算多態(tài)性間的r2值，采用F測驗計算兩個顯著性信號位點間兩兩的連鎖不平衡。根據(jù)COPII基因的InDel_20功能位點開發(fā)的標(biāo)記序列如下
PCR分子標(biāo)記序列
5' -GCCGAGGTCCAGCCGTAGT-3'
5' -GGCGAGGCCTGGAGAGAA-3,
測序引物序列
ZmCOPII Rl
5' -AAATACCTAACCGCGACGAC-3'
5' -GCCATCATCAATCCAGGG-3'
ZmCOPII R2
5' -CACAGTGCCATTTCGATCA-3'
5' -TAATACCAAGGGCAACCTCTAC-3'
ZmCOPII R3
5' -TGGAAACAAGTCGCCTACC-3'
5' -AGTGTAGGCCATGTCTGGTG-3'
ZmCOPII R4
5' -TGTGGCACGGGAGTTTTC-3'
5' -GGCTTTACCCTCAATATCGTCT-3'


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施例作進一步詳細的說明。
圖Ia展示的是ZmCOPII基因內(nèi)多態(tài)性位點與不同地區(qū)的油脂表型的關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果。X軸為該基因的長度(bp)，其起始密碼子定義為lbp。Y軸為對線性混合模型計算得到的顯著性P值取負的以10為底的對數(shù)值。
圖Ib ZmCOPII基因的結(jié)構(gòu)及其功能結(jié)構(gòu)域圖示。填充的黑色方塊表示外顯子，無色的方塊表示UTR區(qū)域，黑色虛線展示本研究中已測序的區(qū)域。黃色的橢圓形顯示的是該基因的功能域。InDel_20表示O或20bp的插入。R1、R2、以及R3、R4為用以測序的擴增序列片段。圖Ic為顯著關(guān)聯(lián)區(qū)域內(nèi)的標(biāo)記間兩兩配對的連鎖不平衡展示圖。每一個方塊內(nèi)的顏色對應(yīng)于腳注中不同顏色所代表的r2值。紫色星形指示了最顯著相關(guān)位點的位置。
圖Id授粉15天后ZmCOPII基因表達水平與油脂含量的相關(guān)性分析圖。X軸為標(biāo)準(zhǔn)化后的ZmCOPII基因的表達水平，Y軸為油脂的含量。r值為泊松相關(guān)系數(shù)值
圖Ie InDel_20位點不同等位基因型對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化后的ZmCOPII基因的表達水平。P值為雙尾檢測的顯著性結(jié)果。
圖If k22/單340F2 :3群體QTL定位結(jié)果，X軸為遺傳圖譜的位置，Y軸為LOD值。 灰線代表顯著性閾值(L0D = 2. 5)。
具體實施方式
以下將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述；應(yīng)當(dāng)理解，優(yōu)選實施例僅為了說明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍。
AM508群體由473個普通玉米自交系和35個高油玉米自交系組成，已在參考文獻 Yang, X. H. et al. Characterization of a global germplasm collection and its potential utilization for analysis of complex quantitative traits in maize. Mol. Breeding 121,417-431 公開過。
候選基因重測序材料155份我國骨干自交系材料，已在參考文獻Yang, X. H. et al. Genetic analysis and characterization of a new maize association mapping panel for quantitative trait loci dissection. Theor. Appl. Genet. 121, 417-431 (2010a).公開過。
轉(zhuǎn)錄組測序材料從授粉15天后的AM508份自交系中隨機選擇368份自交系，構(gòu)建200bp大小插入片段文庫，采用90bp末端配對的RNA測序技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組測序。每個個體的reads數(shù)為73. 8±0. 7百萬堿基，共產(chǎn)生了 2445. 9Gb的原始數(shù)據(jù)。
表型變異
AM508群體包含508個自交系(其中包括35個高油品系)油含量相關(guān)的變異豐富，軟脂肪酸含量差異2. 3倍，硬脂肪酸含量差異達8倍。軟脂肪酸(16: 0，15. 7% )、硬脂肪5酸(18:0,2. 1%)、油酸(18:1，28.0%)、亞麻油酸(18:2,51. 2% )和亞麻酸(18:3,1.4%) 這五種脂肪酸占98. 4%的油含量。4個環(huán)境聯(lián)合檢測發(fā)現(xiàn)十個油份相關(guān)性狀的遺傳力均在 90%以上。
全基因關(guān)聯(lián)分析
以AM508 群體為材料,利用 Illumina MaizeSNP50BeadChip 對 56，110 個位點進行了基因型檢測。從授粉15天后的508份材料中隨機選擇的368份材料則構(gòu)建200bp大小插入片段文庫，采用90bp末端配對的RNA測序技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組測序，每個個體的reads數(shù)為73. 8±0. 7百萬堿基，共產(chǎn)生了 2445. 9Gb的原始序列。
研究使用了 106萬個高質(zhì)量的SNP，分別對這兩個群體采用線性混合模型校正群體層化效應(yīng)和親緣關(guān)系后與油脂相關(guān)性狀進行了高密度標(biāo)記的全基因組關(guān)聯(lián)分析。為了綜合這兩個群體的結(jié)果，本研究研究使用了統(tǒng)一的閾值篩選顯著性的位點(建議水平顯著性閾值為1/N = 1.78X10-6以及5%基因組顯著性閾值為0. 05/N = 8. 94Χ1(Γ8)。為了在較多的顯著關(guān)聯(lián)信號中鑒定到唯一可能的因果突變基因，計算同一染色體上的顯著性信號位點間兩兩的連鎖不平衡，過濾掉r2小于O. 02的標(biāo)記。在定位到的單一的顯著性信號中，有若干個位點位于或者臨近于(50Kb)被前人證實報道過的已知基因內(nèi)，它們在本研究中再次得到了驗證。與已知的油脂代謝相關(guān)基因較遠的關(guān)聯(lián)位點很可能是與油脂代謝相關(guān)基因緊密連鎖，則距離最近的油脂代謝基因很可能就是本研究的候選基因。
