專利名稱：一株釀酒酵母及其在干紅葡萄酒釀造中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于工業微生物技術領域，具體涉及一株釀酒酵母菌株及其在發酵特色優質干紅葡萄酒中的應用。
背景技術：
紅葡萄酒是以新鮮葡萄為原料經酵母發酵釀制而成的飲料酒。葡萄酒釀造是一個復雜的微生物學過程，其中由酵母菌主導的酒精發酵是葡萄酒生產最重要的階段之一。酵母菌的生物多樣性及微生物群體組成不僅對葡萄酒的風味、口感等感觀質量具有重要影響，而且會直接影響葡萄酒的產量、質量、經濟性及發酵性能管理，對葡萄酒的特色及風格形成有至關重要的影響。一株好的釀酒酵母菌株不但能提高葡萄酒品質，還能縮短發酵周期和降低生產成本，進而提高企業的競爭優勢和獲利能力。國內對葡萄酒酵母的研究和生產起步較晚，我國果酒用商業酵母的研究開發，以始于1986年的安琪酵母為代表，但由于產品種類少，專業化程度遠遠不能滿足生產需求，因而在葡萄酒行業應用很少。目前國內葡萄酒行業大多使用進口葡萄酒活性干酵母進行生產，多來自歐美等國，價格昂貴。長期使用進口葡萄酒活性干酵母進行葡萄酒生產，不僅讓企業和國家損失大量外匯，更為重要的是會影響中國本土區域化特色葡萄釀酒酵母菌的生物多樣性，對自然發酵菌種產生相當的抑制作用，使得由自然發酵產生的風味和香氣物質消失，最終導致產品的同質化，缺乏地域特征。因此，加強我國本土葡萄酒酵母菌資源的開發與利用，進行中國原產地葡萄酒相關酵母及野生葡萄酒酵母的研究，選育適合中國各區域葡萄原料發酵的特色葡萄酒酵母，對于生產具有中國本土地區特色的優質葡萄酒，創造中國特色的地方名牌葡萄酒(形成葡萄酒中的“茅臺、五糧液、西鳳”)，促進中國葡萄酒產品差異特色化及中國葡萄酒特質文化的形成；打破國外葡萄酒輔料商壟斷中國市場，降低葡萄酒生產成本，促進我國葡萄酒產業的健康發展具有十分重要的意義。

發明內容
本發明的目的是提供一株適用于中國各地區紅葡萄原料發酵的特色釀酒酵母菌株。該菌株也可用于藍莓酒、棗酒等各種特色高端果露酒及各種普通果酒的釀造。本發明一方面提供了一種釀酒酵母WRl 104(Saccharomyces cerevisiaeffR1104),于2012年12月5日保藏在位于武漢市珞珈山武漢大學的中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為 CCTCC NO:M 2012500。本發明一方面提供了上述釀酒酵母在釀制特色優質干紅葡萄酒中的應用。本發明還提供了上述釀酒酵母在釀制藍莓酒、棗酒等各種果露酒中的應用。本發明的釀酒酵母抗逆性強，耐高糖，耐高溫，耐高酒精，耐滲性好，產酒精度高，可廣泛應用于中國產區各個特色紅葡萄品種的優質干紅葡萄酒的釀制。本發明的釀酒酵母發酵梅鹿輒葡萄原料釀制而成的新酒比商業酵母RC212發酵的新酒澄清度更好， 香氣更加濃郁、柔和、愉快，新酒掛壁感、口感醇厚度更優；發酵赤霞珠葡萄原料釀制而成的新酒比商業酵母RC212發酵的新酒澄清度更好，香氣更加濃郁協調，口感更加醇厚、掛壁感更好。本發明的釀酒酵母也適合于西拉、蛇龍珠等紅葡萄品種的發酵，也可用于藍莓酒、棗酒等特色高端果露酒的發酵及普通果酒的釀制。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明進一步詳細說明。下述實施例中各培養基的配方如下:Yro 培養基:酵母粉 10g/1000ml，蛋白胨 20g/1000ml，葡萄糖 20g/1000ml，自然 pH值、115°C、20min高壓滅菌。固體培養基加入20g/1000ml瓊脂粉。WL瓊脂培養基:酵母粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖5%，瓊脂2%，磷酸二氫鉀0.055%,氯化鉀0.0425%,氯化鈣0.0125%,氯化鐵0.00025%,硫酸鎂0.0125%,硫酸錳
