專利名稱：一種玉米油份含量相關的snp位點及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種玉米油份含量相關的SNP位點及其應用，屬于玉米育種和分子生物學領域。
背景技術：
高油玉米的籽粒油份含量超過6%，高油玉米不僅是人類健康食品與優質動物飼料，而且還是重要的工業原料。玉米油富含較多的油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸，對人體健康具有重要作用，因此又稱為健康油。油份在玉米籽粒中以三酰甘油的形式存在，包括軟脂酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:l)、亞油酸(C18:2)、亞麻酸(C18:3)、月桂酸(C12:l)、豆蘧酸(C14:l)、棕櫚油酸(C16:l)、花生酸(C20:l)、三崳酸(C22:l)、芥子酸(C22:2)、甘四烷酸(C24:l)。
其中最具商品價值的脂肪酸組分為軟脂酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸。玉米油的品質主要由飽和(C16:0、C18:0)與不飽和脂肪酸(C18:1、C18:2、C18:3)的比例決定。玉米籽粒油脂常以三酰甘油(TAG)即在甘油骨架上附連三個脂肪酸的形式存在。其基本過程乙酰輔酶A經乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)催化形成丙二酰單酰輔酶A.這是脂肪酸合成的第一關鍵步驟，也是調控整個脂肪酸合成的限速步驟。然后脂肪酸合成酶(FAS)以丙二酰單酰輔酶A為底物進行連續的聚合反應，以每次循環增加2個碳鏈的頻率合成酰基碳鏈。而不斷增加的酰基碳鏈又與酰基載體蛋白(ACP)結合，ACP負責轉運脂肪酸合成途徑中的中間產物。經過數次聚合反應后，脂肪酸的合成在酰基-ACP硫酯酶或酰基轉移酶的作用下終止。終止聚合反應后，不同碳鏈長度的酰基ACP，在酰基輔酶A合成酶的作用下生成酰基輔酶A，并從質體轉運到內質網或胞質中。最后利用儲存在胞質中的酰基輔酶A，在內質網中通過3種不同的酰基轉移酶(甘油-3-磷酸酰基轉移酶GPAT、溶磷脂酸酰基轉移酶LPAAT、二酰甘油酰基轉移酶DGAT)。在甘油上附連脂肪酸以合成三酰甘油，并儲存在不連續分布的亞細胞器油體中。另外，脂肪酸合成后經過不同的修飾方式合成長鏈脂肪酸和多不飽和脂肪酸。植物的脂肪酸的合成發生在質體中，有乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)和脂肪酸合成酶(FAS)催化合成。植物FAS是一個由多個獨立蛋白構成的酶體系。其中酮酰-ACP合成酶III (KASIII)催化C4酰基的形成，C4 C16的聚合由酮酰-ACP合成酶I (KASI)催化，C16 C18最后2個碳的聚合由酮酰-ACP合成酶II (KASII)催化。植物TAG的合成主要在內質網上，由甘油-3-磷酸酰基轉移酶GPAT、溶磷脂酸酰基轉移酶LPAAT、二酰甘油酰基轉移酶DGAT催化合成。植物脂肪酸的修飾主要指脂肪酸的鏈延長延伸和脫飽和。脂肪酸每2個碳的延伸由4步催化完成，其中脂肪酸延伸酶(FAE)是脂肪酸眼神的第一關鍵限速酶。植物中飽和脂肪酸的主要成分是棕櫚酸(C16:0)。棕櫚酰ACP在脂肪酸代謝途徑中是一關鍵物，其碳鏈既能被KASII進一步延長，也可以在乙酰ACP硫酯酶(TE)作用下脫ACP形成棕櫚酸并轉化為貯存態油。植物不飽和脂肪酸的主要成分是油酸和亞油酸。油酸是硬脂酸脫飽和酶以硬脂酸為底物催化形成，發生在植物質體中，是植物不飽和脂肪酸合成的第一步。植物從油酸——亞油酸——亞麻酸的脫飽和在質體和內質網兩個細胞器中完成。在質體中分別由Ψ-6油酸脫飽和酶(FAD6)和Ψ-3油酸脫飽和酶(FAD7/FAD8)催化完成，在內質網中分別由Λ-12油酸脫飽和酶(FAD2)和Λ-15油酸脫飽和酶(FAD3)催化完成。目前隨著基因組測序技術、生物信息學的高速發展，全基因組關聯分析成為挖掘和剖析玉米油份相關基因及其遺傳基礎是最有效的方法之一。玉米遺傳學家在全基因水平上挖掘玉米油分相關基因，開發功能分子標記，加快高油玉米的定向遺傳改良。

