專利名稱：一種以葡萄糖為底物合成生松素的大腸桿菌工程菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種產生松素的大腸桿菌工程菌，是一種通過合成生物學和代謝工程手段過量表達由aroF、pheAfbl:、PAL、4CL、CHS、CHI、matB、matC等八個基因組成的合成途徑， 實現以葡萄糖為底物來生產生松素的大腸桿菌工程菌。
背景技術：
黃酮類化合物(flavonoids)是一類存在于自然界的、具有2_苯基色原酮結構的化合物，其羥基衍生物多具黃色，因而得名。黃酮類化合物具有多種生物活性，主要包括心血管系統、抗菌及抗病毒、抗腫瘤、抗氧化自由基、抗炎等，對鎮痛、保肝、抗突變、降血糖和止咳平喘等具有預防、治療或輔助治療效果，而且人體不能合成黃酮類化合物，只能從植物性食物中獲得，因此近年來，黃酮類化合物的市場每年增長30%以上，在藥品和營養化學品領域上具有廣闊的應用前景。
黃酮類化合物分布廣泛，種類繁多，黃酮類化合物主要包括黃酮類(如黃岑素、黃岑苷等)、黃酮醇類(如槲皮素、生松素等)、二氫黃酮類(如陳皮素、甘草苷等)、二氫黃酮醇類(如水飛薊素、異水飛薊素等)、異黃酮類(如大豆素、葛根素等)、二氫異黃酮類(如魚藤酮等)、查爾酮類(如異甘草素、補骨脂乙素等)、橙酮類(如金魚草素等)、黃烷類(如兒茶素等)、花色素類(如飛燕草素、矢車菊素等)和雙黃酮類(如銀杏素、異銀杏素等)。 而其中生松素是一種很重要的黃酮骨架物質，人們可以通過對生松素進行羥基化、還原化、 烷基化、氧化等修飾而獲得良姜素、黃烷酮醇、白楊黃素等眾多黃酮物質，另外生松素本身作為一種黃酮物質具有多種生物活性，主要包括緩解神經痛，防止腦水腫的發生，減少腦缺血的發生幾率等。
目前，工業上生產生松素主要采用植物提取和化學合成等方法，但是如何從植物復雜的提取液中得到所需要的高純度黃酮仍然是人類無法解決的一個技術難題，而高污染、使用有毒和有害化學試劑、以及黃酮物質的復雜結構等因素限制了化學法的使用，正因如此，微生物發酵法以使用廉價無污染的原料、較低的污染的排放、較低的能源需求等優點受到越來越多的關注。目前國內外關于微生物發酵法生產生松素的研究都需要在發酵液添加價格昂貴的前體物質如苯丙氨酸或者肉桂酸，而且從食品安全角度來考慮，由于肉桂酸是從脫胎于石油工業的化學合成法合成而來，因此肉桂酸的添加尤其得不到商業上的應用。另外目前的發酵法都采用的是兩步法生產，即菌株首先在營養豐富的培養基中生長，在達到一定菌濃的時候，通過離心等方法收集所有的菌體置于基本培養基中發酵，顯然這種發酵方式無法應用于大規模工業化。發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種以葡萄糖為底物直接合成生松素的基因工程菌株，無需添加貴重的前體物質，只在單一培養基中便能合成生松素的大腸桿菌工程菌，通過在菌株體內構建從葡萄糖到生松素的由aroF、PheAfbr, PAL、4CL、CHS、CHI、matB、matC 等八基因構成的合成途徑，實現以葡萄糖為底物來合成黃酮骨架物質生松素。
以下是本發明技術方案的詳細描述。
途徑基因的選擇
以葡萄糖為底物的L-Phe生物合成途徑由磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和4_磷酸赤蘚糖(E4P)在3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶(DAHP synthases, DS)的催化下縮合生成3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸(DAHP)的反應為第一個限速反應。第二和第三個限速反應分別為由分支酸在分支酸變位酶(Chorismate mutase, CM)的作用下轉變為預苯酸，繼而在預苯酸脫水酶(Prephenate dehydratase, PDT)的作用下脫水、脫羧后形成PPA。CM和PDT是由pheA基因編碼的雙功能酶。因此過量表達pheA和aroF這兩個基因。
