專利名稱：食品及飲料中杏成分實時熒光pcr鑒定方法
技術領域：
本發明屬于食品質量控制領域，具體涉及一種食品及飲料中杏成分實時熒光PCR鑒定方法。
背景技術：
杏普遍栽培于世界溫帶地區，杏原產中國，遍植于中亞、東南亞及南歐和北非的部分地區。杏肉除了供人們鮮食之外，還可以加工制成杏脯、糖杏罐頭、杏干、杏汁、杏酒、杏青梅、杏話梅、杏丹皮等；杏仁可以制成杏仁霜、杏仁露、杏仁酪、杏仁醬、杏仁點心、杏仁醬菜
坐寸ο近年來，不斷有媒體曝光，一些商家所售賣的杏加工產品(如杏仁露、杏仁飲料等)，其價格明顯比商場里的要低很多，甚至比成本價還低。實際上是一些不法商家由于某些杏的成本較高，為了更多的經濟利益，便會用假貨冒充成本較高的真貨銷售欺騙消費者，或者在不加入杏成分的前提下，虛假標注產品中含有杏成分。由于國家質監面臨無法可依的窘境。也尚無權威的鑒定機構可以對食品或飲料中的杏成分進行鑒定。隨著近年來，人們對食品的安全衛生特別重視，食品衛生指標尤其是杏產品中是否真正含有杏等原料的真偽鑒定就顯得特別重要。為了盡量減輕假杏產品的不良影響，力求避免人民的合法利益受到侵害，而造成更加不利的影響。由此，急需一種食品及飲料中杏成分簡便、快速的檢測方法。目前我國在食品及飲料中杏成分檢測方法仍是個空白，在保證方法穩定性、特異性等方面存在很多困難，這也是制約方法建立的瓶頸。

發明內容
為了解決上述實際問題，本發明建立了一種食品、飲料中杏成分檢測方法研究，進行杏制品檢測技術研究。采用TaqMan探針技術，能夠對食品或飲料中的杏成分成份進行鑒定。該標準的研制成功及推廣應用對提高進出口食品及飲料中的杏成分成份的檢測效率及靈敏度，降低檢測成本，檢測市場上相關假冒產品，進行食品安全監測和提高檢驗技術具有
重要意義。本發明從以下幾個方面研究提取樣品DNA，以DNA為模板，分別采用杏品種的特異性檢測引物和探針進行實時熒光PCR擴增，直接讀取實時熒光PCR的增幅現象，進行食品和原料中杏成分及其制品的鑒偽檢測等，在此基礎上，進行了特異性和穩定性檢測；本發明的具體技術方案如下本發明所述的杏(Armeniaca vulgaris)為蓄薇科(Rosaceae)李亞科(Prunoideae)杏屬植物(Arm eniaca M ill.)。 全世界杏屬植物劃分為6個地理生態群和24個區域性亞群,共有10個種。中國有普通杏(A rm eniaca vulgaris Lam·)、西伯利亞杏 A. sibirica(L. ) Lam> 遼杏 A. mandshurica(Maxim. ) Skv.、藏杏 A. holosericea(Betal.)Kost.、紫杏 A. dasy2 carpa(Ehrh. )Borkh. > 志丹杏(A. zhidanensis) C. Ζ· Qiao、梅(A. mume) Sieb.、政和杏(A. zhengheensis) ZhangJ. Y. etLuM. N 與李梅杏(A.1im eisis)Zhang J. Y. etffang Z. M 這 9 個種。本發明的一方面在于公開一種杏成分檢測用引物與探針，其包括以下堿基序列杏成分檢測引物和探針的設計針對杏核糖體18S rRNA基因序列設計檢測用引物與探針。通過GenBank的Blast功能尋找杏核糖體18S rRNA基因(Genebank登錄號普通杏AF318756. 1，西伯利亞杏AF318739. 1，遼杏AF318714.1)的同源基因，可見該基因具有很高的種屬特異性，其他基因與該基因的同源性很小。