專利名稱：一種蠟蚧菌發酵生產蛋白酶的培養基及方法
技術領域：
本發明涉及真菌的發酵培養基及工藝。更具體地，本發明涉及一種蠟蚧菌{LecaniciIlium)發酵生產蛋白酶的培養基及方法。
背景技術：
蛋白酶是一類可以催化蛋白質水解反應的酶，它廣泛存在于各種生物體中，不僅對生物體蛋白質的新陳代謝起調節作用，從細胞水平、器官水平和機體水平，呈現多種多樣的功能。它們參與細胞的正常生理以及異常的病理條件下的諸如蛋白質水解、細胞生長和遷移、酶原激活、激素釋放等各種復雜的過程(汪章勛等，2005)。蛋白酶在食品、化工、醫療、農業、環保等許多方面發揮重要的作用，例如可用做生物農藥的蟲生真菌，其蛋白酶活力與其毒力密切相關(Paoletti M, 200)。
臘階菌cillium)隸屬絲孢菌類(Hyphomycetes),廣泛分布于熱帶、亞熱帶和溫帶，能寄生蚧類、蚜蟲類、螨類和粉虱，還可寄生鱗翅目的一些害蟲及線蟲、薊馬等。20世紀70年代以來，歐洲一些國家及美國、日本等國對利用蠟蚧菌防治溫室蔬菜害蟲給予極大重視。用蠟蚧菌發酵生產蛋白酶酶可為將來真菌防治害蟲的深入研究提供科學依據。昆蟲的體壁主要是由蛋白基質和分布其中的幾丁質組成，蛋白質的類型和數量在不同種類的昆蟲組織和生長階段中是不斷變化的，為了能穿透這種復雜而多變的結構，昆蟲病原真菌能分泌一系列不同的體壁降解酶類，包括脂酶、幾丁質酶、蛋白酶等(楊曉昱等，2005)?？僧a生蛋白酶的微生物種類尤其多，包括細菌、真菌和病毒。由于微生物蛋白酶比植物蛋白酶和動物蛋白酶更容易獲得，而且微生物蛋白酶來源豐富。所以，微生物蛋白酶越來越成為近年來蛋白酶的研究熱點。

發明內容
本發明的目的在于提供一種蠟蚧菌發酵生產蛋白酶的培養基及方法。本發明首先提供了一種蠟蚧菌發酵生產蛋白酶的培養基，所述培養基的原料含有麥芽糖或葡萄糖10g/L，蛋白胨或酵母粉10g/L，Fe2+或Mg2+4X Krtiol/L，Vb6或VeO. lg/L，培養基初始PH= 6. 0-9. O。更優選地，所述培養基的原料含有麥芽糖10g/L，蛋白胨I Og/L，Mg2+4X10_4mol/L，VB6 0.1 g/L，培養基初始 pH= 6. O。本發明還提供了一種蠟蚧菌發酵產蛋白酶的方法，所述方法包含以下步驟
(a)將蠟蚧菌接種種子培養基，制得發酵種子液；
(b)將步驟(a)中制得的發酵種子液按接種于權利要求1或2所述的培養基，250mL的三角瓶裝液量為IOOmL,接種量5mL，于26°C，轉速160 r/min下培養。所述種子培養基的原料配方為200g/L土豆,葡萄糖20g/L,其余為水，自然pH。本發明采用的蠟蚧菌為蠟蚧菌Z.1ecanii FJ28 (邱君志等，金屬離子對蠟蚧菌幾丁質酶活力的影響，激光生物學報，2009年2月)。
采用本發明優化后的培養基，菌齡7d，發酵周期5d，發酵產生結果蠟蚧菌FJ28產蛋白酶為50U/mL以上。本發明的發酵方法有發酵周期短；條件溫和，易于控制；提供的用于蠟蚧菌發酵生產蛋白酶的培養基，具有蛋白酶產率高，蛋白酶活力高等優點。


圖1酪氨酸溶液的標準曲線。圖2碳源對產蛋白酶的影響。圖3氮源對產蛋白酶的影響。
具體實施例方式本發明用下列實施例來進一步說明本發明，但本發明的保護范圍并不限于下列實施例。實施例1
單因素實驗確定培養基最優成分 (I)種子培養基和基礎培養基配制
