專利名稱：火雞組織滴蟲lamp檢測試劑盒的制作方法
火雞組織滴蟲LAMP檢測試劑盒技術領域
本發明屬于生物技術領域，涉及一種用環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermalamplification, LAMP)技術快速檢測火雞組織滴蟲的試劑盒,并涉及一種使用該種試劑盒快速檢測火雞組織滴蟲的方法。
背景技術：
組織滴蟲病又稱“黑頭病”和“盲腸肝炎”，是由火雞組織滴蟲(Histomonas meleagridis)寄生于禽類引起的一種原蟲病，以肝臟壞死、盲腸腫大和排硫磺樣糞便為主要特征。目前，本病在中國和歐美等很多國家和地區流行嚴重，部分養殖場由于禽舍嚴重污染，常導致該病暴發，死亡率達到20-30%，再加上化學藥物的治療費用，造成的經濟損失非常嚴重。
早發現和早治療對于本病的控制十分重要。為了更好的控制組織滴蟲病的傳播和發病，并及時采取措施將其造成的經濟損失控制在最小的范圍，我們必須根據組織滴蟲病的特點采取快速檢測方案。
組織滴蟲病的初步診斷主要依賴于臨床癥狀的觀察和剖檢，由于肝臟和盲腸的病變有時容易與弧菌性肝炎、腫瘤、球蟲病等禽病相混淆，因此建立一種敏感、可靠、實用的實驗室診斷方法顯得尤為緊迫和重要。目前，已報道的組織滴蟲實驗室診斷方法有顯微鏡檢查、組織病理學檢查、蟲體分離培養、聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)、 酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay, ELISA)等，幾種方法均可以直接檢測出病料中的組織滴蟲病病原，但顯微鏡檢查時病原的形態與四毛滴蟲、芽囊原蟲等類似易混淆，組織病理學檢查費時費力，蟲體的分離培養又十分繁瑣、耗時等，PCR、ELISA必須配備專用儀器，操作較為繁瑣，常有非特異性出現，檢測時間至少需要3個小時。與上述幾種實驗室診斷方法相比，LAMP技術對儀器設備要求不高，操作簡單，臨床上容易做到，檢測時間也較短，不超過3小時，為快速、準確診斷雞組織滴蟲病病原提供了一種新方法。發明內容
本發明的目的就在于克服其他檢測方法的缺陷，研制一種火雞組織滴蟲LAMP檢測試劑盒及其檢測方法。
本發明的技術方案是一種火雞組織滴蟲LAMP檢測試劑盒，包括以下成分
( I)反應液 A
含有IOX 等溫反應緩沖液、Bst DNA 聚合酶 8000U/mL、IOmM dNTP、25mM MgCl2, 200 μ M內引物、200 μ M內引物2、100 μ M外引物I、100 μ M外引物2、5M甜菜堿和去離子水，其中
10Χ等溫反應緩沖液含有200mM三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽(ρΗ8. 8)、IOOmM氯化鉀、IOOmM 硫酸銨、20mM 硫酸鎂和 1% (m/V)曲拉通 X-100 (pH8. 8,25°C)；
內引物 I 為GAGCCCATGAACTATTGATTTCTCTAGTTCCTACCTTAAACTATGCC (SEQ IDNO. I)
內引物 2 為CTACGACCGCAAGGCTGAAATTAAGCCACAAGCTCCAC(SQE ID NO. 2)
外引物I 為GTATCCAACCGGATCAGAG(SEQ ID NO. 3)
外引物2 為:AAGTTTCCCCGTGTTGAT (SEQ ID NO. 4)
(2)反應液 B :1000X 的熒光染料 SYBR Green I。
本發明的另一技術方案是
一種火雞組織滴蟲LAMP檢測試劑盒檢測火雞組織滴蟲的方法，其主要技術步驟包括
(I)火雞組織滴蟲的環介導等溫擴增
在裝有24 μ L反應液A的PCR反應管中加入I μ L待檢樣品處理液，混勻離心，將 I μ L的反應液B滴在PCR管蓋內側中間,輕輕蓋緊管蓋(小心操作，以防顯色液墜入反應混合液中)，于60-65 °C恒溫水浴箱中放置60min。
(2)擴增產物的顯色檢測
反應結束后顛倒PCR管數次，使反應混合液與反應液B充分混合，肉眼觀察反應液顏色，根據反應液的顏色變化判斷檢測結果。如顏色變為綠色，表明樣品中含有火雞組織滴蟲，如顏色為黃色，說明待檢樣品不含有火雞組織滴蟲。
