專利名稱：一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)全維生素礦物質(zhì)口服液的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種保健口服液的制備，尤其涉及一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)全維生素礦物質(zhì)口服液的方法。
背景技術(shù)：
“善存”是美國一種保健品”Centrum”的中文音譯。這種保健品的主要成分是人體必需的礦物質(zhì)(按量的大小可分為常量元素、半微量元素和微量元素)和維生素。它的第一個特點是成分很全，一般含有30-40種成分，差不多涵蓋了人體所需要的全部礦物質(zhì)和維生素。第二個特點是品種很全，從幼兒到老年各種年齡段使用的產(chǎn)品都有，而且還分性別，不同產(chǎn)品在成分和用量上都有些差別。以50歲以上老年人使用的為例，分為“50以上男性用”和“50以上女性用”兩種，女性用品的補鈣量是男性的兩倍，這是考慮到老年婦女骨質(zhì) 疏松較為普遍的特點而設計的。兒童用品和老人用品在成分和含量上差別更明顯。美國、澳大利亞等國此類產(chǎn)品很多，其中以“Centrum”最為著名，年銷量也最大。我國臺灣地區(qū)人們保健意識比較強，幾乎人人吃“Centrum”。大陸經(jīng)濟連續(xù)騰飛，購買美國“Centrum”的也越來越多。我國類似產(chǎn)品也早已問世，比較著名的有“黃金搭檔”、“21金維它”等。至于像“藍瓶的”葡萄糖酸鋅等產(chǎn)品只是補充個別成分，針對的人群數(shù)量太少，不能和Centrum這樣的全營養(yǎng)素相提并論。但是Centrum也有其缺點。眾所周知，上述所有產(chǎn)品，不管它是以膠囊形式出現(xiàn)，還是以片劑形式上市，其實都是無機鹽和維生素的直接混合物。稍懂一點化學知識的人都知道，幾十種無機鹽和維生素混合在一起，肯定會起多種復雜的化學反應，這些反應的產(chǎn)物有些是有害的，有些則降低了某些成分的水溶性即降低它的被吸收率。另一個問題是可能會產(chǎn)生拮抗作用。所謂拮抗，在這里可簡單理解為抵消，如含量多的元素(常量元素)可能擠掉含量低的元素(微量元素)在腸內(nèi)壁的吸收位點，使含量本來就很低的元素反而不被吸收，這是一種拮抗。被擠掉的這些微量元素往往對人體特別重要。另一種拮抗現(xiàn)象，譬如某些金屬元素可能影響某些維生素作用的發(fā)揮，使維生素減效或失效。這在生物化學上也是常見的現(xiàn)象。歸根到底，因為直接混合物成分太多太復雜，有害副作用的產(chǎn)生是不可避免的，而且很難預料和很難徹底搞清楚。有的生物化學家反對補充像“Centrum”這樣的直接混合物保健品，也都是出于以上考慮。他們提倡用食品補充，因為食品中的礦物質(zhì)和維生素都是有機態(tài)的，即都是和蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物等有機大分子結(jié)合在一起的，不是游離狀態(tài)的，相互之間不會拮抗和競爭。綜上，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)全維生素礦物質(zhì)口服液的方法迄今未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)全維生素礦物質(zhì)口服液的方法。本發(fā)明所述微生物發(fā)酵法生產(chǎn)全維生素礦物質(zhì)口服液的方法，步驟是(I)選擇藥用和食用蕈類、國標中允許使用的益生菌菌種；(2)利用微生物富集轉(zhuǎn)化礦物質(zhì)，進行多級發(fā)酵，發(fā)酵中參照國食藥監(jiān)注[2005] 202號《維生素、礦物質(zhì)種類和用量》的規(guī)定分級添加礦物質(zhì)；(3)根據(jù)菌體生長密度、形態(tài)和pH指標確定轉(zhuǎn)罐及發(fā)酵終點；(4)參照國食藥監(jiān)注[2005]202號《維生素、礦物質(zhì)種類和用量》的規(guī)定向三級發(fā)酵后的發(fā)酵罐中添加維生素；(5)滅菌和灌裝；
