專利名稱：一株重組大腸桿菌及用該菌株制備磷脂酶A₁的方法
技術領域：
本發明屬于基因工程和微生物發酵技術領域，具體涉及一株重組大腸桿菌及用該菌株進行自誘導發酵來制備磷脂酶A1的方法。
背景技術：
磷脂酶A1 (PhospholipaseA1, EC 3.1.1.32,簡稱PLA1)屬于水解酶,可專一水解天然磷脂Sn-1位?；?，得到Sn-2?；苎字陀坞x脂肪酸。磷脂酶A1是一種優良的表面活性劑，被廣泛應用于食品、醫藥、飼料和皮革等領域；此外，磷脂酶4還可應用于植物油脫膠，同傳統脫膠方法相比，磷脂酶A1脫膠這種新型脫膠方法具有反應條件溫和、副產物少、節能環保等優點，近年來已在油脂精煉行業得到大規模推廣。經證實，許多動物的細胞、組織和毒液含有少量的磷脂酶4。磷脂酶A1的傳統來源為動物胰液，但該來源提取量有限且價格昂貴，已于近幾年逐漸被淘汰，取而代之的是從微生物中提取，但提取自微生物的磷脂酶A1大多與細胞膜結合，難以進行規?；a，因此，研究磷脂酶A1基因在工程菌中的克隆表達并努力提高其產量成為近年來的主要研究方向。國內外利用微生物產磷脂酶A1的起步較晚，且產量普遍較低:1988年，MichaelGivskova等從液化沙 雷氏菌中提取磷脂酶A1基因在大腸桿菌克隆和表達，其酶活不到IU/ml (Givskov M, Molin S.Secretion of Serratia liquefaciens phospholipase fromEseherichia.coli [J].Mol.Microbiol, 1993 (8):229-42.) ；2000 年，M.Hartmann 等使用隨機化學突變、單細胞融合以及基因雜交技術，篩選出4株嗜熱四膜蟲屬突變株，其酶活最高達至丨J 35.2 + 2.60U/ml (Hartmann M, etal.Screening forand charaeterizationofphospholipase A1 hypersecretory mutants of Tetrahymena thermophila[J].Appl.Microbiol.Biotechnol，2000 (54):390-396) ；2008年，國內付建紅等從新疆天山一號冰川凍土中篩選到一株產低溫堿性磷脂酶A1的菌株xjFl，初步優化后，酶活力最高達17.5U/ml(付建紅，唐輝桂，姚斌，等.一株產低溫堿性磷脂酶A1耐冷細菌的篩選及發酵條件的初步研究.工業微生物2008.38:12-16.)。目前商品化的磷脂酶A1產品僅有丹麥諾維信公司的Lecitase Novo (Novozymes A/S),其是通過蛋白質修飾技術由來源于嗜熱絲胞菌的脂肪酶改性而來。因此，尋找更加優良的磷脂酶A1基因并在工程菌中進行克隆表達以期提高其表達水平是亟待解決的問題。

發明內容
針對現有技術存在的上述問題，本發明的目的在于提供一株重組大腸桿菌及用該菌株制備磷脂酶A1的方法。利用該菌株通過液體發酵制備磷脂酶A1，具有產酶量和酶活性高、生產工藝簡單、成本低、易于工藝放大等優點。本發明的技術方案如下:一株重組大腸桿菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)/pET-pla，保藏編號為 CCTCCM 2012423，該重組大腸桿菌包含一段來源于液化沙雷氏菌CICCN0.21538的pla基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。其進一步的技術方案為:所述重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-pla，CCTCC N0.M 2012423由下述方法制得:(I)以所述液化沙雷氏菌CICC N0.21538的基因組為模板，克隆得到所述pla基因；(2)將步驟(I)所得pla基因克隆到表達載體pET-28a ( + )上，得到重組載體pET-pla ；(3)將步驟(2)所得重組載體pET-pla轉化大腸桿菌感受態細胞，構建得到能表達磷脂酶A1的重組大腸桿菌。本發明還提供了一種用上述重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET_pla，CCTCC N0.M2012423制備磷脂酶A1的方法，是以該重組大腸桿菌為發酵菌株進行液體發酵，制備磷脂酶