本發明與現有技術相比，其優點和積極效果表現在本發明建立了火雞組織滴蟲 LAMP檢測試劑盒及其檢測方法，本試劑盒根據火雞組織滴蟲的18SrRNA基因保守區的六個序列設計了兩個特異性內引物和兩個特異性外引物，該保守基因序列為火雞組織滴蟲所共有。本發明采用LAMP技術，特異性強，且比PCR檢測方法有更高的靈敏度，但不需昂貴的PCR 儀，只需普通的金屬浴或水浴箱即可，且結果不必用凝膠電泳方法來觀察，使用熒光染料來觀察即可，簡單而快速。可用于火雞組織滴蟲的檢測，特別適合于基層現場應用。
LAMP技術具有特異性強、靈敏度高、快速且成本低等優點，其特點是對靶基因的6 個部位設定4種引物，利用鏈置換反應在恒溫下使靶基因高效擴增。由于其反應是多種引物共同啟動，使得反應結果比PCR更特異，另外，由于實行的是等溫擴增，反應在恒溫水浴箱內便可完成，不僅節約儀器成本，而且操作方法更簡單，適于現場快速檢測。
本發明解決了現有技術中檢測火雞組織滴蟲的方法所需周期長、靈敏度較低、成本高、現場應用困難等缺陷，提供的火雞組織滴蟲的檢測試劑盒及其檢測方法，對火雞組織滴蟲進行LAMP檢測，快速、準確性高、靈敏性好、現場應用方便，可廣泛應用于獸醫、食品、 出入境檢疫領域。


圖I是樣品檢測結果圖。I.陽性樣品2.陰性樣品3.空白對照。
具體實施方式
下列實例進一步說明本發明，但不應該當作對本發明的限制。
實施例I :
按下列配方制作火雞組織滴蟲的環介導等溫擴增檢測試劑盒
( I)反應液 A
含有IOX 等溫反應緩沖液、Bst DNA 聚合酶 8000U/mL、IOmM dNTP、25mM MgCl2, 200 μ M內引物、200 μ M內引物2、100 μ M外引物I、100 μ M外引物2、5M甜菜堿和去離子水，其中
IOX等溫反應緩沖液含有200mM三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽(ρΗ8. 8)、IOOmM氯化鉀、IOOmM 硫酸銨、20mM 硫酸鎂和 1% (m/V)曲拉通 X-100 (pH8. 8,25°C)；
內引物I為
內引物2為
外引物I為
外引物2為GAGCCCATGAACTATTGATTTCTCTAGTTCCTACCTTAAACTATGCC CTACGACCGCAAGGCTGAAATTAAGCCACAAGCTCCAC GTATCCAACCGGATCAGAG AAGTTTCCCCGTGTTGAT
(2)反應液 B =IOOOX 的熒光染料 SYBR Green I。
LAMP反應液A以每管24 μ L計,為2. 5 μ L 10 X等溫反應緩沖液、I. O μ L 8U/μ L Bst DNA 聚合酶、2.5yL IOmM dNTP、2yl 25mM MgCl2、I μ L 四種引物混合液、3· O μ L 5Μ 甜菜堿、12 μ L去離子水。
四種引物混合液含有17. 5μ L 200μΜ內引物1、17. 5μ L 200 μ M內引物2、70 μ L 100 μ M外引物l、70yL 100 μ M外引物2、175 μ L去離子水。
實施例2 :利用火雞組織滴蟲LAMP檢測試劑盒檢測火雞組織滴蟲
待測樣本處理液制備以樣本取自雞肝臟為例，發病雞肝臟作為陽性樣品，正常雞肝臟作為陰性樣品，同時設立不含樣品的去離子水作為空白對照。
A.取肝臟組織O. 5g，加入ImL的細胞裂解緩沖液(IOOmM pH8. OTris, 500mM pH 8. OEDTA, 20mM NaCL，10%SDS)，于玻璃勻漿器勻漿至渾濁，將濁液置于1.5mL離心管中；
B.加入蛋白酶K (20mg/mL) 20 μ L混勻，于65°C恒溫水浴鍋中水浴30min ；
C. 12000 Xg離心5min，取上清液入另一離心管中；
D.加入等量的酚氯仿:異戊醇(25:24:1)振蕩混勻，12000Xg離心5min，取上層液入另一離心管中；
E.加入十分之一體積的3M醋酸鈉和2倍體積的預冷無水乙醇混勻，室溫沉淀 2min, 12000 X g 離心 IOmin,去上清；
F.沉淀用800 μ L預冷的75%乙醇洗漆一次后12000 X g,離心5min ；