其特征在于步驟(I)所述微生物菌種是金針菇、靈芝、蟲草、香菇、雙孢菇、杏鮑菇、草菇、紫芝、兩岐雙岐桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌或保加利亞乳桿菌；步驟(2)所述多級發(fā)酵為三級發(fā)酵；所述分級添加礦物質(zhì)是指在培養(yǎng)基基本配方基礎上，分別添加不同種類和不同量的礦物質(zhì)元素構(gòu)成一、二和三級發(fā)酵培養(yǎng)基；其中礦物質(zhì)的分級添加為一級發(fā)酵時添加礦物質(zhì)元素是Se4+或Se6+30. O 200. 0mg/L、Cr3+30. O 300. Omg/L、Cu2+400. O 1000. Omg/L、Mn2+600. O 2000. Omg/L、Μο6+20· O 60. Omg/L ;二級發(fā)酵時添加礦物質(zhì)元素是Mg2+600 1800mg/L、Fe2+或Fe3+200 800mg/L、Zn2+400 1600mg/L ;三級發(fā)酵時添加礦物質(zhì)元素是Ca2+800 3000mg/L、K2+2000 4000mg/L ；上述礦物質(zhì)元素優(yōu)選使用的化合物是Na2SeO3, CrCl3, CuSO4, MnSO4, (NH4) 2Mo04，MgCl2, FeCl3, Zn (CH3COO)2, CaCl2, K2HPO4 ；上述培養(yǎng)基基本配方具體是蕈類發(fā)酵培養(yǎng)基基本配方土豆泥40. Og/L,麩皮汁40. 0g/L,葡萄糖20. 0g/L ；乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基基本配方蛋白胨10. 0g/L，牛肉浸膏10. 0g/L，酵母粉5. 0g/L,葡萄糖20. 0g/L,吐溫801. 0mL/L，檸檬酸氫二銨2. 0g/L ；步驟(3)所述轉(zhuǎn)罐指標是蕈類鏡檢菌體形態(tài)粗壯，菌密度120 150菌絲球/mL，pH3. 5 4. 5，或乳酸菌鏡檢菌體形態(tài)粗壯，菌密度2x10卜7菌落/mL，pH4. 5 5. O ;發(fā)酵終點指標是蕈類pH3. 5 4. 0，或乳酸菌pH3. 8 4. 2 ;步驟(4)所述添加的維生素種類及含量是維生素A 2. 5 6. 0mg/L、維生素D
0.01 I. 0mg/L、維生素 E 40 1000mg/L、維生素 K 0. 14 0. 6mg/L、維生素 B14 130mg/L、維生素B24 130mg/L、維生素PP 40 400mg/L、維生素B64 60mg/L、葉酸0. 6
2.5mg/L、維生素 B120. 01 0. lmg/L、泛酸 12 120mg/L、膽堿 1000 10000mg/L、生物素
0.06 0. 6mg/L、維生素 C 200 3000mg/L ；步驟(5)所述滅菌采用蕈類60 80°C，20 30分鐘，乳酸菌不需滅菌；所述灌裝為無菌操作間無菌操作灌裝。上述微生物發(fā)酵法生產(chǎn)全維生素礦物質(zhì)口服液的方法中步驟(I)所述微生物菌優(yōu)選是金針菇、靈芝、蟲草或保加利亞乳桿菌。上述微生物發(fā)酵法生產(chǎn)全維生素礦物質(zhì)口服液的方法中步驟(2)所述一級發(fā)酵時添加礦物質(zhì)兀素是Se4+ 或 Se6+30mg/L、Cr3+30mg/L> Cu2+400mg/L> Mn2+600mg/L> Mo6+20mg/L ;二級發(fā)酵時添加礦物質(zhì)元素是Mg2+600mg/L、Fe2+或Fe3+200mg/L、Zn2+600mg/L ;三級發(fā)酵時添加礦物質(zhì)元素是Ca2+1000mg/L、K+2000mg/L ;此量適用于未成年人。上述微生物發(fā)酵法生產(chǎn)全維生素礦物質(zhì)口服液的方法中步驟(2)所述一級發(fā)酵時添加礦物質(zhì)兀素是Se4+ 或 Se6+55mg/L、Cr3+50mg/L> Cu2+500mg/L> Mn2+800mg/L> Mo0+4Omg/L ;二級發(fā)酵時添加礦物質(zhì)元素是Mg2+800mg/L、Fe2+或Fe3+400mg/L、Zn2+800mg/L ;三級發(fā)酵時添加礦物質(zhì)元素是Ca2+2000mg/L、K+3000mg/L ;此量適用于成年人。上述微生物發(fā)酵法生產(chǎn)全維生素礦物質(zhì)口服液的方法中步驟(3)所述轉(zhuǎn)罐指優(yōu)選是蕈類菌密度130 140菌絲球/mL，pH4.0，或乳酸菌菌密度2xl07菌落/mL，pH4.6 ;發(fā)酵終點指標優(yōu)選是蕈類PH3. 5 3. 6，或乳酸菌pH4. O。上述微生物發(fā)酵法生產(chǎn)全維生素礦物質(zhì)口服液的方法中步驟(4)所述三級罐發(fā)酵終點添加的維生素種類及含量是維生素A 2. 