一種來源于大腸桿菌的離子通道基因及其抗鹽性應用的制作方法
【專利摘要】本發明將一種來源于大腸桿菌的離子通道基因ENHX2基因轉入植物并使得這種轉基因植物能夠具備增加植物抗鹽性的作用。所述離子通道基因ENHX2含1650個堿基，編碼的氨基酸549個；所述基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ?ID?NO2所示。本發明中來源于釀離子通道蛋白基因ENHX2采用人工方法合成，轉基因植物具備較高的抗鹽性。
【專利說明】—種來源于大腸桿菌的離子通道基因及其抗鹽性應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于作物遺傳育種領域，具體涉及一種來源于大腸桿菌的離子通道基因的序列，利用農桿菌將該基因轉化到植物中，使植物耐鹽能力得到提高。
【背景技術】
[0002]鹽潰化土壤是廣泛分布的不利于植物生長的一種土地，鹽分脅迫嚴重影響著植物的正常生長發育。土壤鹽堿化問題引起了世界各地學者的日益關注，成為現代土壤學研究的熱點。所謂鹽土是指土壤飽和提取液中電導率(EC)高于4ds/m，并且可交換性鈉百分數(ESP)的含量低于15%的土壤，這些土壤的pH—般為中性偏堿，當ESP高于15%、pH大幅上升時的鹽土又稱為鹽堿土。鹽堿土在陸地生態系統上分布廣泛，全世界鹽潰土面積約10億公頃。在全球的干旱和半干旱地區，約有50%的灌溉土地受到鹽堿化的影響，區域內的非灌溉土地同樣會發生鹽堿化。在我國從濱海到內陸，從低地到高原都分布著不同類型的鹽堿土壤，鹽潰土面積約3460萬公頃，鹽堿化耕地760萬公頃，即近1/5耕地發生鹽堿化。
[0003]人們就逆境對植物影響的認識和研究，首先是從表觀生理指標一般性描述開始，其次研究植物在各種逆境下產生的生理生化、生態變化和生理調節機制，最后發展到分子水平，進一步探討植物對不同逆境的感應、信號傳導、基因表達與調控、蛋白質組裝和細胞膜功能獲得。為更深入了解植物對不同逆境響應的分子機理和研究人工調控的生物技術等方面展示出良好前景。
[0004]抗鹽能力因種而異，抗鹽性強的植物原生質膜具有極低的透性，在同種鹽潰條件下，吸收鹽類明顯少于抗鹽弱的品種，在一定程度上加強了拒鹽的作用。所以可利用生理生化指標鑒定、組織培養、轉基因等技術培育新的抗鹽作物品種，使其適應鹽堿土環境
[0005]本項發明利用PTDS法合成了來源于大腸桿菌的離子通道基因，將該基因轉化擬南芥，進而提高了轉基因擬南芥的抗鹽能力，該基因對于培育植物抗鹽的植物品種非常重要，具有重要的理論意義和現實意義。

【發明內容】

[0006]本發明所要解決的技術問題在于將一種來源于大腸桿菌的離子通道基因ENHX2轉入植物體內，并對該轉基因植物進行功能驗證，以證明它具有提高植物的耐鹽性的功能。
[0007]一種來源于大腸桿菌的離子通道基因ENHX2，其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示，其氨基酸序列如SEQ ID N02所示。
[0008]所述來源于大腸桿菌的離子通道基因ENHX2長1650bp，編碼的氨基酸549個。
[0009]所述來源于大腸桿菌的離子通道基因ENHX2通過農桿菌介導轉入擬南芥，應用于植物耐鹽性。
[0010]所述來源于大腸 桿菌的離子通道基因采用人工方法合成，具體包括以下步驟:
[0011]1)ENHX2的人工合成
[0012]依照PTDS(PCR-basedtwo-step DNA synthesis,PTDS)方法進行源自大腸桿菌的離子通道基因進行化學合成，在保持ENHX2基因的氨基酸序列不變的基礎上，設計引物合成了 ENHX2基因。
[0013]2)ENHX2農桿菌雙元載體的構建
