專利名稱：快速鑒定小菜蛾魚尼丁受體基因突變的方法及其專用引物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種快速鑒定小菜蛾魚尼丁受體基因突變的方法及其專用引物。
背景技術：
小菜蛾(Plutella xylostella)屬于鱗翅目菜蛾科，英文名為“Diamondbackmoth”，是一種對十字花科植物危害極大的害蟲，全國各地均有分布，在我國南方地區常年造成嚴重危害。目前對小菜蛾的防治仍以化學農藥為主，由于殺蟲藥劑的不合理使用及小菜蛾本身的生物學特性，導致其對幾乎所有常用殺蟲劑均產生了抗性。以氯蟲苯甲酰胺和氟蟲雙酰胺為代表品種的雙酰胺類殺蟲劑對鱗翅目害蟲有很好的防治效果。其作用機制獨特，通過激活昆蟲魚尼丁受體，導致細胞質鈣庫中的鈣離子大量釋放，引起肌肉強烈收縮，從而使害蟲立即停止取食，活動能力減弱，肌肉癱瘓最終導致死亡。氯蟲苯甲酰胺自2008年在中國正式登記后，很快被大面積用于防治包括小菜蛾在內的多種鱗翅目害蟲。但2010年就已經發現廣州田間小菜蛾種群對該藥產生了數十倍的抗性，2011年更發現抗性高達2000多倍。

發明內容
本發明的目的是提供一種快速鑒定小菜蛾魚尼丁受體基因突變的方法及其專用引物。本發明提供了一種特異引物組合物，由序列表的序列I所示單鏈DNA分子、序列表的序列2所不單鏈DNA分子和序列表的序列3所不單鏈DNA分子組成。本發明還保護所述特異引物組合物在制備試劑盒中的應用；所示試劑盒的用途為如下(a)或(b): (a)鑒定小菜蛾是否發生了魚尼丁受體基因的G4899E突變；所述魚尼丁受體基因的G4899E突變指的是魚尼丁受體基因的開放閱讀框自5’末端第14696位核苷酸由G突變為A ； (b)輔助鑒定小菜蛾對雙酰胺類殺蟲劑的抗性。所述雙酰胺類殺蟲劑可為氯蟲苯甲酰胺和/或氟蟲雙酰胺。本發明還保護包括所述特異引物組合物的試劑盒；所示試劑盒的用途為如下(a)或(b): (a)鑒定小菜蛾是否發生了魚尼丁受體基因的G4899E突變；所述魚尼丁受體基因的G4899E突變指的是魚尼丁受體基因的開放閱讀框自5’末端第14696位核苷酸由G突變為A ;(b)輔助鑒定小菜蛾對雙酰胺類殺蟲劑的抗性。所述雙酰胺類殺蟲劑可為氯蟲苯甲酰胺和/或氟蟲雙酰胺。本發明還保護所述特異引物組合物的應用，為如下(a)或(b):(a)鑒定小菜蛾是否發生了魚尼丁受體基因的G4899E突變；所述魚尼丁受體基因的G4899E突變指的是魚尼丁受體基因的開放閱讀框自5’末端第14696位核苷酸由G突變為A ; (b)輔助鑒定小菜蛾對雙酰胺類殺蟲劑的抗性。所述雙酰胺類殺蟲劑可為氯蟲苯甲酰胺和/或氟蟲雙酰胺。本發明還保護一種鑒定小菜蛾針對G4899E突變的基因型的方法，包括以下步驟以待測小菜蛾的基因組DNA為模板，分別采用敏感引物對和抗性引物對進行PCR擴增；如果采用所述敏感引物對時擴增得到了 70±5bp (如70bp)的擴增產物同時采用所述抗性引物對時沒有擴增得到70±5bp (如70bp)的擴增產物，待測小菜蛾為GG基因型；如果采用所述抗性引物對時擴增得到了 70±5bp (如70bp)的擴增產物同時采用所述敏感引物對時沒有擴增得到70±5bp (如70bp)的擴增產物，待測小菜蛾為AA基因型；如果采用所述敏感引物對時擴增得到了 70±5bp(如70bp)的擴增產物且采用所述抗性引物對時擴增得到70±5bp(如70bp)的擴增產物，待測小菜蛾為GA基因型；所述敏感引物對由序列表的序列I所示單鏈DNA分子和序列表的序列3所示單鏈DNA分子組成；所述抗性引物對由序列表的序列2所示單鏈DNA分子和序列表的序列3所示單鏈DNA分子組成；所述G4899E突變指的是魚尼丁受體基因的開放閱讀框自5’末端第14696位核苷酸由G突變為A。GG基因型的小菜蛾疑似對雙酰胺類殺蟲劑敏感。AA基因型的小菜蛾疑似對雙酰胺類殺蟲劑具有抗性。GA基因型的小菜蛾疑似對雙酰胺類殺蟲劑敏感。