一種大麥蛋白HvMYB6及其編碼基因與應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種大麥蛋白HvMYB6及其編碼基因與應用。本發明提供的一種蛋白，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；（b）將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與抗病相關或具有轉錄激活活性的由序列2衍生的蛋白質。本發明的實驗證明，本發明發現了一種蛋白HvMYB6，將其瞬時表達，發現其可以抗大麥白粉菌生理小種K1或A6引起的病害，進一步研究發現該蛋白還具有轉錄激活活性，其可以作為轉錄激活因子。上述研究表明，該蛋白可以為培育具有抗病性的轉基因植物的研究奠定基礎。
【專利說明】—種大麥蛋白HvMYB6及其編碼基因與應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一種大麥蛋白HvMYB6及其編碼基因與應用。【背景技術】
[0002]大麥白粉病(Powdery mildew)是大麥主要病害之一，發生在潮濕和半潮濕地區，分布于世界各產麥國。在歐洲是最普遍的破壞性病害，大流行年份可造成減產25%~30%。在日本及北美的東部和南部地區、中國的貴州、四川及東南沿海麥區普遍發生，可造成20%以上的產量損失。在福建則是大麥主要病害。該病可侵害大麥植株地上部各器官，但以葉片和葉鞘為主，發病重時穎殼和芒也可受害。由于大麥白粉病菌具有群體大、適應范圍廣、生理小種眾多，且變異速度快，使得許多有效抗病基因喪失抗性。目前育種工作者一直以選育和推廣抗病品種作為病害的主要防治手段，多年來頗見成效，但抗性喪失一直是未能解決的問題，抗源多樣化是實現抗病性持久的有效途徑。為此通過生物學的方法克隆新的抗病基因，利用轉基因的方法提高大麥對白粉病的抗性是今后防治白粉病的有效策略之一。

【發明內容】

[0003]本發明的一個目的是提供一種大麥蛋白HvMYB6及其編碼基因。
[0004]本發明提供的蛋白，是如下(a)或(b):
[0005](a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0006](b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與抗 病相關或具有轉錄激活活性的由序列2衍生的蛋白質。
[0007]上述(a)或(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(b)中的蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列I所示的DNA序列缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表2所示的標簽的編碼序列得到。
[0008]上述蛋白的氨基酸序列中一個或幾個氨基酸殘基的取代、替換和/或添加，有的是由于自然發生的變異引起的，有的是由人工誘變處理引起的。
[0009]編碼上述蛋白的基因也是本發明保護的范圍。
[0010]上述基因為如下I) -3)中任意一種的DNA分子:
[0011]I)序列表中序列I所示的DNA分子；
[0012]2)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼與抗病相關或具有轉錄激活活性蛋白的DNA分子；
[0013]3)與I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與抗病相關或具有轉錄激活活性蛋白的DNA分子。
[0014]上述嚴格條件為:在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65° C下雜交，然后用
2X SSC, 0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。[0015]含有上述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也是本發明保護的范圍；其中，重組載體可以為將序列表中的序列I插入pUB1-Adaptor-NOS載體中得到的載體；也可以為將序列表中的序列I插入35S-BD載體的EcoR I與Sal I酶切位點間得到的載體。
[0016]擴增上述基因全長或其任意片段的引物對也是本發明保護的范圍；上述引物對可以是由序列表中的序列3所示的DNA分子和序列表中的序列4所示的DNA分子組成。
[0017]上述蛋白、上述基因或上述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在抗病或使植物抗病中的應用也是本發明保護的范圍。
[0018]上述蛋白、上述基因或上述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在培育具有抗病性的轉基因植物中的應用也是本發明保護的范圍。[0019]在上述應用中，所述抗病為抗白粉病；所述白粉病具體為大麥白粉病(Blumeriagraminis f.sp.tritici);上述大麥白粉病菌具體為大麥白粉菌生理小種Kl或A6 ；
[0020]上述植物為雙子葉植物或單子葉植物；其中單子葉植物具體為大麥；本發明的實施例中的大麥品種為Pallas (不含任何Mia)、POl (含Mlal)、P03 (含Mla6)或P09 (含MlalO)。
[0021]上述蛋白在作為轉錄激活因子中的應用也是本發明保護的范圍。
[0022]上述蛋白作為轉錄激活因子體現在激活基因表達；本發明的實施例中基因為報告基因LUC。
[0023]本發明的實驗證明，本發明發現了一種蛋白HvMYB6，將其瞬時表達，發現其可以抗大麥白粉菌生理小種Kl或A6引起的病害，進一步研究發現該蛋白還具有轉錄激活活性，其可以作為轉錄激活因子。上述研究表明，該蛋白可以為培育具有抗病性的轉基因植物的研
究奠定基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為大麥表皮細胞過表達HvMYB6的表型圖
[0025]圖2為HvMYB6轉錄激活報告基因表達結果圖
[0026]圖3為HvMYB6定位于細胞核內的結果圖
[0027]圖4為HvMYB6受大麥白粉菌誘導的表達圖
【具體實施方式】
[0028]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0029]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0030]下述實施例中的部分材料如下(請核實提供文獻的生物材料的名稱在專利和文章中一致):
[0031]大麥Pallas 記載在 Nuclear activity of MLA immune receptorslinksisolate—specific and basal disease-resistance responses.Science315，1098 - 1103，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得；
[0032]大麥POl 記載在 Nuclear activity of MLA immune receptorslinksisolate—specific and basal disease-resistance responses.Science315，1098 - 1103，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得；
[0033]大麥P03 記載在 Nuclear activity of MLA immune receptorslinksisolate—specific and basal disease-resistance responses.Science315，1098 - 1103，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得；
[0034]大麥P09 記載在 Nuclear activity of MLA immune receptorslinksisolate—specific and basal disease-resistance responses.Science315，1098 - 1103，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得；