[0014]ENHX2基因植物雙元載體在pcAMBIA-1301載體的基礎上構建而成，在pCAMBIA-1301載體的多克隆位點處插入兩端附加了煙草的染色質附著SAR序列的外源基因的表達單兀，這有利于轉基因的穩定遺傳；在外源基因的表達單兀內，我們在目的基因的兩側導入了 BamHI和Sacl酶切位點，便于外源基因的插入，外源基因的表達由雙CAMV355啟動子+TMV omega leader sequence 控制
[0015]3)電擊法轉化農桿菌
[0016]參照 MicroPulser? Electroporation Apparatus Operating InstructionsandApplication Guide (BIO-RAD公司)制備農桿菌GV3101感受態.并且將構建好的農桿菌雙元載體經電擊法轉入到農桿菌中。
[0017]4)農桿菌介導轉化擬南芥
[0018]利用蘸花法將構建好的農桿菌轉入擬南芥體內.首先將擬南芥的花苔浸入滲透液中，輕輕攪動約3~5秒后取出，全部轉化完畢后，托盤中加入PNS營養液，以黑色塑料袋套盆封口，保持濕潤環境，置于22°C培養室，低光強度下生長24小時，即可正常培養。生長約兩個月后，收集種子，4 V冰箱貯存待用。
[0019]5)擬南芥轉化植株種子的篩選
[0020]將得到的種子進行篩選，包括⑶S組織化學染色分析和轉基因陽性植株的PCR檢測得到轉入ENHX2基因的擬南`芥。
[0021]6)轉基因擬南芥耐鹽性驗證
[0022]將轉化植物自交純合3代，獲得純合轉化株，收取種子。播種后，在22°C生長兩個星期。然后將野生型和轉基因培養皿小苗用于耐鹽抗性實驗。F分別用不同濃度的NaCl溶液處理野生型和轉基因擬南芥株系。鹽處理14d，結果顯示在150、200mmol/L NaCl處理下野生型生長明顯受抑制，葉片發黃，而轉基因株系抑制較小。結果說明ENHX2基因明顯提高了擬南芥的耐鹽性。
[0023]本發明實現的有益.效果
[0024]本發明采用PTDS法合成了來源于大腸桿菌的離子通道基因，為了進一步分析該基因在鹽堿逆境中的作用與功能，我們比較了轉ENHX2基因的擬南芥植株和野生型擬南芥植株的耐鹽性。結果表明，野生型和轉ENHX2基因擬南芥植株在表型上有很大的差異。結果顯示在150mmol/L NaCl處理下野生型生長明顯受抑制，葉片發黃，而轉基因株系抑制較小。結果說明ENHX2基因明顯提高了擬南芥的耐鹽性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1是用于擬南芥轉化的植物表達載體示意圖。
[0026]圖2是獲得的轉ENHX2基因擬南芥的⑶S染色圖。
[0027]圖3是轉ENHX2基因擬南芥與野生型擬南芥的耐鹽表型圖。
【具體實施方式】[0028]以下結合附圖詳細描述本發明的技術方案。應當說明的是，所述實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍中。
[0029]本發明所用的試驗材料及其來源包括:
[0030]野生型擬南芥(Arabidopsis thaliana)生態型擬南芥Columbia, 23°C人工氣候室培養，16h光照培養。
[0031]克隆載體pMD-18-Simple T、各類限制性內切酶、Taq聚合酶、連接酶、dNTP、IOXPCR buffer和DNA marker購自寶生物工程大連有限公司。所有的化學試劑都從美國西格瑪化學公司和上海國藥化學試劑購買。ABI PRIAM Big-DyeTerminator DNA測序試劑盒購自美國應用系統公司。
[0032]本發明所用的試劑若未明確指明，則均購自西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich)。
[0033]本發明涉及分子生物學實驗，如沒有特別注明，均參考自《分子克隆》一書(J.薩姆布魯克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科學出版社。)