發明內容
本發明的目的之一是通過以下技術方案來實現的AM508群體由473個普通玉米自交系和35個高油玉米自交系組成(所述的群體材料，均為常見的玉米市售材料，可通過常規商業渠道購買得到)。候選基因重測序材料 155份我國骨干自交系材料。從授粉15天后的AM508份自交系中隨機選擇368份自交系，構建200bp大小插入片段文庫，采用90bp末端配對的RNA測序技術進行轉錄組測序。每個個體的reads數為73. 8±0. 7百萬堿基，共產生了 2445. 9Gb的原始數據。全基因關聯分析以AM508群體為材料,利用Illumina MaizeSNP50BeadChip對56，110個位點進行了基因型檢測。從授粉15天后的508份材料中隨機選擇的368份材料則構建200bp大小插入片段文庫，采用90bp末端配對的RNA測序技術進行轉錄組測序，每個個體的reads數為73. 8±0. 7百萬堿基，共產生了 2445. 9Gb的原始序列。使用高質量的SNP，分別對這兩個群體采用線性混合模型校正群體層化效應和親緣關系后與油脂相關性狀進行了高密度標記的全基因組關聯分析。為了綜合這兩個群體的結果，本研究研究使用了統一的閾值篩選顯著性的位點(建議水平顯著性閾值為1/N =1. 78X IO-6以及5%基因組顯著性閾值為0. 05/N = 8. 94X10^)。為了在較多的顯著關聯信號中鑒定到唯一可能的因果突變基因，計算同一染色體上的顯著性信號位點間兩兩的連鎖不平衡，過濾掉r2小于O. 02的標記。在定位到的單一的顯著性信號中。利用368份材料關聯分析結果發現，其位于玉米基因組chr3. S_166664152的SNP位點，突變為C/G。其中C為主要等位基因，G為最小等位基因，最小等位基因頻率為O. 08，該位點與玉米油分含量顯著相關，解釋7. 43%的表型變異。
具體實施例方式AM508群體由473個普通玉米自交系和35個高油玉米自交系組成，已在參考文獻 Yang, X. H. et al. Characterization of a global germplasm collection and itspotential utilization for analysis of complex quantitative traits in maize. Mol.Breeding 121，417-431 公開過。候選基因重測序材料155份我國骨干自交系材料，已在參考文獻Yang，X. H. et al. Genetic analysis and characterization of a new maize associationmapping panel for quantitative trait loci dissection. Theor. Appl. Genet. 121，417-431 (2010a).公開過。轉錄組測序材料從授粉15天后的AM508份自交系中隨機選擇368份自交系，構建200bp大小插入片段文庫，采用90bp末端配對的RNA測序技術進行轉錄組測序。每個個體的reads數為73. 8±0. 7百萬堿基，共產生了 2445. 9Gb的原始數據。表型變異AM508群體包含508個自交系(其中包括35個高油品系)油含量相關的變異豐富，軟脂肪酸含量差異2. 3倍，硬脂肪酸含量差異達8倍。軟脂肪酸(16: 0，15. 7% )、硬脂肪酸(18:0,2. 1%)、油酸(18:1，28.0%)、亞麻油酸(18:2,51. 2% )和亞麻酸(18:3,1.4%)這五種脂肪酸占98. 4%的油含量。4個環境聯合檢測發現十個油份相關性狀的遺傳力均在90%以上。全基因關聯分析以AM508 群體為材料,利用 Illumina MaizeSNP50BeadChip 對 56，110 個位點進行了基因型檢測。從授粉15天后的508份材料中隨機選擇的368份材料則構建200bp大小插入片段文庫，采用90bp末端配對的RNA測序技術進行轉錄組測序，每個個體的reads數·為73. 8±0. 7百萬堿基，共產生了 2445. 9Gb的原始序列。