盡管苯丙氨酸脫氨酶(PAL)分布很廣，但是只有R. glutinis用來做商業用途，同時R. glutinis對苯丙氨酸的催化活性也比其他種類要高，在深紅類酵母中，又以 R. glutinis活性為最高，同時它對酪氨酸的催化活性也很高。在最近的研究中，已經有人用 P. crispurn的4-香桂酸輔酶A連接酶(4CL)、P. hybrida的查爾酮合成酶(CHS)、M. sativa 的CHI的組合來獲得各種非天然的黃酮類骨架物質，并且獲得了很高的產量。因此選擇深紅酵母(Rhodo torula glu tinis)的 PAL、香芳:菜(Petroselinum crispurn)的 4CL、矮牽牛(Petunia Xhybrida)的 CHS (AF233638)、紫苜猜(Medicago sativa)的查爾酮異構酶 (CHI) (M91079)。大腸桿菌細胞內的丙二酰輔酶A分子為途徑中的限制性前體分子。通過丙二酰輔酶A合成酶可以直接將丙二酰和輔酶A轉化為丙二酰輔酶A，這時可以通過過量表達matB和matC基因來提高產量。但是前一種代謝途徑因為要添加生物素，對大規模生產化不利，因此選用后種代謝途徑優化。
途徑基因的合成與表達載體的構建
根據NCBI 網站上根據 Genbank NC000913. 2，GQ303716, AAC83455, AAC83457, DQ013364，X13325，AF233638，M91079，采用全基因合成方法獲得途徑所需要的八個基因，同時分別將 aroF、pheAfbr 克隆于 pRSFDuet-1，PAL、4CL 克隆于質粒 pETDuet-1，CHS、 CHI 克隆于 pCDFDuet-1，matB、matC 克隆于 pACYCDuet-1，從而構建 pRSFD-pheA-aroF， pET-RgPAL-Pc4CL、pCDF-PhCHS-MsCHI，pACYCD-matBiatC 四個共表達質粒。重組質粒經酶切分析，并進行DNA測序。基因測序結果與預期一致，表明重組質粒構建正確。
含有合成途徑的Escherichia coli (BL21)重組菌的篩選
將四個共表達質粒以化學法轉化Escherichia coli (BL21)感受態細胞。挑選能在含有100ug/mL的氨節，50ug/mL的卡那霉素,35ug/mL的氯霉素，50ug/mL的鏈霉素等四種抗生素的LB平板上生長的菌落，使其在含上述的四種抗生素的LB平板上連續轉接三代，得到遺傳穩定的重組子。挑取陽性重組子，進行PCR驗證，可分別得到大約I.5bp, I. 2bp, 2. lbp, I. 7bp, I. 5bp, O. 9bp, I. 5bp, I. 3bp,表明八個途徑基因已成功轉入到 Escherichiacoli (BL21)中。
微生物菌株的培養與發酵
MOPS培養基(g/L):葡萄糖5g,氯化銨4g,磷酸氫二鉀O. 3g,丙二酸2g, M0PS83. 7g, N-{三(羧甲基)甲基}甘氨酸7. 1668g，氯化銨5. lg，硫酸鐵O. 03g，硫酸鉀O.5g,氯化鎂 I. lg，氯化鈉 29. 2g, trace element fromATCClOml,自來水定容至 1L。MOPS培養基的滅菌溫度為115-121 °C，15min。維生素等熱敏性材料配制后
O.22 um膜過濾除菌，接種前加入。將實驗菌株接種到MOPS培養基中，500mL搖瓶裝液25mL，于37°C、250rpm條件下培養12-20h至菌株OD6tltl達到I. 0-2. O ;然后再加入25ml相同的MOPS培養基，30°C，250rpm條件下培養60h。生松素濃度的測定高效液相色譜(HPLC)儀器=AgilentllOO高效液相色譜儀(配紫外可見檢測器、示差折光檢測器和工作站)，色譜條件色譜柱AminexHPX-87H ion exchange column流動相5mMH2SO4流速0.6mL/min柱溫35°C進樣量5μ L紫外檢測器波長210nm樣品制備500 μ L發酵液在10，OOOrpm下離心lOmin，取上清液移入I. 5mL離心管
中測生松素的含量。取100 μ L上清液移入5mL容量瓶中，超純水定容至刻度線，經0. 45 μ m濾膜過濾，濾液供液相色譜分析。本發明的有益效果本發明的特點是以一株Escherichia coli (BL21)為出發菌株，利用合成生物學和代謝工程手段在菌株體內構建了一條從葡萄糖到生松素的由aroF、pheAftr> TAL、4CL、CHS、CHI、matB、matC 等八基因構成的合成途徑。重組菌 Escherichiacoli (BL21)在以葡萄糖為唯一碳源，發酵60h后，生松素的產量達到21mg/L，成功實現了以葡萄糖為底物來合成黃酮骨架物質生松素。為今后微生物法生產黃酮類物質提供了一定的借鑒意義。