AA基因型的小菜蛾對于雙酰胺類殺蟲劑的抗性聞于GG基因型的小采蛾和GA基因型的小采蛾。本發明還保護一種輔助鑒定小菜蛾對雙酰胺類殺蟲劑的抗性的方法，包括以下步驟以待測小菜蛾的基因組DNA為模板，分別采用敏感引物對和抗性引物對進行PCR擴增；如果采用所述敏感引物對時擴增得到了 70±5bp (如70bp)的擴增產物同時采用所述抗性·引物對時沒有擴增得到70±5bp (如70bp)的擴增產物，待測小菜蛾疑似對雙酰胺類殺蟲劑敏感；如果采用所述抗性引物對時擴增得到了 70±5bp (如70bp)的擴增產物同時采用所述敏感引物對時沒有擴增得到70±5bp (如70bp)的擴增產物，待測小菜蛾疑似對雙酰胺類殺蟲劑具有抗性；如果采用所述敏感引物對時擴增得到了 70±5bp (如70bp)的擴增產物且采用所述抗性引物對時擴增得到70±5bp (如70bp)的擴增產物，待測小菜蛾疑似對雙酰胺類殺蟲敏感；所述敏感引物對由序列表的序列I所示單鏈DNA分子和序列表的序列3所示單鏈DNA分子組成；所述抗性引物對由序列表的序列2所示單鏈DNA分子和序列表的序列3所示單鏈DNA分子組成。所述雙酰胺類殺蟲劑可為氯蟲苯甲酰胺和/或氟蟲雙酰胺。所述對雙酰胺類殺蟲劑敏感指的是待測小菜蛾對雙酰胺類殺蟲劑的LC5tl值低于O. lmg/L。所述對雙酰胺類殺蟲劑具有抗性指的是待測小菜蛾對雙酰胺類殺蟲劑的LC5tl值高于O. lmg/L、高于lmg/L、高于10mg/L或高于38mg/L。以上任一所述小菜蛾的魚尼丁受體基因的開放閱讀框可為如下如下I)或2)或3)的DNA分子I)序列表中序列4自5’末端第313至15666位核苷酸所不的DNA分子；2)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子;3)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子。上述嚴格條件可為在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65° C下雜交，然后用2XSSC、0. 1%SDS 和 I XSSC,O. 1%SDS 各洗膜一次。本發明提供的特異引物組合物能夠有效鑒定出小菜蛾是否發生了魚尼丁受體基因的G4899E突變，從而判斷小菜蛾對于雙酰胺類殺蟲劑的抗性或敏感性，具有快速有效、靈敏度高、能處理大批樣本的優點，對于監測小菜蛾田間種群對雙酰胺類殺蟲劑的抗性基因頻率和對雙酰胺類殺蟲劑抗藥性發生發展動態，及時調整小菜蛾防治策略，指導合理用藥、延緩抗性發展具有重要意義。


圖I為以第一組小菜蛾的個體(氯蟲苯甲酰胺敏感型個體)為模板，分別采用敏感引物對或抗性引物對進行PCR擴增，PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2為以第二組小菜蛾的個體(氯蟲苯甲酰胺高抗型個體)為模板，分別采用敏感引物對或抗性引物對進行PCR擴增，PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗·方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。實施例I、分析對雙酰胺類殺蟲劑抗感性不同的小菜蛾個體的魚尼丁受體基因，從而發現并驗證魚尼丁受體基因G4899E突變與抗感性的關系對2011年采自廣東省廣州市田間的100個小菜蛾個體進行魚尼丁受體基因的PCR擴增及測序驗證。測序結果表明，小菜蛾的魚尼丁受體基因中存在一個SNP位點，即抗雙酰胺類殺蟲劑的小菜蛾的魚尼丁受體基因的開放閱讀框自5’末端起第14696位核苷酸由G突變為A，導致魚尼丁受體自N末端第4899位氨基酸殘基由甘氨酸(G)突變為谷氨酸(E)，即G4899E突變。小菜蛾的魚尼丁受體基因如序列表的序列4所示，其開放閱讀框為序列表的序列4自5’末端第313至15666位核苷酸。