過氧化氫抑制igf-1促存活功能的體外研究的制作方法
【專利摘要】本發明屬于醫藥【技術領域】，本發明公開了過氧化氫對IGF-1促存活功能的抑制作用，以PC12細胞(大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞)為研究對象，以剝奪血清作為模型，IGF-1（胰島素樣生長因子-1）用于保護PC12免受剝奪血清造成的損傷，促進PC12細胞存活。而IGF-1處理前預先加入不同濃度的H2O2（過氧化氫），MTT（噻唑藍法）檢測細胞存活力，結果顯示剝奪血清可以明顯的降低細胞的存活能力，而IGF-1可以劑量依賴性的保護PC12細胞對抗剝奪血清帶來的損傷，而H2O2可以劑量依賴性的抑制IGF-1的這種促存活功能。
【專利說明】過氧化氫抑制IGF-1促存活功能的體外研究
【技術領域】
[0001]本發明屬于醫藥【技術領域】，涉及一種過氧化氫抑制PC12細胞活力的可能機制，即抑制了 IGF-1的促存活功能。
【背景技術】
[0002]需氧細胞在代謝過程中會產生一系列活性氧簇(reactive oxygen species,R0S)，包括超氧陰離子[.02_]、過氧化氫[H2O2]以及羥自由基[.0Η]等，它們的性質極其活躍，會嚴重地損害生物膜、酶類、蛋白質和核酸等生物大分子，已有的研究表明腫瘤、衰老、心腦血管等許多疾病的發生與ROS的存在有著密切聯系。隨著自由基生物學研究的發展，人們逐漸認識到ROS可以雙向調控某些腫瘤細胞的凋亡與增殖，并發現了活性氧自由基與細胞信號轉導之間的內在關聯。最新研究發現，低濃度的活性氧自由基能夠影響一系列信號轉導途徑。機體內的活性氧自由基通過其濃度調節著機體細胞的生死平衡，除了引起細胞凋亡、壞死的功能外，低濃度的ROS更廣泛的生理意義在于其對轉錄因子的激活以及對細胞增殖、分化的促進。
[0003]胰島素樣生長因子-1(Insulin-like Growth Factor-1, IGF-1)是一種在肝臟合成的營養因子，其生物學功能廣泛，在中樞神經系統具有促進神經細胞增殖、分化，促進神經元存活的功能，而這些生物學功能都依賴其高親和力受體IGF-1R來發揮。IGF-1R敲除的轉基因小鼠較正常小鼠體重減少約45%，在出生后死于多器官的發育異常，其中神經系統發育缺陷是導致轉基因小鼠死亡的重要原因，這顯示出IGF-1在中樞神經系統中的重要作用。促神經元存活是IGF-1在中樞神經系統最重要的生物學功能之一，國外許多研究已表明IGF-1能夠對抗多種原因導致的細胞損傷，如血清剝奪導致的神經元凋亡，6-羥基多巴胺引起的神經毒性，低鉀誘導的凋亡，腦缺血以及谷氨酸的神經興奮性毒性等。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在于探討過氧化氫對IGF-1促存活功能的作用，提供一種過氧化氫降低PC12細胞存活、誘導細胞凋亡的可能機制。以PC12細胞(大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞)為研究對象，以剝奪血清作為模型，IGF-1 (胰島素樣生長因子-1)用于保護PC12免受剝奪血清造成的損傷，促進PC12細胞存活。而給予IGF-1處理前預先加入不同濃度的H2O2(過氧化氫)，MTT (噻唑藍法)檢測細胞存活力，結果顯示剝奪血清可以明顯的降低細胞的存活能力，而IGF-1可以劑量依賴性的保護PC12細胞對抗剝奪血清帶來的損傷，而H2O2可以劑量依賴性的抑制IGF-1的這種促存活功能。
【具體實施方式】
[0005]本發明具體的操作步`驟如下:
1、細胞的培養 PC12細胞來源大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤，廣泛用于神經系統疾病的體外研究，培養于含有5%FBS、5%HS、1%PSA的DMEM培養基中，于37°C、5%C02條件下培養，待細胞長滿后，用含1%FBS、1%PSA的DMEM培養基接種于96孔和24小時后對細胞進行處理。
[0006]2、細胞處理處理前先將細胞換液成純DMEM lhour，然后正常組換成DMEM+1.5%FBS,剝奪血清模型組采用純DMEM，IGF-1給藥組給予(2.5ng/ml、25.0ng/ml,50.0ng/ml、100.0ng/ml)IGF-1，繼續培養24小時后MTT法檢測細胞活力 '考察H2O2對IGF-1促存活功能的作用是先用不同濃度(10 μ M，30 μ M，100 μ M，200 μ M，400 μ M)的H2O2預處理細胞I小時，再加入IGF-1處理。[0007]3、ΜΤΤ檢測細胞活力將細胞以0.5 X105/ml接種于96孔培養板，100 μ I/孔，在37 V 5% CO2條件下培養過夜后，按分組要求給以不同處理因素，每組設8個平行復孔。培養24 h后，每孔加入終濃度為0.5 mg/ml的MTT 100 μ I，再培養5 h，傾去培養液，加DMSO 100 μ I/孔，待甲瓚結晶完全溶解后，用酶聯免疫儀在波長570nm處讀取每孔吸光度(A)。取8孔A值的均數按公式計算細胞存活率=(試驗孔A均值/對照孔A均值)X100 %。重復3次。
【權利要求】
1.過氧化氫抑制IGF-I促存活功能的體外研究，其特征在于以PC12細胞（大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞）為研究對象，以剝奪血清作為模型，考察IGF-I (胰島素樣生長因子-I)對PC12細胞的促存活功能，不同濃度過氧化氫預處理研究其對IGF-I促存活功能的抑制作用。
2.根據權利要求1所述的體外研究，其特征在于研究對象為PC12細胞，MTT法檢測細胞存活力的細胞密度為5000-8000/孔，正常組為DMEM(基礎培養基）+1. 5% FBS (胎牛血清)，剝奪血清組為等量的DMEM, IGF-I給藥組為12. 5ng/ml、25. 0ng/ml、50.0ng/ml、100.0ng/ml的IGF-1+DMEM，給藥后于溫度為37°C、相對濕度為95%的CO2培養箱中繼續培養24小時。
3.根據權利要求1所述的體外研究，其特征在于考察過氧化氫對IGF-I促存活功能的作用時不同濃度的H2O2 (ΙΟμΜ, 30μΜ，100 μ Μ，200 μ Μ，400 μ Μ)預處理細胞I小時，然后再加入IGF-I，繼續培養24小時后MTT法檢測細胞活力。
4.根據權利要求2、3所述的體外研究方法，其特征在于用于細胞培養的基礎培養基配制方法為：將一袋高糖型DMEM粉末溶于500~800 mL的超純水，另加入5. 95 g HEPES和 ，3.7 g NaHCO3,磁力攪拌使干粉完全溶解，定容至1000 mL,調節pH值至7. 2~7. 4，無菌條件下用孔徑為O. 22 μ m的微孔濾膜過濾除菌后分裝，于4 °C冰箱內放置儲存。
5.根據權利要求2、3所述的體外研究方法，其特征在于用于檢測細胞活力的MTT法配制方法如下：無菌條件下稱取一定量的MTT粉末，PBS溶解至濃度為5 mg/mL，分裝置-80 V存儲備用，使用前用DMEM稀釋到O. 5 mg/mL。
【文檔編號】C12Q1/02GK103834714SQ201210474838
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年11月21日 優先權日:2012年11月21日
【發明者】郝智慧, 王德軍, 呂海鸞 申請人:青島康地恩動物藥業有限公司