5mg/L、維生素D O. 02mg/L、維生素E60mg/L、維生素K O. 2mg/L、維生素B16mg/L、維生素B25mg/L、維生素PP 60mg/L、維生素·B610mg/L、葉酸 O. 6mg/L、維生素 B120. 02mg/L、泛酸 12mg/L、膽堿 1000mg/L、生物素 O. 15mg/L、維生素C 300mg/L ;此量適用于未成年人。上述微生物發(fā)酵法生產(chǎn)全維生素礦物質(zhì)口服液的方法中步驟(4)所述三級罐發(fā)酵終點添加的維生素種類及含量是維生素A 3mg/L、維生素D 0.05mg/L、維生素E80mg/L、維生素K O. 3mg/L、維生素B120mg/L、維生素B210mg/L、維生素PP 80mg/L、維生素B620mg/L、葉酸 I. Omg/L、維生素 B120. 03mg/L、泛酸 50mg/L、膽堿 2000mg/L、生物素 O. 20mg/L、維生素C 1000mg/L ;此量適用于成年人。上述微生物發(fā)酵法生產(chǎn)全維生素礦物質(zhì)口服液的方法中步驟(5)所述蕈類滅菌優(yōu)選采用70°C，20分鐘。本發(fā)明方法所產(chǎn)生的有益效果是利用微生物液體發(fā)酵富集轉(zhuǎn)化作用，將各種人體必需的礦物質(zhì)和維生素按一定規(guī)律添加到培養(yǎng)基中，讓微生物在生長過程中吸收和轉(zhuǎn)化無機礦質(zhì)元素，成為有機形態(tài)。因為微生物液體發(fā)酵生產(chǎn)是多級進行的，所以礦物質(zhì)可以分級加入，這樣可避免礦物質(zhì)之間的拮抗和競爭。具有保健功能的微生物很多，本發(fā)明根據(jù)需要進行靈活選擇。如各種藥用食用蕈類，各種益生菌(乳酸菌)分別具有多種保健功能，可根據(jù)食用人群的需要選用。本發(fā)明三級發(fā)酵后添加人體必需的維生素，避免了維生素高溫破壞作用。申請人:迄今沒有檢索到國內(nèi)外有類似工藝生產(chǎn)本發(fā)明所述保健口服液的方法。本發(fā)明的產(chǎn)品可以做到將美國“Centrum”中所有成分都包括進去，還增加了微生物的保健功能，具有更大的開發(fā)應用價值，能取得較好的經(jīng)濟和社會效益。
具體實施例方式實施例I :利用金針菇發(fā)酵生產(chǎn)適用于未成年人的全維生素礦物質(zhì)口服液的方法I.金針菇菌種保存用PDA斜面(單位g/L) 200g 土豆塊煮沸30分鐘，過濾取汁，40g麩皮煮沸30分鐘過濾取汁，葡萄糖20. 0，KH2PO4L 5，MgSO4 ·7Η20 O. 75，瓊脂15. 0,121。。滅菌30分鐘，制成試管斜面，接種金針菇菌，25°C培養(yǎng)4 5天制成斜面種子；2.液體搖瓶金針菇種子液制備培養(yǎng)基(單位g/L) 200g 土豆塊煮沸30分鐘，過濾取汁，40g麩皮煮沸30分鐘過濾取汁，葡萄糖20. O, KH2PO4L 5，MgSO4 · 7H20 O. 75，121。。滅菌30分鐘；冷卻后，試管斜面種子接種；25°C，搖床200rpm，培養(yǎng)4天，得到培養(yǎng)好的金針燕搖瓶種子；3. 一級發(fā)酵罐發(fā)酵將制備好的搖瓶金針菇種子按10% (v/v)的量接種到121°C滅菌30分鐘，然后冷卻至25°C的一級發(fā)酵罐中通氣攪拌發(fā)酵，培養(yǎng)溫度25 ± I °C，攪拌槳轉(zhuǎn)速200rpm培養(yǎng)，定時取樣分析，鏡檢，菌絲粗壯、待菌絲球密度達到140菌絲球/mL，pH4. O時，作為種子待轉(zhuǎn)到二級發(fā)酵罐；上述一級發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方是土豆泥40. Og/L,麩皮40. Og/L,煮沸30分鐘過濾取汁，葡萄糖 20. Og/L, Na2Se0365. 6mg/L, CrCl391. 5mg/L, CuS04100 5mg/L, MnS041648mg/L,(NH4) Mo0440. 8mg/L ；
4. 二級發(fā)酵罐發(fā)酵將一級發(fā)酵好的菌種按10% (v/v)的量轉(zhuǎn)到121°C滅菌30分鐘，然后冷卻至25°C的二級發(fā)酵罐中通氣攪拌發(fā)酵，培養(yǎng)溫度25 土 TC，攪拌槳轉(zhuǎn)速180rpm培養(yǎng)，定時取樣分析，鏡檢，菌絲粗壯、待菌絲球密度達到150菌絲球/mL，和pH4. O時，作為種子待轉(zhuǎn)到三級發(fā)