衣被蛋白復(fù)合體基因(COPII)位于玉米第8條染色體(GRMZM2G003022)。利用368 份材料關(guān)聯(lián)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因位于chr8. S_38521846的SNP位點，突變?yōu)镚/T，其中G為主要等位基因，T為最小等位基因，最小等位基因的頻率為O. 06，該位點與玉米油份顯著相關(guān)，該SNP位點與玉米油分含量顯著關(guān)聯(lián)，解釋17. 6%的表型變異。
候選基因重測序
玉米基因序列通過比對B73參考序列獲得(www. maizesequence. org),利用 Premier 5(www. PremierBiosoft. com)和 Primer 3(http://frodo. wi. mit. edu/ primer3/)設(shè)計引物擴增全長，利用MUSCLE軟件和BioEdit軟件進行多序列處理和比對，利用TASSEL 2. O. I軟件提取SNP和InDel，同時通過1000次排列檢驗計算多態(tài)性間的r2值， 采用F測驗計算兩個顯著性信號位點間兩兩的連鎖不平衡。
測序引物序列
ZmCOPII Rl
5' -AAATACCTAACCGCGACGAC-3'
5' -GCCATCATCAATCCAGGG-3'
ZmCOPII R2
5' -CACAGTGCCATTTCGATCA-3'
5' -TAATACCAAGGGCAACCTCTAC-3'
ZmCOPII R3
5' -TGGAAACAAGTCGCCTACC-3'
5' -AGTGTAGGCCATGTCTGGTG-3'
ZmCOPII R4
5' -TGTGGCACGGGAGTTTTC-3'
5' -GGCTTTACCCTCAATATCGTCT-3'
根據(jù)COPII基因的功能位點InDel_20開發(fā)的標(biāo)記序列如下
PCR分子標(biāo)記序列
5' -GCCGAGGTCCAGCCGTAGT-3'
5' -GGCGAGGCCTGGAGAGAA-3'
重測序結(jié)果顯示，COPII基因在5’ UTR區(qū)域具有一個20bp的InDel多態(tài)性，利用 AM508群體進行關(guān)聯(lián)分析顯示，該位點與油分含量顯著關(guān)聯(lián)，并解釋9. 75%的表型變異。通過QTL定位研究也得到相同的結(jié)論。
玉米COPII基因多態(tài)性位點及AM508群體關(guān)聯(lián)分析結(jié)果
權(quán)利要求
1.玉米油份含量相關(guān)的衣被蛋白復(fù)合體(COPII)基因位點分子標(biāo)記，其特征在于，所述的相關(guān)分子標(biāo)記具體位點位于玉米參考基因組(WWW. maizesequence. org,5a. 60版)chr8. S_38521846的SNP，該位點突變?yōu)镚/T，以及位于玉米COPII基因(GRMZM2G003022)5> UTR區(qū)域InDel_20位點，上述位點與玉米油分含量顯著相關(guān)。
2.如權(quán)利要求I所述的分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于，該應(yīng)用包括以下步驟 a)由473個普通玉米自交系和35個高油玉米自交系組成AM508群體； b)從授粉15天后的AM508份自交系中隨機選擇368份自交系,構(gòu)建200bp大小插入片段文庫，采用90bp末端配對的RNA測序技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組測序。
3.如權(quán)利要求I所述的玉米衣被蛋白復(fù)合體(COPII)基因分子標(biāo)記的特異性擴增引物序列，其特征在于所述COPII基因的InDel_20功能位點開發(fā)的PCR分子標(biāo)記序列為5' -GCCGAGGTCCAGCCGTAGT-3'5' -GGCGAGGCCTGGAGAGAA-3'。
4.如權(quán)利要求I或2所述的玉米油份含量相關(guān)的衣被蛋白復(fù)合體(COPII)基因位點分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于玉米基因序列通過比對B73參考序列獲得，利用Primer 5和Primer 3設(shè)計引物擴增全長，利用MUSCLE軟件和BioEdit軟件進行多序列處理和比對，利用TASSEL 2.0. I軟件提取SNP和InDel，同時通過1000次排列檢驗計算多態(tài)性間的r2值，采用F測驗計算兩個顯著性信號位點間兩兩的連鎖不平衡。
5.如權(quán)利要求I或2所述的與玉米油份相關(guān)的SNP位點及玉米衣被蛋白復(fù)合體(COPII)基因功能分子標(biāo)記在玉米育種的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及與玉米油份含量相關(guān)的衣被蛋白復(fù)合體(COPII)基因位點及應(yīng)用，屬于分子育種領(lǐng)域。本發(fā)明的玉米油份相關(guān)的位點為玉米參考基因組(www.maizesequence.org，5a.60版)位于chr8.S_38521846的SNP位點，該位點突變?yōu)镚/T；以及位于玉米衣被蛋白復(fù)合體COPII基因(GRMZM2G003022)5’UTR區(qū)域InDel_20位點。可將分子標(biāo)記用于玉米品種或品系的基因型檢測，以判斷該品種或品系油份含量的大小。本發(fā)明采用分子標(biāo)記輔助選擇不僅準(zhǔn)確性高，加快選擇進度，提高了育種效率。
文檔編號C12Q1/68GK102978203SQ20121044471
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月9日
發(fā)明者嚴(yán)建兵, 楊小紅, 李建生, 李慧 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)