對隨機取樣的30個小菜蛾雙酰胺類殺蟲劑敏感品系和30個小菜蛾雙酰胺類殺蟲劑抗性品系的個體的魚尼丁受體基因進行測序，根據其G4899E突變進行基因分型，敏感品系個體全部為敏感純合個體(SS)，抗性品系個體全部為抗性純合個體(RR)。對菲律賓和泰國雙酰胺類殺蟲劑抗性小菜蛾的研究證明，抗性種群中魚尼丁受體白N末端第4899位氨基酸殘基由甘氨酸突變為谷氨酸(G4899E突變)是導致其產生高倍抗性的主要機制。發生G4899E突變的純合個體為雙酰胺類殺蟲劑高抗型，未發生G4899E突變的純合個體為雙酰胺類殺蟲劑敏感型，雜合型個體為雙酰胺類殺蟲劑敏感型。實施例2、引物設計基于實施例I的發現，設計等位基因特異性PCR引物如下引物I (序列表的序列 I) :5’ -TGTTGGACGTGGCTGT § GGSf ；引物2 (序列表的序列 2) :5’ -TGTTGGACGTGGCTGT § GA~3f ；引物3 (序列表的序列 3) :5’ -TGTTTCCCGTTATGCGTGAC-3’。引物I為專用敏感引物，引物2為專用抗性引物，引物3為PCR檢測時與專用敏感引物或專用抗性引物配套使用的下游引物。引物I的3’末端第I位核苷酸(見下劃線標注)與突變前的核苷酸一致，引物2的3’末端第I位核苷酸(見下劃線標注)與突變后的核苷酸一致。此外，為了增加等位基因特異性PCR方法的特異性，引物I和引物2的3’端末第三位核苷酸均引入了錯配堿基A(見方框標注)。引物I和引物3組成敏感引物對。引物2和引物3組成抗性引物對。實施例3、敏感引物對和抗性引物對的應用 一、檢測小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺的抗性檢測小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺的抗性的方法如下I、將氯蟲苯甲酰胺原藥(純度95%，上海杜邦農化有限公司)溶于丙酮，配成10000mg/L的母液(濃度以有效成分計)。2、用O. Ig/1OOmL的Triton X-100水溶液將步驟I的母液稀釋成系列濃度的稀釋液。3、將清洗干凈并去除表面蠟質的圓白菜葉片在步驟2得到的稀釋液中浸泡10秒，然后在室溫條件下懸掛晾干，然后放入墊有濾紙的塑料培養皿中(直徑9em)，每個培養皿接入3齡末期的小菜蛾幼蟲10-15頭，每個濃度的稀釋液設置3個培養皿進行試驗，96小時后檢測幼蟲的死亡率。死亡標準為用毛筆輕觸蟲體無反應判定為死亡。所得數據用P0L0軟件(LeOra Software Inc. , Calilornia, USA)計算斜率值、LC5tl值及其95%的置信區間。將兩組小菜蛾群體分別進行上述鑒定，第一組小菜蛾群體為實驗室連續傳代飼養10年的未接觸過任何殺蟲藥劑的小菜蛾，第二組小菜蛾群體為從連續3年使用氯蟲苯甲酰胺的田間采集的小菜蛾，小菜蛾個體均隨機取樣。兩組小菜蛾群體對氯蟲苯甲酰胺的抗性檢測結果見表I。表I兩組小菜蛾群體對氯蟲苯甲酰胺的抗性檢測結果
權利要求
1.特異引物組合物，由序列表的序列I所示單鏈DNA分子、序列表的序列2所示單鏈DNA分子和序列表的序列3所不單鏈DNA分子組成。
2.權利要求I所述特異引物組合物在制備試劑盒中的應用；所示試劑盒的用途為如下Ca)或(b) Ca)鑒定小菜蛾是否發生了魚尼丁受體基因的G4899E突變；所述魚尼丁受體基因的G4899E突變指的是魚尼丁受體基因的開放閱讀框自5’末端第14696位核苷酸由G突變為A ； (b)輔助鑒定小菜蛾對雙酰胺類殺蟲劑的抗性。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述雙酰胺類殺蟲劑為氯蟲苯甲酰胺和/或氟蟲雙酰胺。
4.包括權利要求I所述特異引物組合物的試劑盒；所示試劑盒的用途為如下(a)或(b) Ca)鑒定小菜蛾是否發生了魚尼丁受體基因的G4899E突變；所述魚尼丁受體基因的G4899E突變指的是魚尼丁受體基因的開放閱讀框自5’末端第14696位核苷酸由G突變為A ； (b)輔助鑒定小菜蛾對雙酰胺類殺蟲劑的抗性。