A1O具體步驟如下:(I)種子培養:將經過斜面培養的所述重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET_pla，CCTCCN0.M 2012423單菌落接種于種子培養基，于35 37°C振蕩培養5 7h，搖床轉速180 200r/min ；(2)自誘導發酵培養:將上述種子培養所得活化種子液按體積百分比I 4%的接種量接種至自誘導發酵培養基，于3`5 37°C振蕩培養3 5h小時，搖床轉速180 200r/min ;再向所述自誘導發酵培養基中分別添加其總重量0.5 2%的甘氨酸和曲拉通，繼續培養12 14h ;發酵完畢，得到發酵液；(3)粗酶液的提取:將上述發酵液離心，收集上清液，即得含磷脂酶A1的粗酶液。其進一步的技術方案為:步驟(I)所述斜面培養的培養基成分以IL計為:蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖8g，氯化鈉1，其余成分為水，調節pH值至7.4 ;所述種子培養基成分以IL計為:蛋白胨10g，酵母粉 5g，葡萄糖 8g，Na2HPO4 25mM, KH2PO4 25mM, NH4Cl 50mM, Na2SO4 5mM, MgSO4 2mM，其余成分為水；上述種子培養基還包括終濃度為100μ g/ml的卡那霉素。步驟(2)所述自誘導發酵培養基成分以IL計為:蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖
0.5g,乳糖 2g,甘油 5g, Na2HPO4 25mM, KH2PO4 25mM, NH4Cl 50mM, Na2SO4 5mM, MgSO4 2mM,FeCl3 50 μ M, CaCl2 20 μ M，其余成分為水。磷脂酶A1酶活測定方法如下:采用改良NaOH 滴定法(Sheelu 等，J Am Oil Chem Soc 85:739-748，2008)。將 4g已乳化的大豆卵磷脂溶于100ml 50mM的磷酸緩沖液(pH 7.0)，取20ml該溶液和稀釋5倍的粗酶液在轉速為180r/min的恒溫震蕩水浴鍋中于50°C預熱10分鐘；取200 μ L已稀釋的粗酶液加入上述反應體系中精確反應10分鐘，立即補加15ml的95%乙醇終止反應。用已標定的30mmol/L NaOH溶液滴定上述粗酶液中磷脂酶A1所釋放的游離脂肪酸，取pH8.2為滴定終點；磷脂酶A1酶活力定義為:在上述反應條件下，每分鐘釋放I μ mol的游離脂肪酸的酶量定義為一個酶活力單位。本發明所提供的重組大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET_pla,已于2012年10月24日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號:CCTCC NO:M 2012423，地址:中國，武漢，武漢大學。該菌株以下簡稱:重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-pla CCTCCM 2012423。本發明的有益技術效果如下:本發明成功構建了一株磷脂酶A1基因來源于液化沙雷氏菌CICC N0.21538的基因重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-pla CCTCC M 2012423，分析結果表明，該重組大腸桿菌所包含的磷脂酶A1基因(pla基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)與GenBank編號X66505.1的磷脂酶A1基因的序列同源性較低，為76.4%，拓寬了磷脂酶A1的基因來源；以該重組大腸桿菌為發酵菌株并通過本發明方法制備磷脂酶A1,產酶量高，經檢測胞外酶活性最高可達137.6U/ml ;本發明方法生產工藝簡單、生產周期短、成本低、易于工藝放大，在油脂精煉、磷脂改性等領域具有廣闊的應用前景。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明的具體實施方式
做進一步的描述，以下實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。以下實施例所涉及實驗材料如下:大腸桿菌感受態細胞E.coli JM109和E.coliBL21 (DE3)購自寶生物工程(大連)有限公司；液化沙雷氏菌購自中國工業微生物菌種保藏中心(CICC)，保藏編號為=CICC N0.21538 ；pMD18T-simple Vector、T4DNA連接酶和 10XT4連接酶Buffer購自寶生物工程(大連)有限公司；pET_28a ( + )購自Novagen ;限制性內切酶 EcoR1、Hind III 以及共用 Buffer 購自 Fermentas。其他原料和試劑均為市售國產或進口分析純產品。實施例1憐脂 酶A1基因的克隆根據NCBI GenBank:X66505.1的基因序列設計引物，其中，上游引物為:5' -CGGAATTCAGTATGTCTTTGAGTTTTACCTCTGC~3/ (下劃線表示 EcoR I 酶切位點)，下游引物為:5’ -CCAAGCTTCGTTACTGCTGTCCGTATTGC-3'(下劃線表示 Hind III酶切位點)。