(a)20% 土豆汁1L，葡萄糖20g，自然pH。分裝于250mL的三角瓶，每個三角瓶含150mL。1. OlMPa，滅菌20min。使用前可加入抗生素對培養基預處理。(b)基礎培養基(液體誘導培養基)0. 5% 明膠、1. l%Na2HP04° 12H20、1. 2%NaH2P04。2H20^ pH6. 50(2)發酵種子的制作將蠟蚧菌FJ28接種于馬鈴薯瓊脂培養基上，于26°C下培養5d，待其產孢子，即活化；將活化后的菌株用接種針將孢子粉接種至種子培養基，26°C，轉速160 r/min下培養10d，即為發酵液。(3)酶液的制備取步驟(2)下的發酵液在4°C下，5000 r/min離心，15min，得上清液即為粗酶液待用。按酶活性測定在波長275nm處的吸光值。換算成酶活單位U/mL。(4)蛋白酶酶活測定取Iml酶液在60°C水浴5min，加入三氯乙酸搖勻，將其放入40°C水浴IOmin,再加酪素Iml靜置IOmin過濾,定容至IOml,作為對照。再取Iml酶液加酪素Iml在40°C水浴IOmin,加入三氯乙酸2ml搖勻靜置IOmin過濾,定容至IOml,在275nm波長下測紫外吸光度。酶活力(U/g或U/mL) =AXKXVXn/(tXm) (A為樣品的吸光度；K為吸光常數為反應試劑的總體積；n為酶液的稀釋倍數；t為反應時間；m為酶液質量或體積，g或mL)。(5)標準曲線的制作在0-100iig/mL范圍內，以275nm處的吸光值為橫坐標(X)、酪氨酸的濃度為縱坐標(Y)制定標準曲線。具體步驟如下
a.用超純水配置濃度為10、20、30、40、50、60、70、80、90和100 u g/mL的酪氨酸。b.測定反應液在275nm處的吸光值，在上述反應體系中以超純水取代酪氨酸為空白對照。試驗設置3個重復，其平均值用于制作標準曲線。結果見圖1。(6)不同碳源、氮源、維生素對產蛋白酶的影響
Ca)碳源對酶產量的影響，在基礎培養基中分別添加1%麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、麥麩、玉米粉、甘油、D-山梨醇、可溶性淀粉，接入相同的蠟蚧菌液，在26°C、160r/min的搖床中培養，每天檢測發酵液中蛋白酶活性。以基礎液體培養基的蛋白酶活力作為對照，根據實驗數據選擇對產酶最有利的碳源。結果見圖2。(b)氮源對酶產量的影響，在基礎培養基中分別添加1%的蛋白胨、酵母粉、NH4HCO3、KNO3、NH4Cl、Ca (NO3) 2、，接入相同的蠟蚧菌液，在26°C、160r/min的搖床中培養，每天檢測發酵液中蛋白酶活性。以基礎液體培養基的蛋白酶活力作為對照，根據實驗數據選擇對產酶最有利的氮源。結果見圖3。
實驗結果
添加不同碳源(麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、麥麩)均提高了酶活性。其中添加麥芽糖使殺蟲蠟蚧菌FJ28在接種后第2d就出現蛋白質酶高峰并且蛋白酶活性達到47. 92U/mL ;其次是添加葡萄糖的處理，在接種后第2d產酶達到30. 78U的高峰；添加葡萄糖、麥麩的處理相對前兩者其產酶活性要低點。因此，不同碳源對蠟蚧菌FJ28產酶量影響不同。由此可見，麥 芽糖是促進蠟蚧菌FJ28產蛋白酶的最佳碳源。在所添加的不同氮源中，添加蛋白胨的處理最有助于提高產酶水平，在接種后的第3d就出現產蛋白酶高峰，其酶活性達到16. 44U/mL，而添加酵母浸粉、KNO3等的處理都沒蛋白胨處理的酶活高。此外，從提升蛋白酶活性總體上看有機氮優于無機氮。據此，蛋白胨是提高蠟蚧菌FJ28產蛋白酶的最佳氮源。實施例2
正交實驗確定最優發酵條件 (I)正交實驗確定最佳培養基