具體實施例方式實施例I途徑基因的選擇以葡萄糖為底物的L-Phe生物合成途徑由磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和4_磷酸赤蘚糖(E4P)在3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶(DAHP synthases, DS)的催化下縮合生成3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸(DAHP)的反應為第一個限速反應。DS是分別由aroF、aroG和aroH基因所編碼的三種同功酶,酶活組成比例為aroF : aroG : aroH =80 I 20。三種同功酶(aroF、aroG和aroH)的表達和酶活性分別受到產物L-Tyr、L-Phe和L-Trp的反饋阻遏和反饋抑制。第二和第三個限速反應分別為由分支酸在分支酸變位酶(Chorismate mutase, CM)的作用下轉變為預苯酸，繼而在預苯酸脫水酶(Prephenatedehydratase, PDT)的作用下脫水、脫羧后形成PPA。CM和PDT是由pheA基因編碼的雙功能酶。因此過量表達pheA和aroF這兩個基因。 苯丙氨酸脫氨酶(PAL)廣泛存在于高等植物、真菌、酵母以及一種原核生物鏈霉菌，人類至今還沒在真細菌或者動物組織中發現該酶。盡管PAL分布很廣，但是只有R. glutinis用來做商業用途，同時R. glutinis對苯丙氨酸的催化活性也比其他種類要高，在深紅類酵母中，又以R. glutinis活性為最高，同時它對酪氨酸的催化活性也很高。在最近的研究中，已經有人用P. crispurn的4CL、P. hybrida的CHS、Mlsativa的CHI的組合來獲得各種非天然的黃酮類骨架物質，并且獲得了很高的產量。因此選擇深紅酵母(Rhodotorula glutinis)的PAL、香芳:菜(Petroselinum crispurn)的4CL、矮牽牛(PetuniaXhybrida)的 CHS (AF233638)、紫苜蓿(Medicago sativa)的 CHI (M91079)。天然產物生產平臺的發展通常受到前體物質或者輔助因子的限制，因為宿主菌中這些物質的量通常都不能滿足大規模工業化生產的要求。在形成黃酮類骨架物質時，每生成一個分子的骨架物質需要3mol的丙二酰輔酶A。而大腸桿菌在補充了葡萄糖的培養基指數生長時，其中乙酰輔酶A是輔酶A代謝池中主要組分，丙二酰輔酶A只占其中很少的一部分。因此源于大腸桿菌細胞內的丙二酰輔酶A分子成為限制性前體分子。丙二酰輔酶A的生成途徑有兩種，一種是乙酰輔酶A在乙酰輔酶A羧化酶(ACC)的作用下轉化為丙二酰輔酶A，因此可以通過共表達ACC基因、生物素連接酶基因(birA)以及乙酰輔酶A合成酶(ACS)來提高產量；另一種是通過丙二酰輔酶A合成酶直接將丙二酰和輔酶A轉化為丙二酰輔酶A，這時可以通過過量表達丙二酸轉運的基因(matb)和丙二酸吸收途徑的基因(matC)基因來提高產量。但是前一種代謝途徑因為要添加生物素，對大規模生產化不利，因此選用后種代謝途徑優化。實施例2途徑基因的合成與表達載體的構建根據NCBI 網站上根據 Genbank NC000913. 2，GQ303716, AAC83455, AAC83457,DQ013364，X13325，AF233638，M91079,采用全基因合成方法獲得途徑所需要的八個基因，大小分別為 I. 5bp, I. 2bp, 2. lbp, I. 7bp, I. 5bp, O. 9bp, I. 5bp, I. 3bp。分別利用酶切連接技術將aroF，PheAfto基因與經EcoRI和HindIII，NdeI，KpnI酶切后的質粒pRSFDuet-1 (Novagen :71363)連接，將 PAL，4CL 基因與經 NcoI 和 HindIII, NdeI 和 BlnI·酶切后的質粒 pETDuet-1 (Novagen :71353)連接，將 CHS，CHI 基因與經 NcoI 和 HindIII，NdeI和BlnI酶切后的質粒pCDFDuet-1 (Novagen :71330)連接，將matB和matC基因與經過 EcoRI 和 HindIII, NdeI 和 KpnI 酶切后的質粒 pACYCDuet-1 (Novagen :71430)連接，由此得到四個共表達質粒 pRSFD-pheA-aroF，pET-RgPAL_Pc4CL、pCDF-PhCHS-MsCHI，pACY⑶-matB-matC。構建好的重組質粒經酶切分析，并進行DNA測序。基因測序結果與預期一致，表明重組質粒構建正確。將四個共表達質粒以化學法轉化Escherichiacoli (BL21)感受態細胞。挑選能在含有100ug/mL的氨芐，50ug/mL的卡那霉素，35ug/mL的氯霉素，50ug/mL的鏈霉素等四種抗生素LB平板上生長的菌落，使其在含上述的四種抗生素的LB平板上連續轉接三代，得到遺傳穩定的重組子。