專利名稱：香蕉穿孔線蟲lamp特異性檢測方法
香蕉穿孔線蟲LAMP特異性檢測方法—.技術領域
本發明適用于香蕉穿孔線蟲檢測，屬生物技術領域。二.背景技術
香蕉穿孔線蟲(Radopholus similis)是國際公認的對農林業為害最重的十大植物寄生線蟲之一。該線蟲寄主范圍廣，多達250余種；為害重，對香蕉、柑橘及黑胡椒等造成毀滅性的危害；地理分布廣，在世界一百多個國家和地區有分布。該線蟲被包括中國在內全世界三十多個國家及區域組織列為重要檢疫性有害生物。
近幾年，該線蟲在我國局部地區的溫室和大棚的觀賞植物上被發現，可能是隨著觀賞植物的引進傳入，盡管及時發現并得到有效控制，但該線蟲嚴重威脅我國農林業生產安全。因此，加強對該線蟲的監測、檢疫防控，阻止其進一步傳入，至關重要。
香蕉穿孔線蟲屬線蟲門(Nematoda)、側尾腺綱(Secernentea)、墊刃目 (Tylenchida)、短體線蟲科(Pratylenchidae)、穿孔線蟲屬(Radopholus)。該線蟲的傳統分類鑒定主要依據形態學特征輔以測計學數據。因此該線蟲的準確鑒定需要工作人員豐富的工作經驗，故難以滿足植物檢疫工作的實際需要。
隨著PCR等分子生物學技術發展及推廣，越來越多的分子檢測技術運用到植物有害生物檢測技術中，近年來香蕉穿孔線蟲種特異性PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈式反應)等檢測技術不斷出現，但是這些基于PCR的檢測技術都需要PCR儀等昂貴設備，難以用于現場檢疫，以及在一些基層監測工作中應用。三.發明內容
本發明目的是提供一種香蕉穿孔線蟲環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification)快速檢測方法。運用環介導等溫擴增技術檢測香蕉穿孔線蟲的方法，能夠提高檢測效率和檢測的準確度，本發明針對香蕉穿孔線蟲核糖體DNA的ITS2 區8個區域設計I組引物(含6條特異引物)，具有特異性高、快速等優點。檢測時間只需 25-30分鐘。此外，該檢測方法簡單，不需復雜設備，因此還可用于室外監測及一線口岸現場檢疫。
四.技術方案
(I)香蕉穿孔線蟲DNA提取
取線蟲，置于PCR管中，液氮放置2分鐘，加入1μ I蛋白酶K(lmg/ml)，65°C 15分鐘，95°C以上水處理10分鐘，所得即為線蟲DNA提取液；
(2)香蕉穿孔線蟲LAMP檢測特異引物
Rs-3F3 5' -GACTTGATGAGCGCAGAC-3'
Rs-3B3 5' -ACGCATTCATGTACGCAT-3'
Rs-3FIP 5' -AGCTGGCTGCGTTCTTCATACAAGAATTCTAGCCTTATCGG-3'
Rs-3BIP 5' -CGAATGCACATTGCGCCATTGTTAACGACCCTGAACCAG-3'
RS-3LF 5' -TACGAGCCGAGTGATCCA-3'Rs-3LB 5' -GAGTCACTTCCTCTGGCAC-3'(3)香蕉穿孔線蟲濁度觀察檢測反應體系PCR管中加入下列試劑，使總反應體積為20 ill :
權利要求
1.一組香蕉穿孔線蟲LAMP檢測用特異引物，其核苷酸序列為Rs-3F3 5' -GACTTGATGAGCGCAGAC-3'Rs-3B3 5/ -ACGCATTCATGTACGCAT-3'Rs-3FIP 5/ -AGCTGGCTGCGTTCTTCATACAAGAATTCTAGCCTTATCGG-3'Rs-3BIP 5/ -CGAATGCACATTGCGCCATTGTTAACGACCCTGAACCAG-3/Rs-3LF 5/ -TACGAGCCGAGTGATCCA-3' Rs-3LB 5/ -GAGTCACTTCCTCTGGCAC-3'。
2.一種檢測香蕉穿孔線蟲的濁度觀察檢測方法其以總DNA為模板，利用權利要求1所述的引物組合進行LAMP擴增，反應25分鐘后觀察反應液渾濁度變化。
3.—種檢測香蕉穿孔線蟲的熒光觀察檢測方法其以總DNA為模板，利用權利要求1所述的引物組合進行LAMP擴增，反應25分鐘后觀察反應液顏色變化。
4.如權利要求2所述的方法，香蕉穿孔線蟲濁度觀察檢測方法檢測25分鐘后，陽性檢測結果為反應液為渾濁，而陰性結果為澄清。
5.如權利要求3所述的方法，香蕉穿孔線蟲熒光觀察檢測方法檢測25分鐘后，陽性檢測結果為反應液為綠色，而陰性結果為黃色。
6.一種試劑盒，其含有權利要求1所述引物。
全文摘要
本發明涉及香蕉穿孔線蟲(Radopholus similis)分子檢測，屬于植物檢疫領域。本發明基于香蕉穿孔線蟲與其相近種序列存在差異，通過比對香蕉穿孔線蟲與其相近種線蟲序列差異性，設計了1組特異引物(6條)。同時，本發明提供了一組檢測香蕉穿孔線蟲的LAMP引物組序列，還進一步提供了檢測香蕉穿孔線蟲的檢測方法。本發明的引物特異性好，檢測方法快速簡單，準確性高，為香蕉穿孔線蟲疫情監測及香蕉穿孔線蟲病防控提供了有效的技術保障。
文檔編號C12Q1/68GK103031381SQ20121055000
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月17日 優先權日2012年12月17日
發明者熊玉芬, 葛建軍, 王旭 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院