[0034]實施例1
[0035]大腸桿菌ENHX2基因的人工合成
[0036]根據Genbank登錄的大腸桿菌ENHX2基因序列(ABJ03869)，用以基因合成方法【Nucleic Acids Research, 2004, 32, e98】,在不改變基因編碼的氨基酸序列的前提下,按以下原則進行合成基因編碼區的設計:(一)優化基因密碼子，提高基因翻譯效率。(二)消除基因內部的常用限制性內切酶的識別位點，便于表達盒構建。(三)消除逆向重復序列、莖環結構和轉錄終止信號，使基因內部的GC/AT均衡，提高RNA的穩定性。(四)使基因編碼蛋白符合N端原則(Tobiasl991)，以提高翻譯蛋白的穩定性。(五)設計提高基因5’端的自由能，以提聞基因翻譯起始效率。
[0037]擴增條件為:94°C預熱Imin ;94°C，30s，50°C，30s，72°C，2min，使用的 Taq DNA 聚合酶為KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)，共25個循環。
[0038]PCR結束后，1%瓊脂糖膠回收，取10 μ I直接與T/A克隆載體相連(大連寶生物公司)。4°C連接過夜，高效轉化DH5a感受態中。獲得陽性克隆。
[0039]實施例2
[0040]ENHX2農桿菌雙元載體的構建
[0041]上述人工合成的ENHX2基因的陽性克隆用引物SPl基因ORF經PCR擴增后頭尾分別加入Bam HI和Sac I切點，經BamHI+Sac I雙酶切，回收DNA片段與相應酶切的載體相連，經酶切鑒定和測序后得到正確的雙元載體(見圖1)。
[0042]實施例3
[0043]電擊法轉化農桿菌
[0044]I)制備農桿菌GV3101感受態，方法參照MicroPulser?ElectroporationApparatus Operating Instructions and Application Guide(BIO-RAD公司)((Raineriet al.，Bi0.Tech.，1990,8:33-38)。
[0045]2)取50 μ L GV3101感受態細胞，加入I μ L DNA,轉入0.2cm電擊杯轉化(400 Ω，
2.5KV，25 μ f)。加入ImL含有I %甘露醇的LB培養基恢復培養2小時(28°C，250rpm)。分別取10 μ L、100 μ L涂LB平板(利福平50 μ g/mL,慶大霉素50 μ g/mL,氯霉素100 μ g/mL)。
[0046]3)挑取幾個克隆，堿法抽提農桿菌質粒，酶切鑒定，PCR檢測。
[0047]實施例4
[0048]農桿菌介導轉化擬南芥
[0049]A擬南芥的培養
[0050]I)擬南芥種子在4°C進行2-3天的春化處理，目的是有利于種子的一致萌發和花期的提前。
[0051]2)將蛭石、黑土、珍珠巖按9: 3: 0.5的比例拌勻，經高溫滅菌后裝于IOcm的塑料小盆，以營養液PNS浸濕待用。
[0052]3)以牙簽將擬南芥種子點播于濕潤的基質上，保鮮膜封口。放置于22°C暗培養2-3天，待種子萌發后，揭開保鮮膜，置于22°C培養室中進行16小時光照培養。
[0053]4)擬南芥抽苔后及抽苔后兩周以及轉化后需再以PNS營養液浸濕一次。中途可視情況適當澆水。首次抽苔后需剪去初生苔，利于次生苔的生長，當次生苔長至2-lOcm(少數已經開花)可用于轉化(何玉科，鞏振輝，細胞生物學雜志，1991，13(3):97-101)。
[0054]B農桿菌的 準備
[0055]I)挑取農桿菌單菌接種于5mL LB液體培養基(利福平50 μ g/mL,氯霉素100 μ g/mL)中，28°C，250rpm 培養 20 小時。(Rashid et al., 1996)