在前期單因素實驗的基礎上，分別選取4種較適合該菌產蛋白酶的l%(w/v)碳源(麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、麥麩)、1%氮源(NH4HC03、酵母粉、蛋白胨、NH4Cl)、4X10_4mol/l金屬離子(Fe2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+)、0. 01% 維生素(VB1、Vb2、Ne、VB6)和 pH 值(6. O、7. O、8. O、9. 0)進行5因素4水平的正交實驗設計以篩選出最佳產酶培養基。不同組合的培養基接種后置于26°C、160r/min的搖床中培養，
接種后72 h測定其酶活力。為了避免累贅實施例中的培養基配法、粗酶液的制作、酶活測定方法均與實施例1的方法相同。表I蠟蚧菌FJ28蛋白酶五因子四水平(45)正交實驗設計1--1-!-!--1
!挨浪( A)SS (B) 金MS子(C)I
水乎pH值0E_|
I10g,.L j 10g:L I 4>.1IHmaIi 丨 I OPm安,1 j_. [
I I麥鼓 j XftHCO； i Fe:1 \'s I 6-0 _I1.:1 葡si [酵《&1:、ig> I v5；1-.0 n
3 I 歷糖 I 蛋白胨 I Zff-1 \.c I S.O
i 4 j 麥#IS I XH-Cl I Mn:-1 V5; I 9. D i
S_I_I_I_I_S_I
表2蠟蚧菌FJ28蛋白質酶五因子四水平(45)正交實驗結果
權利要求
1.一種蠟蚧菌發酵生產蛋白酶的培養基，其特征在于，所述培養基的原料含有麥芽糖或葡萄糖10g/L，蛋白胨或酵母粉10g/L，Fe2+或Mg2+4X ΙΟΛιοΙ/Ι，Vb6或VeO. lg/L，培養基初始 pH= 6. 0-9. O。
2.—種蠟蚧菌發酵生產蛋白酶的培養基，其特征在于，所述培養基的原料含有麥芽糖10g/L，蛋白胨 I Og/L，Mg2+4X lO-W/L，VB6 0.1 g/L，培養基初始 pH= 6. 0。
3.—種蠟蚧菌發酵產蛋白酶的方法，其特征在于，所述方法包含以下步驟 (a)將蠟蚧菌接種種子培養基，制得發酵種子液； (b)將步驟(a)中制得的發酵種子液按接種于權利要求1或2所述的培養基，250mL的三角瓶裝液量為IOOmL,接種量5mL，于26°C，轉速160 r/min下培養。
4.如權利3所述蠟蚧菌發酵產蛋白酶的方法，其特征在于，所述種子培養基的原料配方為200g/L 土豆,葡萄糖20g/L,其余為水，自然pH。
全文摘要
本發明涉及真菌的發酵培養基及工藝。更具體地，本發明涉及一種蠟蚧菌發酵生產蛋白酶的培養基及方法。所述培養基的原料含有麥芽糖或者葡萄糖1w%，蛋白胨或者酵母粉1w%，Fe2+或者Mg2+4×10-4mol/L，VB6或者VC0.01%，培養基初始pH=6.0-9.0。該方法通過將發酵種子液按接種于培養基，250mL的三角瓶裝液量為100mL，接種量5mL，于26℃，轉速160r/min下培養。本發明的發酵方法有發酵周期短；條件溫和，易于控制；提供的用于蠟蚧菌發酵生產蛋白酶的培養基，具有蛋白酶產率高，蛋白酶活力高等優點。
文檔編號C12N9/58GK103013963SQ201210543899
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月17日 優先權日2012年12月17日
發明者邱君志, 蘇禮超, 涂潔, 宋飛飛, 邱云鋒, 李小霞, 何肖云, 毛麗慧, 謝小聰, 張偉 申請人:福建農林大學