G.小心倒掉上清液，離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉，室溫干燥 2_3min ；
H.將干燥后的沉淀分別加入20 μ L去離水重新溶解，然后置于_20°C保存備用。
檢測
(I)雞組織滴蟲病病原的環介導等溫擴增
在裝有24 μ L反應液A的PCR反應管中分別加入I μ L上述制得的待檢陽性樣品處理液、正常肝臟組織處理液以及滅菌去離子水，作為陽性對照、陰性對照以及空白對照， 混勻離心，將IyL的反應液B分別滴在PCR管蓋內側中間，蓋緊管蓋(小心操作，以防顯色液墜入反應混合液中)，于60-65°C恒溫水浴箱中放置60min ；
(2)擴增產物的顯色檢測
顛倒PCR管數次，使反應混合液與反應液B充分混合，觀察反應液顏色，根據反應液的顏色變化肉眼判斷檢測結果。陽性對照顏色變為綠色，表明樣品中含有火雞組織滴蟲。陰性對照以及空白對照顏色為黃色，說明不含有火雞組織滴蟲。檢測試驗結果如圖I。
實施例3 火雞組織滴蟲LAMP檢測方法靈敏度試驗
取含有火雞組織滴蟲特異基因的質粒DNA，按10倍比稀釋作為LAMP檢測試驗模板，使每μ L稀釋液中含有模板基因拷貝數分別為108，107，106，105，104，103，102，10，1 ;
在裝有24 μ L反應液A的PCR反應管中分別加入I μ L上述基因組稀釋液，同時設置不加質粒DNA的空白對照,混勻離心,將I μ L的反應液B滴在PCR管蓋內側中間,蓋緊管蓋于60-65 °C恒溫水浴箱中放置60min ；
顛倒PCR管數次，使反應混合液與反應液B充分混合，肉眼觀察反應液顏色，結果顯示加有質粒DNA的反應管變為綠色，對照管顏色為黃色，說明該試劑盒的檢測靈敏度至少為I個基因拷貝。
權利要求
1.一種雞組織滴蟲病LAMP檢測試劑盒，包括以下成分 (1)反應液A以每管24PL計，為2.5PL 10 X等溫反應緩沖液、I. Ομ 8U/^L Bst DNA聚合酶、2. 5μ IOmM (1ΝΤΡ、2μ1 25mM MgCl2、 μ 四種引物混合液、3. Ομ 5Μ甜菜堿、12μ 去離子水； 其中，IOX等溫反應緩沖液含有200mM pH 8. 8三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽，IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1% pH8. 8曲拉通X-100 ； 四種引物混合液含有17. 5μ 200μΜ內引物1、17. 5μ 200μΜ內引物2、70μ ΙΟΟμΜ外引物1、70μ ΙΟΟμΜ外引物2、175μ 去離子水； 內引物 I 為GAGCCCATGAACTATTGATTTCTCTAGTTCCTACCTTAAACTATGCC內引物 2 為CTACGACCGCAAGGCTGAAATTAAGCCACAAGCTCCAC外引物 I 為GTATCCAACCGGATCAGAG外引物 2 為AAGTTTCCCCGTGTTGAT (2)反應液B:1000X的熒光染料SYBR Green I。
全文摘要
本發明涉及一種用環介導等溫擴增(LAMP)技術快速檢測火雞組織滴蟲的試劑盒。本發明含有10×等溫反應緩沖液、BstDNA聚合酶8000U/mL、l0mMdNTP、25mMMgCl2、200μM內引物、200μM內引物2、l00μM外引物1、100μM外引物2、5M甜菜堿和去離子水的反應液A、反應液B(1000X的熒光染料SYBRGreenⅠ)。通過對雞肝臟組織樣品中DNA提取、火雞組織滴蟲的環介導等溫擴增、擴增產物的顯色檢測，從而檢測出火雞組織滴蟲。解決了現有技術時間長、工作量大、操作復雜等缺陷。本發明具有特異性強、靈敏度高、快速且成本低、操作方法更簡單，適于現場快速檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102925584SQ20121049483
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月28日 優先權日2012年11月28日
發明者許金俊, 曲昌寶, 陶建平, 劉聰, 劉丹丹, 曹李琴, 侯照峰, 宿世杰, 郭平, 李聰, 張祖航 申請人:揚州大學