研究使用了 106萬個高質量的SNP，分別對這兩個群體采用線性混合模型校正群體層化效應和親緣關系后與油脂相關性狀進行了高密度標記的全基因組關聯分析。為了綜合這兩個群體的結果，本研究研究使用了統一的閾值篩選顯著性的位點(建議水平顯著性閾值為1/N = 1.78X10-6以及5%基因組顯著性閾值為0. 05/N = 8. 94Χ1(Γ8)。為了在較多的顯著關聯信號中鑒定到唯一可能的因果突變基因，計算同一染色體上的顯著性信號位點間兩兩的連鎖不平衡，過濾掉r2小于O. 02的標記。在定位到的單一的顯著性信號中，有若干個位點位于或者臨近于(50Kb)被前人證實報道過的已知基因內，它們在本研究中再次得到了驗證。與已知的油脂代謝相關基因較遠的關聯位點很可能是與油脂代謝相關基因緊密連鎖，則距離最近的油脂代謝基因很可能就是本研究的候選基因。利用368份材料關聯分析結果發現，其位于玉米基因組chr3. S_166664152的SNP位點，突變為C/G。其中C為主要等位基因，G為最小等位基因，最小等位基因頻率為O. 08，該位點與玉米油分含量顯著相關，解釋7. 43%的表型變異，該位點與玉米三酰甘油酯酶(TAGL)基因緊密連鎖。
ΤΤ ~i~等位基因/最小
因^ 色位置b SNP性狀c等位基因頻率^%f P基因注釋J
體e
GRMZ,
油份Triglyceride lipases,
M2G17 3 166664152 chr3.S I66664152 . ^ C/G/0.08 7.43 4.61E-07F
6542_~_^_a表中給出的基因的名稱是所定位的顯著位點內的極可能相關的功能候選基因或者與最顯著關聯SNP (主效SNP)最近的已注釋基因。b主效SNP的位置根據玉米5a. 60版本的參考序列確定(www. maizesequence.org)c在檢測到的顯著的油脂相關性狀中最顯著相關的性狀。e主等位基因(第一個)，次等位基因以及次等位基因頻率f線性混合模型的計算過程使用tassel軟件完成
j 所有的候選基因基 于 Interproscan(http://www. eb1. ac. uk/interpro)所注釋的基因。
權利要求
1.一種玉米油份含量相關的SNP位點，其特征在于，所述的SNP位點與玉米油份含量相關，與玉米三酰甘油酯酶(TAGL)基因緊密連鎖，位于玉米參考基因組(誦.maizesequence. org, 5a. 60 版)chr3. S_166664152 上，該位點突變為 C/G。
2.如權利要求所述的SNP位點的應用，其特征在于包括以下步驟 a)由473個普通玉米自交系和35個高油玉米自交系組成AM508群體； b)從授粉15天后的AM508份自交系中隨機選擇368份自交系,構建200bp大小插入片段文庫，采用90bp末端配對的RNA測序技術進行轉錄組測序； c)利用3個群體進行連鎖分析高油玉米自交系By804與普通玉米自交系B73衍生的重組自交系，利用包含1536個SNP標記的GoldenGate芯片對家系及其親本進行基因型鑒定，利用Mapmaker3. 0軟件構建連鎖圖，采用復合區間作圖法進行QTL定位； d)結合F2、F2:3兩個世代群體油份含量的測定結果，利用軟件QTLcartographer V2. 5，采用復合區間作圖法篩選與油份含量緊密連鎖的QTL位點；篩選到在F2和F2:3兩個世代均能穩定表達的油份含量主效QTL。
3.如權利要求1或2所述的玉米油份含量相關的SNP位點在玉米育種的應用。
全文摘要
本發明涉及一種玉米油份含量相關的SNP位點及其應用，屬于植物分子育種領域。玉米參考基因組(www.maizesequence.org，5a.60版)位于chr3.S_166664152的SNP與玉米三酰甘油酯酶(TAGL)基因緊密連鎖，并且與玉米油份含量顯著相關。本發明的位點可用于高油玉米分子標記輔助育種，克服了常規育種周期長、后期篩選工作量大、對品種或品系進行鑒定的效率低等缺陷和不足。
文檔編號A01H1/04GK102994496SQ20121044467
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月9日 優先權日2012年11月9日
發明者嚴建兵, 楊小紅, 李建生, 李慧 申請人:華中農業大學