挑取陽性重組子，測序驗證結果，表明八個途徑基因已成功轉入到Escherichiacoli (BL21)中。其中LB 培養基(g/L)氯化鈉10g, TryptonelOg, Yeast extract5g,固體培養基添加 20g 瓊脂。LB+氨芐、卡那霉素、氯霉素、鏈霉素的抗性平板(g/L)LB+100mg氨節、50mg卡那霉素、35mg氯霉素、50mg鏈霉素，固體培養基添加20g瓊月旨。實施例3發酵生產生松素的方法采用所述大腸桿菌工程菌為出發菌株，接種到MOPS培養基中，500mL搖瓶裝液25mL，于37°C、250rpm條件下培養12_20h至菌株OD6tltl達到I. 0-2. O ;然后再加入25ml相同的MOPS培養基和終濃度為ImM的IPTG，，30°C，250rpm條件下培養60h。重組菌與對照菌相比較，對照菌中沒有檢測出生松素的產量，而重組菌中生松素 的產量達到21mg/L。
權利要求
1.一種以葡萄糖為底物合成生松素的大腸桿菌工程菌，其特征在于表達生松素合成途徑中的需要的關鍵酶系，所述酶系為3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶，分支酸變位酶，預苯酸脫水酶，苯丙氨酸脫氨酶，4-香桂酸輔酶A連接酶，查爾酮合成酶，查爾酮異構酶，丙二酸轉運酶以及丙二酸吸收酶。
2.權利要求I所述的大腸桿菌工程菌，其特征在于所述3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶基因核苷酸序列如Genbank NC000913. 2所示，所述分支酸變位酶和預苯酸脫水酶的基因核苷酸序列如Genbank :GQ303716，所述丙二酸轉運的基因核苷酸序列如Genbank AAC83455,所述丙二酸吸收酶的基因核苷酸序列如Genbank AAC83457,所述苯丙氨酸脫氨酶的基因核苷酸序列如Genbank DQ013364,所述4-香桂酸輔酶A連接酶的基因核苷酸序列如Genbank :X13325,所述查爾酮合成酶的基因核苷酸序列如Genbank AF233638，所述查爾酮異構酶的基因核苷酸序列如Genbank :M91079。
3.權利要求I或2所述工程菌的構建方法，其特征在于根據GenbankNC000913. 2， GQ303716, AAC83455, AAC83457, DQ013364, X13325, AF233638, M91079，分別采用化學全合成方法獲得途徑所需要的基因，克隆到表達載體后分別轉化大腸桿菌Escherichia coli (BL21)后得到所述基因工程菌。
4.權利要求I所述工程菌應用于生松素的生產，其特征在于以權利要求I所述工程菌為出發菌株，接種到MOPS培養基中，500mL搖瓶裝液25mL，于37°C、250rpm條件下培養 12-20h至菌株OD6tltl達到I. 0-2. O ;然后加入25ml相同的MOPS培養基，加入IPTG、調節濃度為ImM，30°C，250rpm條件下繼續培養60h。
5.根據權利要求書4所述的方法，其特征在于MOPS培養基組成為(g/L):葡萄糖5g，氯化銨4g，磷酸氫二鉀O. 3g，丙二酸2g，M0PS83. 7g，N_{三(羧甲基)甲基}甘氨酸7. 1668g， 氯化銨5. lg，硫酸鐵O. 03g，硫酸鉀O. 5g，氯化鎂I. lg，氯化鈉29. 2g，微量元素10ml，自來水定容至1L。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述微量元素采用ATCCBAA-2326的配方。
全文摘要
本發明公開了一種從葡萄糖合成生松素的大腸桿菌工程菌及其應用，屬于遺傳工程或代謝工程領域。本發明采用合成生物學和代謝工程的手段，分別合成松素代謝中的八個基因組成的合成途徑引入大腸桿菌Escherichia coli(BL21)，從而獲得了一株能以葡萄糖為底物合成黃酮骨架物質生松素的重組菌，其在搖瓶中以葡萄糖為唯一底物發酵60h后，生松素的產量達到21mg/L。本發明利用合成生物學的方法，在大腸桿菌體內成功構建八基因組成的合成途徑，成功實現了從葡萄糖合成生松素。為今后微生物法生產黃酮類物質提供了一定的借鑒意義。
文檔編號C12P17/06GK102936577SQ20121045416
公開日2013年2月20日 申請日期2012年11月14日 優先權日2012年11月14日
發明者陳堅, 周景文, 吳俊俊, 堵國成 申請人:江南大學