酵罐；上述二級發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方是土豆泥40. Og/L,麩皮40. Og/L,煮沸30分鐘過濾取汁，葡萄糖 20. 0g/L, MgCl22352. 9mg/L, FeCl3581. 4mg/L, C4H6O4Zn 1680. 7mg/L ；5.三級發(fā)酵罐發(fā)酵將二級發(fā)酵好的菌種按10% (v/v)的量轉(zhuǎn)到121°C滅菌30分鐘，然后冷卻至25°C的三級發(fā)酵罐中通氣攪拌發(fā)酵，培養(yǎng)溫度25 土 TC，攪拌槳轉(zhuǎn)速160rpm培養(yǎng)，定時取樣分析，當PH降至3. 5，此時鏡檢，菌絲出現(xiàn)裂解，即為發(fā)酵終點；上述三級發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方是土豆泥40. 0g/L,麩皮40. 0g/L,煮沸30分鐘過濾取汁，葡萄糖 20. 0g/L, CaCl22777. 8mg/L, K2HP044454. 3mg/L ；6.維生素添加三級發(fā)酵完畢后添加維生素，各種維生素加量為(單位mg/L):維生素A 2. 5、維生素D 0.02、維生素E 60、維生素K 0. 2、維生素B16、維生素B25、維生素PP 60、維生素B610、葉酸0. 6、維生素B120. 02、泛酸12、膽堿1000、生物素0. 15、維生素C 300 ；7.滅菌與灌裝將添加維生素后的三級發(fā)酵罐中的產(chǎn)品采用70°C滅菌20分鐘，然后無菌操作間灌裝制成商品化口服液。實施例2 :利用靈芝發(fā)酵生產(chǎn)成年人全維生素礦物質(zhì)口服液的方法I.靈芝菌種保存用PDA斜面(g/L):200g 土豆塊煮沸30分鐘，過濾取汁，40g麩皮煮沸30分鐘過濾取汁，葡萄糖20. O7KH2PO4L 5，MgS04 ·7Η20 O. 75，瓊脂15. 0,121°C滅菌30分鐘，制成試管斜面，接種靈芝菌，28°C培養(yǎng)4 5天制成斜面種子；2.液體搖瓶靈芝種子液制備培養(yǎng)基(g/L):200g 土豆塊煮沸30分鐘，過濾取汁，40g麩皮煮沸30分鐘過濾取汁，葡萄糖20. O, KH2PO4L 5，MgSO4 · 7H20 O. 75，121°C滅菌30分鐘；冷卻后，試管斜面種子接種；30°C，搖床ISOrpm，培養(yǎng)4天，得到培養(yǎng)好的靈芝搖瓶種子；
3. 一級發(fā)酵罐發(fā)酵將制備好的搖瓶靈芝種子按10% (v/v)的量接種到121°C滅菌30分鐘，然后冷卻至30°C的一級發(fā)酵罐中通氣攪拌發(fā)酵，培養(yǎng)溫度29± 1°C，攪拌槳轉(zhuǎn)速200rpm培養(yǎng)，定時取樣分析，鏡檢，菌絲粗壯、待菌絲球密度達到150菌絲球/mL，和pH4. O時，作為種子待轉(zhuǎn)到二級發(fā)酵罐；上述一級發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方是土豆泥40. Og/L,麩皮40. Og/L,煮沸30分鐘過濾取汁，葡萄糖 20. Og/L, Na2Se03120 . 4mg/L, CrCl3152. 4mg/L, CuS0412 56 . 3mg/L,MnS042 1 97 . 8mg/L, (NH4) Mo0481. 6mg/L ； 4. 二級發(fā)酵罐發(fā)酵將一級發(fā)酵好的菌種按10% (v/v)的量轉(zhuǎn)到121°C滅菌30分鐘，然后冷卻至30°C的二級發(fā)酵罐中通氣攪拌發(fā)酵，培養(yǎng)溫度29土 TC，攪拌槳轉(zhuǎn)速180rpm培養(yǎng)，定時取樣分析，鏡檢，菌絲粗壯、待菌絲球密度達到150菌絲球/mL，和pH4. O時，作為種子待轉(zhuǎn)到三級發(fā)