[0035]Columbia 型擬南芥(col-Ο)記載在 Molecular characterization ofthesubmergence response of the Arabidopsis thaliana ecotype Columbia.NewPhytologist.2011，190:457 - 471，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得;
[0036]大麥白粉菌生理小種Kl 記載在 Recognition Specificity and RARl/SGTlDependence in Barley Mla Disease Resistance Genes to the Powdery MildewFungus.Plant Cell, 2003, 15:732-744，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得;
[0037]大麥白粉菌生理小種A6 (Blumeria graminis f.sp.Hordei)記載在RecognitionSpecificity and RAR1/SGT1 Dependence in Barley Mla DiseaseResistance Genesto the Powdery Mildew Fungus.Plant Cell，2003，15:732-744，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得；
[0038]質粒pUbiGUS 記載在 A Transient Assay System for the FunctionalAssessmentof Defense-Related Genes in Wheat.MPMI，1999，12:647 - 654，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得；
[0039]pUB1-Adaptor-NOS 記載在 Recognition Specificity and RAR1/SGT1Dependencein Barley Mla Disease Resistance Genes to the Powdery Mildew Fungus.Plant Cell，2003，15:732-744，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得；
[0040]35S-BD 載體記載在 Soybean GmPHD-type transcription regulatorsimprovestress tolerance in transgenic Arabidopsis plants.PLoSONE, 2009，4(9): e7209，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得；
[0041]35S-BD-VP16 記載在 Soybean GmPHD-type transcription regulatorsimprovestress tolerance in transgenic Arabidopsis plants.PLoSONE, 2009，4(9): e7209，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得；
[0042]5XGAL4-LUC 記載在 Soybean GmPHD-type transcription regulatorsimprovestress tolerance in transgenic Arabidopsis plants.PLoSONE, 2009，4(9): e7209，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得；
[0043]Pptrl 記載在 Soybean GmPHD-type transcription regulators improvestresstolerance in transgenic Arabidopsis plants.PLoS ONE，2009，4 (9): e7209，公眾可從中國科學院遺傳與發育 生物學研究所獲得；
[0044]pUB1-Gateway-eYFP 載體記載在 The CC-NB-LRR-type Rdg2a resistancegeneconfers immunity to the seed-borne balrey leaf stripe pathogen in theabsenceof hypersensitive cell death.PLoS One, 2010，5:el2599,公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得。
[0045]PUB1-CFP-HvffRKY2 載體記載在 Nuclear activity of MLA immune receptorslinksisolate—specific and basal disease-resistance responses.Science315，1098 - 1103，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得。
[0046]實施例1、HvMYB6基因的獲得
[0047]1、RNA 的獲得
[0048]大麥品種POl的7天幼苗接種大麥白粉菌生理小種Kl，24小時后取材,提RNA。
[0049]2、反轉錄獲得cDNA
[0050]I)反轉錄體系及過程
[0051]RNA2.5ul
[0052]01igo-dT Iul
[0053]DEPC-H2O 6.5ul
[0054]離心管混合上述溶液，700C 5分鐘，冰上再放置5分鐘。
[0055]
【權利要求】
1.一種蛋白，是如下（a)或（b): Ca)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與抗病相關或具有轉錄激活活性的由序列2衍生的蛋白質。
2.編碼權利要求1所述蛋白的基因。
3.如權利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因為如下I)-3)中任意一種的DNA分子： 1)序列表中序列I所不的DNA分子； 2)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼與抗病相關或具有轉錄激活活性蛋白的DNA分子； 3)與I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與抗病相關或具有轉錄激活活性蛋白的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌； 所述重組載體具體為將權利要求2或3所述基因插入表達載體中，得到表達權利要求I所述蛋白的重組載體。
5.擴增權利要求2或3所述基因全長或其任意片段的引物對。
6.權利要求1所述蛋白、權利要求2或3所述基因或權利要求4所述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在抗病或使植物抗病中的應用。
7.權利要求1所述蛋白、權利要求2或3所述基因或權利要求4所述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在培育具有抗病性的轉基因植物中的應用。
8.根據權利要求6或7所述的應用，其特征在于：所述抗病為抗白粉病； 所述白粉病具體為大麥白粉病。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于： 所述大麥白粉病的病原菌為大麥白粉病菌（Blumeria grminis f. sp. tritici);所述大麥白粉病菌具體為大麥白粉菌生理小種Kl或A6 ; 所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述單子葉植物具體為大麥。
10.權利要求1所述蛋白在作為轉錄激活因子中的應用。
【文檔編號】C12N15/63GK103833836SQ201210477927
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年11月22日 優先權日:2012年11月22日
【發明者】常誠, 荊邵娟, 沈前華 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所