[0056]2)取ImL菌液轉接入20_30mL LB液體培養基(利福平50 μ g/mL,氯霉素100 μ g/mL)中，28°C，250rpm 培養約 12 小時，測 0D600 ~1.5。
[0057]3)8000rpm，4°C，10min離心收集菌體，重懸于農桿菌轉化滲透液(5%蔗糖，0.05% Silwet L-77)并稀釋至 0D600 ~0.8。
[0058]C擬南芥蘸花法轉化
[0059]I)將擬南芥的花苔浸入滲透液中，輕輕攪動約3~5秒后取出，全部轉化完畢后，托盤中加入PNS營養液，以黑色塑料袋套盆封口，保持濕潤環境，置于22°C培養室低光強度下生長24小時，即可正常培養。
[0060]2)初次轉化四天后，可再進行一次轉化，重復兩次，總共轉化三次，這樣可以在花發育的不同時期進行轉化，提高轉化效率。
[0061]3)生長約兩個月后，收集種子，4°C冰箱貯存待用。
[0062]實施例5
[0063]擬南芥轉化植株種子的篩選
[0064]I)稱25_30mg種子放入1.5mL離心管。
[0065]2)乙醇消毒Imin (不停搖晃振蕩)，8000rpm離心5秒,去上清。
[0066]3)加入ImL過濾后的漂白粉消毒15min (不停搖晃振蕩,充分消毒)，8000rpm離心
5秒,去上清。
[0067]4)無菌水洗滌3-4次。
[0068]5)將種子均勻的播撒到1/2MS平板(Hyg50 μ g/mL)上，ParafiIm膜封口，4°C冰箱放置兩天，22°C，16小時光照培養6天。
[0069]6)將抗性植株移栽到盆中培養，苗稍大后，進行GUS活性檢測，選出陽性植株(Tl)繼續培養，并收集種子進行T2代和T3代篩選。[0070]實施例6
[0071]轉基因陽性植株的檢測
[0072]按Jefferson (1978)的方法，將待測擬南芥葉片樣品與X-Gluc染色反應液(50mmol/L NaH2P04, ρΗ7.0 ;0.5m mol/L Κ4 [Fe (CN) 6]，0.1% Triton Χ-100，20% 甲醇，0.5mg/mL X-Gluc[X-glucuronide])于37°C保溫2-4小時后，用75%乙醇脫色觀察(見圖2)。
[0073]實施例7
[0074]大腸桿菌離子通道ENHX2基因轉化植物后的耐鹽分析
[0075]將轉化植物自交純合3代，獲得純合轉化株，收取種子。播種后，在22°C生長兩個星期。然后比較了轉ENHX2基因的擬南芥植株和野生型擬南芥植株的耐鹽性。結果表明，野生型和轉ENHX2基因擬南芥植株在表型上有很大的差異。結果顯示在150mmol/LNaCl處理下野生型生長明顯受抑制，葉片發黃，而轉基因株系抑制較小。結果說明ENHX2基因明顯提高了擬南芥的耐鹽性(圖3`)。
【權利要求】
1.一種來源于大腸桿菌的離子通道基因基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNOl所示。
2.根據權利要求1所述的來源于大腸桿菌的離子通道基因，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N02所示。
3.權利要求1或2所述的來源于大腸桿菌的離子通道基因采用人工方法制備而成。
4.權利要求1或 2所述的來源于大腸桿菌的離子通道基因采用農桿菌蘸花法轉化擬南芥。
5.權利要求1或2所述的來源于大腸桿菌的離子通道基因轉基因植物在抗鹽性中的應用。
【文檔編號】C12N15/84GK103805614SQ201210488614
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月15日 優先權日:2012年11月15日
【發明者】蔣海燕, 薛永, 殷浩, 周惠, 伍光彩, 張楊 申請人:無錫柏歐美地生物科技有限公司