酵罐；上述二級發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方是土豆泥40. Og/L，麩皮40. Og/L，煮沸30分鐘過濾取汁，葡萄糖 20. 0g/L, MgCl23137. 3mg/L, FeCl31162. 8mg/L, C4H6O4Zn 2240. 9mg/L ；5.三級發(fā)酵罐發(fā)酵將二級發(fā)酵好的菌種按10% (v/v)的量轉(zhuǎn)到121°C滅菌30分鐘，然后冷卻至30°C的三級發(fā)酵罐中通氣攪拌發(fā)酵，培養(yǎng)溫度29土 TC，攪拌槳轉(zhuǎn)速160rpm培養(yǎng)，定時取樣分析，當PH降至3. 6，此時鏡檢，菌絲出現(xiàn)裂解，即為發(fā)酵終點；上述三級發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方是土豆泥40. 0g/L,麩皮40. 0g/L,煮沸30分鐘過濾取汁，葡萄糖 20. 0g/L, CaCl25555. 6mg/L, K2HP046681. 5mg/L ；6.維生素添加三級發(fā)酵完畢后添加維生素，各種維生素加量為(單位mg/L):維生素A 3、維生素D 0.05、維生素E 80、維生素K 0. 3、維生素B120、維生素B210、維生素PP 80、維生素B620、葉酸I. O、維生素B120. 03、泛酸50、膽堿2000、生物素0. 20、維生素C 1000 ；7.滅菌與灌裝將添加維生素后的三級發(fā)酵罐中的產(chǎn)品采用70°C滅菌20分鐘，然后無菌操作間灌裝制成商品化口服液。實施例3 :利用泰山蟲草發(fā)酵生產(chǎn)成年人全維生素礦物質(zhì)口服液的方法I.泰山蟲草菌種保存用PDA斜面(g/L) :200g 土豆塊煮沸30分鐘，過濾取汁，40g麩皮煮沸30分鐘過濾取汁，葡萄糖20. O, KH2PO4L 5，MgSO4 · 7H20 O. 75，瓊脂15. 0,121。。滅菌30分鐘，制成試管斜面，接種靈芝菌，25°C培養(yǎng)4 5天制成斜面種子；2.液體搖瓶靈芝種子液制備培養(yǎng)基(g/L):200g 土豆塊煮沸30分鐘，過濾取汁，40g麩皮煮沸30分鐘過濾取汁，葡萄糖20. O7KH2PO4L 5,MgSO4 ·7Η20 O. 75，121°C滅菌30分鐘；冷卻后，試管斜面種子接種；25°C，搖床ISOrpm，培養(yǎng)3 4天，得到培養(yǎng)好的泰山蟲草搖瓶種子；3. 一級發(fā)酵罐發(fā)酵將制備好的搖瓶泰山蟲草種子按10% (v/v)的量接種到121°C滅菌30分鐘，然后冷卻至25 °C的一級發(fā)酵罐中通氣攪拌發(fā)酵，培養(yǎng)溫度25± 1°C，攪拌槳轉(zhuǎn)速200rpm培養(yǎng)，定時取樣分析，鏡檢，菌絲粗壯、待菌絲球密度達到120菌絲球/mL，和pH4. O時，作為種子待轉(zhuǎn)到二級發(fā)酵罐；上述一級發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方是土豆泥40. Og/L,麩皮40. Og/L,煮沸30分鐘過濾取汁，葡萄糖 20. Og/L, Na2Se03120 . 4mg/L, CrCl3152. 4mg/L, CuS0412 56 . 3mg/L,MnS042 1 97 . 8mg/L, (NH4) Mo0481. 6mg/L ；4. 二級發(fā)酵罐發(fā)酵將一級發(fā)酵好的菌種按10% (v/v)的量轉(zhuǎn)到121°C滅菌30分鐘，然后冷卻至25°C的二級發(fā)酵罐中通氣攪拌發(fā)酵，培養(yǎng)溫度25 土 TC，攪拌槳轉(zhuǎn)速180rpm培養(yǎng)，定時取樣分析，鏡檢，菌絲粗壯、待菌絲球密度達到120菌絲球/mL，和pH4. O時，作為種子待轉(zhuǎn)到三級發(fā)
酵罐； 上述二級發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方是土豆泥40. Og/L,麩皮40. Og/L,煮沸30分鐘過濾取汁，葡萄糖 20. 0g/L, MgCl23137. 3mg/L, FeCl31162. 8mg/L, C4H6O4Zn 2240. 9mg/L ；5.三級發(fā)酵罐發(fā)酵將二級發(fā)酵好的菌種按10% (v/v)的量轉(zhuǎn)到121°C滅菌30分鐘，然后冷卻至25°C的三級發(fā)酵罐中通氣攪拌發(fā)酵，培養(yǎng)溫度25 土 TC，攪拌槳轉(zhuǎn)速160rpm培養(yǎng)，定時取樣分析，當PH降至3. 9，此時鏡檢，菌絲出現(xiàn)裂解，即為發(fā)酵終點；上述三級發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方是土豆泥40. 0g/L,麩皮40. 0g/L,煮沸30分鐘過濾取汁，葡萄糖 20. 0g/L, CaCl25555. 6mg/L, K2HP046681. 5mg/L ；6.