據此設計了本發明用于檢測的杏成分的檢測引物和探針如下杏成分檢測引物和探針上游引物5’-TCTGCCTCAACCGATA-3’SEQ ID NO I下游引物5’ -GGCGAACACGAAGAA-3’SEQ ID NO 2探針FAM-5，-CTGTCTCTGCCTATGCCTCCA-3，-TAMRASEQ ID NO 3其中FAM( Carboxyfluorescein,竣基突光素)、TAMRA(CarboxytetramethyIrhodamine,羧基四甲基羅丹明)；本發明的另一方面在于一種杏成分檢測試劑盒，其包括上文所述的杏成分檢測用引物與探針。本試劑盒中還可以包括陽性對照、陰性對照、空白對照。其中，陽性對照可以選擇杏提取的DNA，內參照可以選擇真核生物ISSrRNA基因DNA，陰性對照可以選擇不含有杏成分的樣品提取的DNA，空白對照可以選擇滅菌水，也可以每組各設置兩個或多個平行的反應體系。其中，質量控制標準為以下條件有一條不滿足時，實驗視為無效(a)空白對照無熒光對數增長，相應的Ct值〉40. O。(b)陰性對照無熒光對數增長，相應的Ct值〉40. O。(c)陽性對照有熒光對數增長，且熒光通道出現典型的擴增曲線，相應的Ct值
<30. O。(d)內參照有熒光對數增長，且熒光通道出現典型的擴增曲線，相應的Ct值
<30. O結果判定標準為在符合質量控制標準的情況下，被檢樣品進行檢測時如Ct值(35. 0，則判定為被檢樣品陽性。如Ct值> 40. 0，則判定為被檢樣品陰性。如35. O < Ct值< 40. 0，則重復一次。如再次擴增后Ct值仍為< 40. 0，則判定被檢樣品陽性；如再次擴增后Ct值> 40. 0，則判定被檢樣品陰性。本發明的另一方面在于一種杏成分及其制品的實時熒光PCR鑒偽方法，其利用上文所述的引物與探針，對樣品DNA進行實時熒光PCR方法檢測。對于上文所述的杏成分及其制品的實時熒光PCR鑒偽方法，所述的實時熒光PCR方法較優的選擇如下①實時熒光PCR反應體系反應體系總體積為25 μ L，其中
權利要求
1.一種杏成分檢測用引物與探針，其特征在于，包括以下堿基序列上游引物SEQ ID NO.1下游引物SEQ ID NO. 2探針 SEQ ID NO. 3。
2.一種杏成分實時熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于包括權利要求1所述杏成分檢測用引物與探針。
3.一種杏成分及其制品的實時熒光PCR鑒偽方法，其特征在于利用權利要求1所述的引物與探針，對樣品DNA進行實時熒光PCR方法檢測。
4.根據權利要求3所述的杏成分及其制品的實時熒光PCR鑒偽方法，其特征在于利用權利要求1所述的引物，分別對樣品按下述方法進行實時熒光PCR檢測①實時熒光PCR反應體系反應體系總體積為25 μ L，其中濃度為 IO pg/mL-100 pg/mL 的樣品 DNA2 pL.10pmol/L.1:+K游屮物各 ΙμΙ.5 μηιοΙ/L 探針I μ .5 U/pL Taq DNA 聚介_0.5 pL.10 μηιοΙ/L dNTPI pLIOxPCR 緩沖液2.5 pL水16 μ ②實時熒光PCR反應參數95°C，10s，l 個循環；95°C，5s ；52°C,10s ;72°C，34s ;40個循環。
全文摘要
本發明公開了一種杏成分檢測用引物與探針、其使用方法及應用。該方法針對杏核糖體18S rRNA基因序列，設計了杏基因的檢測用引物和探針，采用實時熒光PCR法對食品及飲料中杏成分的定性檢測。本發明所研制的食品及飲料中杏成分的實時熒光PCR法定性檢測方法、對提高食品中杏成分的檢測效率及靈敏度，降低檢測成本，檢測市場上相關假冒產品，進行食品安全監測和提高檢驗技術具有重要意義，具有廣闊發展前景。
文檔編號C12Q1/68GK103031377SQ20121054364
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月14日 優先權日2012年12月14日
發明者鄭秋月, 簡中友, 姜麗, 曹際娟 申請人:鄭秋月, 簡中友, 姜麗, 曹際娟