以保藏編號為CICC N0.21538的液化沙雷氏菌基因組DNA為模板，運用PCR的方法(引物如上所述)克隆得到磷脂酶A1基因pla，并與載體pMDlST-simple連接得到克隆載體pMD-pla，將該克隆載體轉化大腸桿菌感受態細胞E.coli JM109，挑選陽性克隆，測序驗證，其堿基序列如SEQ ID N0:1所示，結果表明磷脂酶A1基因克隆成功。序列分析顯示，該基因序列與GenBank編號X66505.1的磷脂酶A1基因序列同源性較低，為76.4%。實施例2重組載體pET-pla的構建用EcoR I和Hind III對重組載體pMD-pla和表達載體pET_28a ( + )進行雙酶切，酶切反應體系為 50 μ L:載體 20 μ L、酶反應 Buffer 5 μ L,EcoR I 2.5 μ L、Hind III 2.5 μ L，補充雙蒸去離子水至50yL，37°C反應2小時。回收酶切后的目的基因和載體DNA，并用T4DNA連接酶進行連接，連接反應體系IOyL:目的基因2 μ L、載體DNA I μ L、10X Τ4連接酶Buffer I μ L、T4DNA連接酶I μ L，雙蒸去離子水5 μ L，于16°C反應12小時。將連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞E.coli JM109，轉化方法如下:(I)取 E.coli JM109 100 μ L 置于無菌1.5ml EP 管中；(2)加入上述連接產物并輕輕混勻；
(3)將上述EP管置于42°C金屬浴，精確計時90s，勿搖動EP管；(4)轉移EP管至冰浴中，冷卻5 IOmin ；(5)每管加入無菌SOC培養基800 μ L，置于37°C培養箱復蘇Ih ；(6)以8000r/min的轉速離心2min，吸去800 μ L上清培養基，用移液槍輕輕吹吸剩余培養基和細胞，并轉移至含終濃度50 μ g/ml卡那霉素的LB固體平板，涂勻并于37°C培養箱培養16 24h ；(7)挑取陽性克隆，并經EcoR I和Hind III雙酶切驗證。實施例3 重組大腸桿菌 BL21 (DE3) /pET-pla CCTCC M 2012423 的構建將構建好的重組載體pET-pla轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，轉化方法如下:(I)取 E.coli BL21 (DE3) 100 μ L 置于無菌1.5ml 的 EP 管中；(2)加入上述重組質粒pET-pla并輕輕混勻；(3)將上述EP管置于42°C金屬浴，精確計時90s，勿搖動EP管；(4)轉移EP管于冰浴中，冷卻5 IOmin ；(5)每管加入無菌SOC培養基800 μ L，置于37°C培養箱復蘇Ih ；(6)以8000r/min的轉速離心2min，吸去800 μ L上清培養基，用移液槍輕輕吹吸剩余培養基和細胞，并轉移至含終濃度50 μ g/ml卡那霉素的LB固體平板，涂勻并于37°C培養箱培養16 24小時；(7)挑取轉化子，經EcoR I和Hindm酶切驗證重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-pla構建成功，與等體積的30 %甘油混勻，于-70 0C保藏。用重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-pla CCTCC M 2012423通過自誘導發酵制備磷脂酶A1實施例4 實施例8所述斜面培養方法如下:將上述甘油保藏的重組大腸桿菌BL21 (DE3) /pET-pla CCTCC M 2012423劃線接種于斜面培養基，于37°C培養12h ;上述斜面培養基成分以IL計為:蛋白胨IOg,酵母粉5g,葡萄糖8g,氯化鈉I,其余成分為水,調節pH值至7.4,于IX IO5Pa高壓下滅菌20min。所述種子培養基成分以IL計為:蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖8g，Na2HP0425mM,KH2PO4 25mM, NH4Cl 50mM, Na2SO4 5mM, MgSO4 2mM，其余成分為水，于 I X IO5Pa 高壓下滅菌20mino所述自誘導發酵培養基成分以IL計為:蛋白胨IOg,酵母粉5g,葡萄糖0.5g,乳糖2g,甘油 5g, Na2HPO4 25mM, KH2PO4 25mM, NH4Cl 50mM, Na2SO- 45mM, MgSO4 2mM, FeCl3 50 μ M,CaCl2 20 μ M,其余成分為水，于I X IO5Pa高壓下滅菌20min。實施例4(I)種子培養:將經過斜面培養的重組大腸桿菌BL21 (DE3) /pET-plaCCTCCM2012423單菌落接種于種子培養基(含終濃度為100 μ g/ml的卡那霉素)，在回旋式搖床上于36°C振蕩培養6h，搖床轉速180r/min ；

(2)自誘導發酵培養:將上述種子培養所得活化種子液按體積百分比2%的接種量接種至自誘導發酵培養基，自誘導發酵培養基裝于250ml三角瓶，裝液量為50ml，在回旋式搖床上于36°C振蕩培養4h小時，搖床轉速180r/min ;分別向自誘導發酵培養基中添加其總重量0.5%的甘氨酸和0.5%的曲拉通，繼續培養12h ;發酵完畢，得到發酵液；