維生素添加三級發(fā)酵完畢后添加維生素，各種維生素加量為(單位mg/L):維生素A 3、維生素D 0.05、維生素E 80、維生素K 0. 3、維生素B120、維生素B210、維生素PP 80、維生素B620、葉酸I. O、維生素B120. 03、泛酸50、膽堿2000、生物素0. 20、維生素C 1000 ；7.滅菌與灌裝將添加維生素后的三級發(fā)酵罐中的產(chǎn)品采用60°C滅菌30分鐘，然后無菌操作間灌裝制成商品化口服液。實施例4 :利用保加利亞乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)全維生素礦物質(zhì)口服液的方法I.保加利亞乳桿菌菌種保存用MRS斜面(g/L):蛋白胨10. 0，牛肉浸膏10. 0，酵母提取物 5. O，葡萄糖 20. O，吐溫 801. O，檸檬酸氫二銨 2. O,MnSO4 .H2O 0. 25,MgSO4 ·7Η200· 58，Κ2ΗΡ042. 0，瓊脂15. 0，121 °C滅菌30分鐘，制成試管斜面，接種保加利亞乳桿菌，37°C培養(yǎng)，制成斜面種子；2.液體搖瓶保加利亞乳桿菌種子液制備培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10.0，牛肉浸* 10.0,酵母提取物5. O,葡萄糖20. O,吐溫801. O,檸檬酸氫二銨2. O, MnSO4 · H2O 0. 25，MgSO4 · 7H200. 58，K2HP042. 0,121°C滅菌30分鐘，冷卻后，試管斜面種子接種，瓶口保鮮膜密封，42°C，搖床120rpm，培養(yǎng)24 30小時，得到培養(yǎng)好的保加利亞乳桿菌搖瓶種子；3. 一級發(fā)酵罐發(fā)酵將制備好的搖瓶保加利亞乳桿菌種子按7% (v/v)的量接種到121°C滅菌30分鐘，然后冷卻至42°C的一級發(fā)酵罐中攪拌均勻，培養(yǎng)溫度42土 TC，靜止培養(yǎng)，定時取樣分析，鏡檢，菌體粗壯、待菌密度達到2xl07菌落/mL，和pH4. 5時，作為種子待轉(zhuǎn)到二級發(fā)酵罐；上述一級發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方是蛋白胨10. 0g/L，牛肉浸膏10.g/L，酵母提取物 5. Og/L,葡萄糖 20. Og/L,吐溫 801. 0ml/L,檸檬酸氫二銨 2. Og/L, Na2Se03120 . 4mg/L,CrCl3152. 4mg/L, CuS0412 56 . 3mg/L, MnS042 1 97 . 8mg/L, (NH4) Mo0481. 6mg/L ；4. 二級發(fā)酵罐發(fā)酵將一級發(fā)酵好的菌種按10% (v/v)的量轉(zhuǎn)到121°C滅菌30分鐘，然后冷卻至42°C的二級發(fā)酵罐中攪拌均勻，培養(yǎng)溫度42± 1°C，靜止培養(yǎng)，定時取樣分析，鏡檢，菌體粗壯、待菌密度達到2xl07菌落/mL，pH4. 5時，作為種子待轉(zhuǎn)到三級發(fā)酵罐；上述二級發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方是蛋白胨10. Og/L,牛肉浸膏10. g/L,酵母提取物 5. 0g/L，葡萄糖 20. 0g/L,吐溫 801. 0ml/L,梓檬酸氫二銨 2. 0g/L, MgCl23137. 3mg/L,FeCl31162. 8mg/L, C4H6O4Zn 2240. 9mg/L ；5.三級發(fā)酵罐發(fā)酵
將二級發(fā)酵好的菌種按10% (v/v)的量轉(zhuǎn)到121°C滅菌30分鐘，然后冷卻至42°C的二級發(fā)酵罐中攪拌均勻，培養(yǎng)溫度42 土 1°C，靜止培養(yǎng)，定時取樣分析，當pH下降至4. O時，確定為發(fā)酵終點；上述三級發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方是蛋白胨10. 0g/L,牛肉浸膏10. g/L,酵母提取物