0.00025%，溴甲酚綠 0.0022%, pH 值為 6.5，121°C、20min 高壓滅菌。賴氨酸培養基(1-1):D-葡萄糖10g，L-組氨酸lmg，DL-蛋氨酸2mg，DL-色氨酸2mg,對-氨基苯甲酸200Pg,生物素20Pg,葉酸2Pg,肌醇IOmg,煙酸400Pg,泛酸2mg,鹽酸批哆醇40(^g，核黃素20(^g，鹽酸硫胺素40(^g，硼酸50(^g，結晶氯化銅4(^g，碘化鉀lOOPg，結晶氯化鐵20(^g，結晶硫酸錳40(^g，結晶鑰酸鈉20(^g，結晶硫酸鋅40(^g，磷酸二氫鉀850mg,磷酸氫二鉀150mg,結晶硫酸鎂500mg氯化鈉IOOmg,結晶氯化I丐IOOmg,賴氨酸鹽酸鹽2.5g，瓊脂20g, pH值自然，121°C、20min高壓滅菌。糖發酵培養基、同化氮源基礎培養基、同化碳源基礎培養基、產酯培養基、產生類淀粉化合物培養基、高滲透壓培養基均采用常規配方。實施例1釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae WR1104的分離純化與篩選1、出發菌株的選育(I)果表酵母分離無菌稱量IOg成熟葡萄，放入盛有90ml無菌水三角瓶，震蕩培養30min，制成菌懸液，準確吸取50ul放入YPD固體培養基，以無菌刮鏟刮勻，25°C培養24-28h ；(2)自然發酵酵母分離無菌稱量約IOOg新鮮成熟度好的葡萄，放入無菌500ml三角瓶，以無菌研錘破碎，置于27°C培養，每隔24h取發酵液1ml，加入9ml無菌水中進行梯度稀釋至10_7，取50ul稀釋后菌液放入YPD固體培養基，以無菌刮鏟刮勻，25°C培養24-28h ；(3 )對(I)(2 )中Yro培養48h的酵母菌株，挑取培養基中長出的肉眼可見的真菌菌落，分別移入YPD固體平板培養基上，恒溫培養、純化直至得到單菌落后，轉接至斜面試管作為出發菌株，得到301株菌。2、酵母菌株初篩(I)鏡檢初篩對斜面試管菌株在YPD液體培養基中培養48h，以16 X 40倍顯微鏡鏡檢，篩選出以多端出芽繁殖的菌株，得到123株菌；(2)WL瓊脂培養基篩選將鏡檢篩選出的菌株，接種YPD液體培養基活化24h后接種到WL瓊脂培養基，27°C培養5d后觀察，篩選出菌落顏色為奶油色(淺黃色)-綠色，球形突起的表面光滑、不透明、 奶油狀的菌株，得到62株菌；
(3)菌株發酵力及產香特性篩選將WL培養基篩選出的菌株，接種到倒扣杜氏管的YPD液體試管培養基中，27 °C培養，檢測4h、6h、8h、IOh的產氣情況(以產氣至杜氏管體積計發酵力)和產香特性(分為有異味、香氣淡、香氣稍好、香氣濃郁四個級別)，篩選出IOh內產氣滿管、產香不錯或產香濃郁的菌株，得到36株菌。3、模擬酒精發酵復篩將上述得到的36株菌株接種到含糖20%的IOOmlYPD液體搖瓶培養基中，27°C培養96h，檢測模擬酒精發酵后的CO2失重量(g)、酒精度(％vol)及產香情況，篩選出發酵后CO2失重量在IOg以上，酒精度在9%以上，產香較好或濃郁的菌株，得到24株菌。4、復篩得到酵母菌株耐高糖、耐高溫、耐酒精、耐滲性等抗逆性評價及最 高產酒精度試驗(I)酵母菌株耐高糖評價將模擬酒精發酵得到的24株菌同時接到含有600g/L葡萄糖YPD液體試管培養基和固體平板培養基上，27°C培養，觀察液體試管培養48h的產氣情況及固體平板培養96h的菌株存活情況和菌落生長情況，篩選出上述條件下存活并產氣、菌落生長良好且菌落較大的菌株；(2)酵母菌株耐高溫評價將模擬酒精發酵得到的24株菌采用50°C和55°C兩個溫度點處理，水浴培養12h后，觀察供試菌株產氣情況(均為產氣)，然后點種到YPD平板上的28°C下培養48-72h，觀察菌落生長情況，篩選出菌落生長良好且菌落較大的菌株；(3)酵母菌株耐酒精評價將模擬酒精發酵得到的24株菌分別接到YH)含有12%、16%,20%乙醇的液體試管培養基和含有12%、16%、20%乙醇的固體平板培養基上，27°C培養，觀察液體試管培養48h的產氣和存活情況及固體平板培養96h的菌落生長情況，篩選出上述條件下存活并產氣、菌落生長良好且菌落較大的菌株；(4)酵母菌株耐滲性評價將模擬酒精發酵得到的24株菌分別接到YPD含有100g/L、120g/LNaCl的液體試管培養基和含有100g/L、120g/LNaCl的固體平板培養基上，27°C培養，觀察液體試管培養48h的產氣和存活情況及固體平板培養96h的菌落生長情況，篩選出上述條件下存活并產氣、菌落生長良好且菌落較大的菌株(5)菌株最高產酒精度試驗將模擬酒精發酵得到的24株菌接到120ml含20g/L糖度的含30%蔗糖西瓜汁發酵液中，27°C培養，檢測發酵96h后的CO2失重量(g)、酒精度(%vol)及產香情況，篩選出發酵后產酒精度較高(13%以上)，產香較好或濃郁的菌株；綜合(I)(2) (3) (4) (5)優篩，得到 12 株菌。