專利名稱：一種綠僵菌發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及真菌的發(fā)酵培養(yǎng)基及工藝。更具體地，本發(fā)明涉及一種綠僵菌 (Metarhizium anisopIiae)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基及方法。
背景技術(shù)：
脂肪酶(Lipase，E. C. 3.1.1. 3，甘油三酯水解酶)，可在油水界面催化甘油三酯形成甘油二酯、甘油單酯或甘油及游離脂肪酸脂肪酶是一類分解和合成脂肪的酶。脂肪酶不僅可以催化酯水解反應(yīng)還可以催化酯合成反應(yīng)和轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。微生物脂肪酶比動物脂肪酶酶解作用的PH和溫度范圍更寬，便于工業(yè)化生產(chǎn)獲得高純度酶制劑121。脂酶在微生物界分布很廣，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前已有65個(gè)屬的微生物能夠產(chǎn)生脂肪酶。隨著對微生物脂肪酶研究的深入，已發(fā)現(xiàn)多種具有不同的酶學(xué)性質(zhì)和底物特異性的微生物脂肪酶，其在水解、酯化、轉(zhuǎn)酯及酯類手性合成等反應(yīng)中都表現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景。
就微生物脂肪酶而言，由于脂肪酶的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的多樣性、酶的來源不足等問題， 脂肪酶的研究進(jìn)展及工業(yè)應(yīng)用與蛋白酶、淀粉酶相比要慢得多，窄得多。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種綠僵菌發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基及方法，該培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)的脂肪酶活力高，發(fā)酵方法的條件溫和，易于控制，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明首先提供了一種綠僵菌發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基的原料含有橄欖油 50. O g / L, K2 HPO41. O g / L, CaCl2 O.1 g / L, NaCl O. 5 g / L, Mg2SO4 · 7H20 O.1 g / L, (MM)2SO4LO g / L，葡萄糖 10. O g / L。
其次，本發(fā)明還提供了一種綠僵菌發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的方法，所述方法包含以下步驟(a)將綠僵菌接種種子培養(yǎng)基，制得發(fā)酵種子液；(b)將步驟(a)中制得的發(fā)酵種子液按接種于權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基，IOOmL的三角瓶裝液量為50mL，接種量10%，于25°C，轉(zhuǎn)速150 r/min下培養(yǎng)。
所述種子培養(yǎng)基的原料含有按培養(yǎng)基重量計(jì)，馬鈴薯20%，蔗糖2%，。
本發(fā)明采用的綠僵菌為綠僵菌MaYTTR-04 (何學(xué)友等，金龜子綠僵菌MaYTTR-04菌株對松墨天牛成蟲的致病力，昆蟲學(xué)報(bào)，2008年I月)。
采用本發(fā)明優(yōu)化后的培養(yǎng)基，發(fā)酵周期72h，發(fā)酵產(chǎn)生結(jié)果綠僵菌MaYTTR-04產(chǎn)脂肪酶為30U/mL以上。
本發(fā)明的發(fā)酵方法有發(fā)酵周期短；條件溫和，易于控制；提供的用于綠僵菌發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基，具有脂肪酶活力高(30U/mL)等優(yōu)點(diǎn)。


圖1為對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明用下列實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于下列實(shí)施例。
實(shí)施例1單因素實(shí)驗(yàn)確定培養(yǎng)基最優(yōu)成分(I)種子培養(yǎng)基配制馬鈴薯200. O g / L，蔗糖20.0 g / L，其余為水，分裝于250mL 的三角瓶，每個(gè)三角瓶含100mL。O.1MPa，滅菌20min。使用前可加入抗生素對培養(yǎng)基殺菌預(yù)處理。