5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述雙酰胺類殺蟲劑為氯蟲苯甲酰胺和/或氟蟲雙酰胺。
6.權利要求I所述特異引物組合物的應用，為如下(a)或(b) Ca)鑒定小菜蛾是否發生了魚尼丁受體基因的G4899E突變；所述魚尼丁受體基因的G4899E突變指的是魚尼丁受體基因的開放閱讀框自5’末端第14696位核苷酸由G突變為A ； (b)輔助鑒定小菜蛾對雙酰胺類殺蟲劑的抗性。
7.如權利要求6所述的應用，其特征在于所述雙酰胺類殺蟲劑為氯蟲苯甲酰胺和/或氟蟲雙酰胺。
8.一種鑒定小菜蛾針對G4899E突變的基因型的方法，包括以下步驟以待測小菜蛾的基因組DNA為模板，分別采用敏感引物對和抗性引物對進行PCR擴增；如果采用所述敏感引物對時擴增得到了 70±5bp的擴增產物同時采用所述抗性引物對時沒有擴增得到70±5bp的擴增產物，待測小菜蛾為GG基因型；如果采用所述抗性引物對時擴增得到了 70±5bp的擴增產物同時采用所述敏感引物對時沒有擴增得到70±5bp的擴增產物，待測小菜蛾為AA基因型；如果采用所述敏感引物對時擴增得到了 70±5bp的擴增產物且采用所述抗性引物對時擴增得到70±5bp的擴增產物，待測小菜蛾為GA基因型； 所述敏感引物對由序列表的序列I所示單鏈DNA分子和序列表的序列3所示單鏈DNA分子組成；所述抗性引物對由序列表的序列2所示單鏈DNA分子和序列表的序列3所示單鏈DNA分子組成； 所述G4899E突變指的是魚尼丁受體基因的開放閱讀框自5’末端第14696位核苷酸由G突變為A。
9.一種輔助鑒定小菜蛾對雙酰胺類殺蟲劑的抗性的方法，包括以下步驟以待測小菜蛾的基因組DNA為模板，分別采用敏感引物對和抗性引物對進行PCR擴增；如果采用所述敏感引物對時擴增得到了 70±5bp的擴增產物同時采用所述抗性引物對時沒有擴增得到70±5bp的擴增產物，待測小菜蛾疑似對雙酰胺類殺蟲劑敏感；如果采用所述抗性引物對時擴增得到了 70±5bp的擴增產物同時采用所述敏感引物對時沒有擴增得到70±5bp的擴增產物，待測小菜蛾疑似對雙酰胺類殺蟲劑具有抗性；如果采用所述敏感引物對時擴增得到了 70±5bp的擴增產物且采用所述抗性引物對時擴增得到70±5bp的擴增產物，待測小菜蛾疑似對雙酰胺類殺蟲敏感； 所述敏感引物對由序列表的序列I所示單鏈DNA分子和序列表的序列3所示單鏈DNA分子組成；所述抗性引物對由序列表的序列2所示單鏈DNA分子和序列表的序列3所示單鏈DNA分子組成。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于所述雙酰胺類殺蟲劑為氯蟲苯甲酰胺和/或氟蟲雙酰胺。
全文摘要
本發明公開了一種快速鑒定小菜蛾魚尼丁受體基因突變的方法及其專用引物。本發明提供了一種特異引物組合物，由序列表的序列1所示單鏈DNA分子、序列2所示單鏈DNA分子和序列3所示單鏈DNA分子組成。所述特異引物組合物可用以如下(a)或(b)(a)鑒定小菜蛾是否發生了魚尼丁受體基因的G4899E突變；所述魚尼丁受體基因的G4899E突變指的是魚尼丁受體基因的開放閱讀框自5’末端第14696位核苷酸由G突變為A；(b)輔助鑒定小菜蛾對雙酰胺類殺蟲劑的抗性。本發明提供的特異引物組合物及其應用對于監測小菜蛾田間種群對雙酰胺類殺蟲劑的抗性基因頻率和對雙酰胺類殺蟲劑抗藥性發生發展動態，及時調整小菜蛾防治策略，指導合理用藥、延緩抗性發展具有重要意義。
文檔編號C12Q1/68GK102952889SQ20121053754
公開日2013年3月6日 申請日期2012年12月12日 優先權日2012年12月12日
發明者梁沛, 郭磊, 高希武, 史雪巖, 宋敦倫 申請人:中國農業大學