5.0g/L，葡萄糖 20. 0g/L,吐溫 801. 0ml/L，檸檬酸氫二銨 2. 0g/L, CaCl25555. 6mg/L, K2HPO46681. 5mg/L ；6.維生素添加三級發(fā)酵完畢后添加維生素，各種維生素加量為(單位mg/L):維生素A 3、維生素D 0.05、維生素E 80、維生素K 0. 3、維生素B120、維生素B210、維生素PP 80、維生素B620、葉酸I. O、維生素B120. 03、泛酸50、膽堿2000、生物素0. 20、維生素C 1000 ；7.灌裝將添加維生素后的三級發(fā)酵罐攪拌均勻，然后不經(jīng)滅菌直接無菌操作灌裝制成商品化口服液。上述實施例中涉及的分析方法匯總?cè)缦翴.菌絲形態(tài)和菌絲球密度用鏡檢分析，染色用革蘭氏染色法，用常規(guī)光學顯微鏡油鏡觀察，最大倍數(shù)1500倍。2. pH 用 pH 計測定。3.多糖分析用兩次DNS法，第一次DNS法分析發(fā)酵液中殘留還原糖，然后發(fā)酵液用3N鹽酸，100°C水解30分鐘，中和后，第二次DNS法分析水解后的發(fā)酵液中還原糖，兩次分析差值為多糖含量。4.礦物質(zhì)分析用火焰原子吸收儀測定。本發(fā)明中涉及的菌種均購自天津生物芯片技術(shù)有限責任公司。
權(quán)利要求
1.一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)全維生素礦物質(zhì)口服液的方法，步驟是 (1)選擇藥用和食用蕈類、國標中允許使用的益生菌菌種； (2)利用微生物富集轉(zhuǎn)化礦物質(zhì)，進行多級發(fā)酵，發(fā)酵中參照國食藥監(jiān)注[2005]202號《維生素、礦物質(zhì)種類和用量》的規(guī)定分級添加礦物質(zhì)； (3)根據(jù)菌體生長密度、形態(tài)和pH指標確定轉(zhuǎn)罐及發(fā)酵終點； (4)參照國食藥監(jiān)注[2005]202號《維生素、礦物質(zhì)種類和用量》的規(guī)定向三級發(fā)酵后的發(fā)酵罐中添加維生素； (5)滅菌和灌裝； 其特征在于 步驟(I)所述微生物菌種是金針菇、靈芝、蟲草、香菇、雙孢菇、杏鮑菇、草菇、紫芝、兩岐雙岐桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌或保加利亞乳桿菌； 步驟(2)所述多級發(fā)酵為三級發(fā)酵；所述分級添加礦物質(zhì)是指在培養(yǎng)基基本配方基礎上，分別添加不同種類和不同量的礦物質(zhì)元素構(gòu)成一、二和三級發(fā)酵培養(yǎng)基；其中礦物質(zhì)的分級添加為一級發(fā)酵時添加礦物質(zhì)元素是=Se4+或Se6+30. O 200. Omg/L、Cr3+30. O 300. Omg/L、Cu2+400. O 1000. Omg/L、Mn2+600. 0 2000. Omg/L、Μο6+20· 0 60. Omg/L ;二級發(fā)酵時添加礦物質(zhì)元素是Mg2+600 1800mg/L、Fe2+或Fe3+200 800mg/L、Zn2+400 1600mg/L ;三級發(fā)酵時添加礦物質(zhì)元素是Ca2+800 3000mg/L、K2+2000 4000mg/L ； 上述培養(yǎng)基基本配方具體是 蕈類發(fā)酵培養(yǎng)基基本配方土豆泥40. 0g/L,麩皮汁40. 0g/L,葡萄糖20. 0g/L ； 乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基基本配方蛋白胨10. 0g/L,牛肉浸膏10. 0g/L,酵母粉5. 0g/L,葡萄糖 20. 0g/L,吐溫 801. 0mL/L,檸檬酸氫二銨 2. 0g/L ； 步驟(3)所述轉(zhuǎn)罐指標是蕈類鏡檢菌體形態(tài)粗壯，菌密度120 150菌絲球/mL，pH3. 5 4. 5，或乳酸菌鏡檢菌體形態(tài)粗壯，菌密度2x10卜7菌落/mL，pH4. 5 5. O ;發(fā)酵終點指標是蕈類pH3. 5 4. 0，或乳酸菌pH3. 8 4. 2 ; 步驟(4)所述添加的維生素種類及含量是維生素A 2. 5 6. 0mg/L、維生素D 0. 01 I.0mg/L、維生素 E 40 1000mg/L、維生素 K 0. 14 0. 6mg/L、維生素 B14 130mg/L、維生素 B24 130mg/L、維生素 PP 40 400mg/L、維生素 B64 60mg/L、葉酸 0. 6 2. 5mg/L、維生素 B120. 01 0. lmg/L、泛酸 12 120mg/L、膽堿 1000 10000mg/L、生物素 0. 06 0. 6mg/L、維生素 C 200 3000mg/L ； 步驟(5)所述滅菌采用蕈類60 80°C，20 30分鐘，乳酸菌不需滅菌；所述灌裝為無菌操作間無菌操作灌裝。