(3)粗酶液的提取:將上述發酵液于4°C離心IOmin,轉速8000r/min ;收集上清液，即得胞外重組磷脂酶A1的粗酶液。經檢測，上述胞外磷脂酶A1粗酶液的酶活為94.7U/ml。實施例5(I)種子培養:將經過斜面培養的重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-pla CCTCCM2012423單菌落接種于種子培養基(含終濃度為100 μ g/ml的卡那霉素)，在回旋式搖床上于36°C振蕩培養7h，搖床轉速200r/min ；(2)自誘導發酵培養:將上述種子培養所得活化種子液按體積百分比3%的接種量接種至自誘導發酵培養基，自誘導發酵培養基裝于250ml三角瓶，裝液量為50ml，在回旋式搖床上于36°C振蕩培養5h小時，搖床轉速200r/min ;分別向自誘導發酵培養基中添加其總重量0.75%的甘氨酸和0.75%的曲拉通，繼續培養13h ;發酵完畢，得到發酵液；(3)粗酶液的提取:同實施例4。經檢測，上述胞外磷脂酶A1粗酶液的酶活為109.8UM。實施例6(I)種子培養:將經過斜面培養的重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-pla CCTCCM2012423單菌落接種于種子培養基(含終濃度為100 μ g/ml的卡那霉素)，在回旋式搖床上于37°C振蕩培養7h，搖床轉速200r/min ；(2)自誘導發酵培養:將上述種子培養所得活化種子液按體積百分比4%的接種量接種至自誘導發酵培養基，自誘導發酵培養基裝于250ml三角瓶，裝液量為50ml，在回旋式搖床上于37°C振蕩培養4h小時，搖床轉速200r/min ;分別向自誘導發酵培養基中添加其總重量I %的甘氨酸和I %的曲拉通，繼續培養13h ;發酵完畢，得到發酵液；(3)粗酶液的提取:同實施例4。經檢測，上述胞外磷脂酶A1粗酶液的酶活為117.2U/ml。實施例7(I)種子培養:將經過斜面培養的重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-pla CCTCCM2012423單菌落接種于種子培養基(含終濃度為100 μ g/ml的卡那霉素)，在回旋式搖床上于35°C振蕩培養5h，搖床轉速180r/min ；(2)自誘導發酵培養:將上述種子培養所得活化種子液按體積百分比1%的接種量接種至自誘導發酵培養基，自誘導發酵培養基裝于250ml三角瓶，裝液量為50ml，在回旋式搖床上于35°C振蕩培養3h小時，搖床轉速180r/min ;分別向自誘導發酵培養基中添加其總重量2%的甘氨酸和2%的曲拉通，繼續培養12h ;發酵完畢，得到發酵液；(3)粗酶液的提取:同實施例4。經檢測，上述胞外磷脂酶A1粗酶液的酶活為78.3U/ml。實施例8(I)種子培養:將經過斜面培養的重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-pla CCTCCM2012423單菌落接種于種子培養基(含終濃度為100 μ g/ml的卡那霉素)，在回旋式搖床上于37°C振蕩培養7h，搖床轉速200r/min ；(2)自誘導發酵培養:將上 述種子培養所得活化種子液按體積百分比4%的接種量接種至自誘導發酵培養基，自誘導發酵培養基裝于250ml三角瓶，裝液量為50ml，在回旋式搖床上于37°C振蕩培養5h小時，搖床轉速200r/min ;分別向自誘導發酵培養基中添加其總重量0.75%的甘氨酸和I %的曲拉通，繼續培養14h ;發酵完畢，得到發酵液；(3)粗酶液的提取:同實施例4。經檢測，上述胞外磷脂酶A1粗酶液的酶活為137.6U/ml。綜上所述，實 施例8所述磷脂酶A1制備方法具有最高的酶活性，為最佳實施例。
_說明書核苷酸序列表_
<110>江南大學
<120> 一株重組大腸桿菌及用該菌株制備磷脂酶Al的方法 <160> I
<170> PatentIn version 3.3
<210> I<211 >963<212> DNA
<213〉大腸桿菌(Escherichia coli sp.) BL21 (DE3) /pET-pla <400〉I
atgagtatgc cttlgagttt tacctctgcg gtcagccctg cggcgattca gcccccggca 60acgcgctcgt tgccagagcg tttggatcct tcccagccta ctgaacccic ggcatcaaag 120gcccccgcgg ccacgcUtc ccagaatagc ctgaatgccc agaacctgct gaacacgctg 180gtcagcgatt tgtcggcagc agcgccggcg gcggcgaatc agggtgtgac acgcggtcag 2-0cagccacaga agggggacta tacgctggcg ttactggcta aagacgrtta cagcaccggc 300agtcagggcg tcgaaggatt caatcggttg agtgccgatg ctttgctggg ggttggcatt 360galcclgcca glcigcaaga lgcagcgicg ggtIllcagg ccgggatlia caglgalaal 42U`