5、優篩菌株模擬葡萄汁培養基發酵篩選把12株優篩菌株分別以I X 106CFU/mL接種量接種于400ml模擬紅葡萄原料培養基(400mL玫瑰香葡萄破碎液，添加10%蔗糖)中，25°C模擬發酵靜置培養25d左右，檢測發酵酒樣的CO2失重量(g)、酒精度(％vol)、總酸(以酒石酸計，g/L)、揮發酸(以乙酸計，g/L)、總糖(g/U、還原糖(g/L)等基本理化指標，并作產香香氣分析和簡單感官評價，篩選出整體表現優良的菌株，得到6株菌。6、菌株以梅鹿輒、赤霞珠葡萄原料4L發酵小試和400L發酵中試篩選6株菌以IX 106CFU/mL接種量分別接種于采自甘肅民勤縣、武威市和青島平度市、煙臺蓬萊等地葡萄園的以蔗糖調糖度為20%的梅鹿輒、赤霞珠葡萄破碎液中，進行優篩菌種4L發酵小試實驗和400L發酵中試實驗，均以商業酵母法國拉曼公司的RC212作為對照菌株，25°C模擬發酵，25d左右(中試樣品定期檢測，后熟半年后進行專家感官品評)，檢測發酵酒樣的CO2失重量(g)、酒精度(％vol)、總酸(以酒石酸計，g/L)、揮發酸(以乙酸計，g/L)、總糖(g/L)、還原糖(g/L)等基本理化指標，并作產香香氣分析和專家感官品評，篩選出整體表現突出的菌株，得到酵母菌株WRl 104，具體步驟如實施實例3所述。實施例2釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae WR1104菌株的鑒定1、賴氨酸培養基鑒定(釀酒酵母不能采用賴氨酸作為氮源因而在該培養基上不能生長)將酵母菌株WRl 104接種YPD液體培養基活化24h后，按照1%接種量接種到5mL無菌水中進行饑餓處理，7d后接種到賴氨酸培養基，27°C培養5d后觀察沒有酵母生長，繼續培養和觀察，直到15d后仍無菌落生長，說明該菌株是釀酒酵母。2、生理生化鑒定將酵母菌株WR1104分別接種到各培養基上進行糖發酵(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、核糖、菊糖)、碳源同化(鼠李糖、L-阿拉伯糖、肌醇、纖維二塘、可溶性淀粉、菊糖、甲醇、D-木糖、山 梨糖、檸檬酸)、氮源同化(硫酸銨、天門冬素、硝酸鉀、亞硝酸鈉、L-賴氨酸)、產生類淀粉及產酯、耐滲透壓等生理生化鑒定，以商業酵母RC212作為對照，結果如下:表I酵母菌株糖發酵鑒定結果
權利要求
1.一株釀酒酵母，其保藏編號為CCTCC NO: M 2012500。
2.權利要求1所述的釀酒酵母在葡萄酒釀制中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述的葡萄酒為紅葡萄酒。
4.權利要求1所述的釀酒酵母在果露酒釀造中的應用。
5.如權利要求4所述的 應用，其特征在于所述的果露酒為藍莓酒或棗酒。
全文摘要
本發明提供了一株釀酒酵母，保藏編號為CCTCC NO: M 2012500。該釀酒酵母抗逆性強，耐高糖，耐高溫，耐高酒精，耐滲性好，產酒精度高，可廣泛應用于中國產區各個特色紅葡萄品種的優質紅葡萄酒的釀制，也可用于藍莓酒、棗酒等各種特色高端果露酒及普通果酒的釀制。本株釀酒酵母發酵梅鹿輒葡萄原料釀制而成的新酒比商業酵母RC212發酵的新酒澄清度更好，香氣更加濃郁、柔和、愉快，新酒掛壁感、口感醇厚度更優；發酵赤霞珠葡萄原料釀制而成的新酒比商業酵母RC212發酵的新酒澄清度更好，香氣更加濃郁協調，口感更加醇厚、掛壁感更好。本發明的釀酒酵母亦適合于西拉、蛇龍珠等紅葡萄品種的發酵，也可用于藍莓酒、棗酒等各種特色高端果露酒的發酵及普通果酒的釀制。
文檔編號C12R1/865GK103215195SQ20121054998
公開日2013年7月24日 申請日期2012年12月17日 優先權日2012年12月17日
發明者楊曉英, 劉天明, 劉魯民 申請人:青島蔚藍生物集團有限公司