2.如權(quán)利要求I所述微生物發(fā)酵法生產(chǎn)全維生素礦物質(zhì)口服液的方法，其特征在于步驟(I)所述微生物菌是金針菇、靈芝、蟲草或保加利亞乳桿菌。
3.如權(quán)利要求I所述微生物發(fā)酵法生產(chǎn)全維生素礦物質(zhì)口服液的方法，其特征在于步驟(2)所述一級發(fā)酵時添加礦物質(zhì)元素是Se4+或Se6+30mg/L、Cr3+30mg/L> Cu2+400mg/L>Mn2+600mg/L,Mo6+20mg/L ;二級發(fā)酵時添加礦物質(zhì)元素是Mg2+600mg/L、Fe2+ 或 Fe3+200mg/L、Zn2+600mg/L ;三級發(fā)酵時添加礦物質(zhì)元素是Ca2+1000mg/L、K+2000mg/L ;此量適用于未成年人。
4.如權(quán)利要求I所述微生物發(fā)酵法生產(chǎn)全維生素礦物質(zhì)口服液的方法，其特征在于步驟(2)所述一級發(fā)酵時添加礦物質(zhì)元素是Se4+或Se6+55mg/L、Cr3+50mg/L> Cu2+500mg/L>Mn2+800mg/L>Mo6+40mg/L ;二級發(fā)酵時添加礦物質(zhì)元素是Mg2+800mg/L、Fe2+ 或 Fe3+400mg/L、Zn2+800mg/L ;三級發(fā)酵時添加礦物質(zhì)元素是Ca2+2000mg/L、K+3000mg/L ;此量適用于成年人。
5.如權(quán)利要求I所述微生物發(fā)酵法生產(chǎn)全維生素礦物質(zhì)口服液的方法，其特征在于步驟(3)所述轉(zhuǎn)罐指是蕈類菌密度130 140菌絲球/mL，pH4. 0，或乳酸菌菌密度2xl07菌落/mL, ρΗ4· 6 ;發(fā)酵終點指標是蕈類ρΗ3· 5 3. 6，或乳酸菌ρΗ4· O。
6.如權(quán)利要求I所述微生物發(fā)酵法生產(chǎn)全維生素礦物質(zhì)口服液的方法，其特征在于步驟(4)所述三級罐發(fā)酵終點添加的維生素種類及含量是維生素A 2. 5mg/L、維生素DO. 02mg/L、維生素E 60mg/L、維生素K O. 2mg/L、維生素B16mg/L、維生素B25mg/L、維生素PP60mg/L、維生素 B610mg/L、葉酸 O. 6mg/L、維生素 B120. 02mg/L、泛酸 12mg/L、膽堿 1000mg/L、生物素O. 15mg/L、維生素C 300mg/L ;此量適用于未成年人。
7.如權(quán)利要求I所述微生物發(fā)酵法生產(chǎn)全維生素礦物質(zhì)口服液的方法，其特征在于步驟(4)所述三級罐發(fā)酵終點添加的維生素種類及含量是維生素A 3mg/L、維生素DO. 05mg/L、維生素 E 80mg/L、維生素 K O. 3mg/L、維生素 B120mg/L、維生素 B210mg/L、維生素 PP 80mg/L、維生素 B620mg/L、葉酸 I. Omg/L、維生素 B120. 03mg/L、泛酸 50mg/L、膽堿2000mg/L、生物素O. 20mg/L、維生素C 1000mg/L ;此量適用于成年人。
8.如權(quán)利要求I所述微生物發(fā)酵法生產(chǎn)全維生素礦物質(zhì)口服液的方法，其特征在于步驟(5)所述蕈類滅菌采用70°C，20分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)全維生素礦物質(zhì)口服液的方法，是經(jīng)過菌種選擇、利用多級發(fā)酵分級添加礦物質(zhì)、根據(jù)菌體生長密度、形態(tài)和pH指標確定轉(zhuǎn)罐及發(fā)酵終點、向三級發(fā)酵后的發(fā)酵罐中添加維生素、滅菌和灌裝等步驟完成。本發(fā)明利用微生物液體發(fā)酵富集轉(zhuǎn)化作用，將各種人體必需的礦物質(zhì)和維生素按一定規(guī)律分級添加到培養(yǎng)基中，讓微生物在生長過程中吸收和轉(zhuǎn)化無機礦質(zhì)元素，成為有機形態(tài)，同時利用多級添加發(fā)酵避免了礦物質(zhì)之間的拮抗和競爭。本發(fā)明產(chǎn)品還增加了微生物的保健功能，具有更大的開發(fā)應用價值及較好的經(jīng)濟和社會效益。
文檔編號A23L1/302GK102940260SQ20121048858
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月26日
發(fā)明者張厚程, 王玉萍, 李翔太 申請人:山東大學