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權利要求
1.一株重組大腸桿菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)/pET-pla，保藏編號為 CCTCCN0.M 2012423，其特征在于:該重組大腸桿菌包含一段來源于液化沙雷氏菌CICC N0.21538的Pla基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根據權利要求1所述重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-pla，CCTCC N0.M2012423，其特征在于由下述方法制得: Cl)以所述液化沙雷氏菌CICC N0.21538的基因組為模板，克隆得到所述pla基因； (2)將步驟(I)所得pla基因克隆到表達載體pET-28a( + )上，得到重組載體pET-pla ； (3)將步驟(2)所得重組載體pET-pla轉化大腸桿菌感受態細胞，構建得到能表達磷脂酶A1的重組大腸桿菌。
3.用權利要求1 2任一項所述重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-pla，CCTCCN0.M2012423制備磷脂酶A1的方法，其特征在于以該重組大腸桿菌為發酵菌株進行液體發酵，制備憐脂酶A1。
4.根據權利要求3所述制備磷脂酶A1的方法，其特征在于具體步驟如下: (1)種子培養:將經過斜面培養的所述重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-pla，CCTCC N0.M2012423單菌落接種于種子培養基，于35 37°C振蕩培養5 7h，搖床轉速180 200r/min ； (2)自誘導發酵培養:將上述種子培養所得活化種子液按體積百分比廣4%的接種量接種至自誘導發酵培養基，于35 37°C振蕩培養3 5h小時，搖床轉速180 200r/min ；再向所述自誘導發酵培養基中分別添加其總重量0.5 2%的甘氨酸和曲拉通，繼續培養12 14h ;發酵完畢，得到發酵液； (3)粗酶液的提取:將上述發酵液離心，收集上清液，即得含磷脂酶A1的粗酶液。
5.根據權利要求4所述制備磷脂酶A1的方法，其特征在于步驟(I)所述斜面培養的培養基成分以IL計為:蛋白胨IOg,酵母粉5g,葡萄糖8g,氯化鈉I,其余成分為水,調節pH值至7.4 ;所述種子培養基成分以IL計為:蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖8g，Na2HPO4 25mM,KH2PO4 25mM, NH4Cl 50mM, Na2SO4 5mM, MgSO4 2mM，其余成分為水。
6.根據權利要求4所述制備磷脂酶A1的方法，其特征在于步驟(2)所述自誘導發酵培養基成分以IL計為:蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖0.5g，乳糖2g，甘油5g，Na2HPO4 25mM,KH2PO4 25mM, NH4Cl 50mM, Na2SO4 5mM, MgSO4 2mM, FeCl3 50 μ M, CaCl2 20 μ M，其余成分為水。
全文摘要
本發明提供一株重組大腸桿菌及用該菌株制備磷脂酶A1的方法。本發明成功構建了一株磷脂酶A1基因來源于液化沙雷氏菌CICC No.21538的基因重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-pla CCTCC M 2012423，用該菌株進行液體發酵來制備溶血性磷脂酶A1，其制備方法包括斜面培養、種子培養、自發誘導培養(包括添加滲透性物質)以及粗酶液的提取。利用本發明菌株通過液體發酵制備磷脂酶A1，具有產酶量和酶活性高、生產工藝簡單、生產周期短、成本低、易于工藝放大等優點，在油脂精煉、磷脂改性等領域具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12R1/425GK103074290SQ20121055132
公開日2013年5月1日 申請日期2012年12月18日 優先權日2012年12月18日
發明者張梁, 石貴陽, 延晉雷, 丁重陽, 顧正華 申請人:江南大學