(2)發(fā)酵種子的制作將綠僵菌MaYTTR-04接種于馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基上，于25°C 下培養(yǎng)7d，待其產(chǎn)孢子，即活化；將活化后的菌株用接種針將孢子粉接種至種子培養(yǎng)基， 25°C，轉(zhuǎn)速150 r/min下培養(yǎng)48h，即為發(fā)酵液。
(3)酶液的制備取步驟(2)下的發(fā)酵液在4°C下，5000 r/min離心，5min，得上清液即為粗酶液待用。按酶活性測定在波長410nm處的吸光值。換算成酶活單位U/mL。
(4)脂肪酶酶活測定在pH 8. 0、50 °C條件下，每min水解p-NPP釋放I μ mol對硝基苯酹(p-nitrophenol)所需的酶量為I個(gè)脂肪酶活力單位(U)。
方法溶液A 150 mg p-NPP溶于50 mL異丙醇；溶液B 500 mL pH 8. O的 Tris-HCl緩沖液中加入2. 22 g Triton X-100和0. 56 g阿拉伯膠。
取2個(gè)試管(分別是對照管和樣品管)，各加溶液B 2. 85 mL和底物溶液A 0.1 mL (緩慢混合，該溶液至少可穩(wěn)定2 h)。50 °C水浴中預(yù)熱5 min，然后在對照管中加入已滅活的酶液0.05 mL，樣品管中加入酶液0.05 mL，立即混勻計(jì)時(shí)。在水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)10 min時(shí)馬上測定410 nm下酶水解產(chǎn)生的p-nitrophenol的吸光度值(OD41t!值)。酶活計(jì)算公式A = CtA1 - A0] XK + C0) XV1XN / (V2Xt)A——樣品酶活(u/mL) A1——樣品的吸光度值(OD41tl值)A0——對照的吸光度值(OD41tl值校準(zhǔn)為0) K-p-nitrophenol標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，C0-p-nitrophenol標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距N-稀釋倍數(shù)V1-反應(yīng)液的體積(3 mL)V2——酶液的體積(0.05 mL) t——反應(yīng)時(shí)間(10 min)。
(5)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作(底物緩沖液指pH7. 5磷酸緩沖液，A+B)
權(quán)利要求
1.一種綠僵菌發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基的原料配方為橄欖油 O. 25-2 w%，蛋白胨 O. 05-0. 4 w%, ZnCl2 O. 0125-0.1 mo I / L,葉酸 O. 005-0. 04 w%, pH5. 0-6. 5，其余為水。
2.—種綠僵菌發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的方法，其特征在于，所述方法包含以下步驟(a)將綠僵菌接種種子培養(yǎng)基，制得發(fā)酵種子液；(b)將步驟(a)中制得的發(fā)酵種子液接種于權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，250mL的三角瓶裝液量為50mL，接種量10%，于25°C，轉(zhuǎn)速150 r/min下培養(yǎng)。
3.如權(quán)利2所述綠僵菌發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基的原料配方為按重量分?jǐn)?shù)計(jì)，馬鈴薯20%，蔗糖2%，余量為水。
全文摘要
本發(fā)明涉及真菌的發(fā)酵培養(yǎng)基及工藝。更具體地，本發(fā)明涉及一種綠僵菌發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基及方法。所述培養(yǎng)基的原料配方為橄欖油0.25-2w%，蛋白胨0.05-0.4w%，ZnCl20.0125-0.1mol/L，葉酸0.005-0.04w%，pH5.0-6.5，其余為水。該方法通過將發(fā)酵種子液接種于培養(yǎng)基，100mL的三角瓶裝液量為50mL，接種量10%，于25℃，轉(zhuǎn)速150r/min下培養(yǎng)。本發(fā)明的發(fā)酵方法有發(fā)酵周期短；條件溫和，易于控制；提供的用于綠僵菌發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基，具有脂肪酶產(chǎn)率高，脂肪酶活力高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12R1/645GK102994472SQ201210543900
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月17日
發(fā)明者邱君志, 林瑞珠, 蘇禮超, 涂潔, 宋飛飛, 邱云鋒, 李小霞, 郭慶豐, 何肖云, 毛麗慧 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)