專利名稱：一種用米曲霉全細胞催化生產蔗果低聚糖的方法
技術領域：
本發明屬于低聚糖的技術領域，涉及蔗果低聚糖的發酵生產方法，具體涉及一種米曲霉全細胞生產蔗果低聚糖的方法。
背景技術：
低聚糖是以2-10個單糖分子通過糖苷鍵連接而成的低聚合度的碳水化合物，其中功能性的低聚果糖，又稱鹿果低聚糖(Fructooligosaccharides,縮寫為F0S),是由I 3個果糖基通過β_1，2糖苷健與蔗糖結合而生成蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的混合物。FOS具有促進腸道內例如雙歧桿菌的增殖，排毒清潔腸道，提高人體免疫力，改善脂質代謝，能預防蛀牙，不被消化道吸收利用等優異性能，現被廣泛用于保健食品配料中。目前生產蔗果低聚糖有兩種方法:(1)液體深層發酵法；(2)固定化酶法。兩種方法各有優缺點。液體深層發酵法需要投入大量的發酵設備及其附屬設備，前期投入非常大。液體深層發酵法，利用能分泌果糖基轉移酶的微生物，從培養液分離收集菌絲體后，投入到蔗糖溶液中，在一定的條件下轉化為F0S。固定化酶的方法，因為固定后的酶容易游離，且底物和產物要不斷穿過載體屏障，產率會受到很大的影響。專利號為01128345.9的中國發明專利主要利用固定化果糖基轉移酶生產蔗果低聚糖，先培養出大量的菌絲體，將菌絲體破壁后將酶分離純化，再將酶與有機高聚物進行交聯固定化后，用分批或柱式反應法進行固定化果糖基轉移酶生產蔗果低聚糖。該方法的不足之處是步驟繁多，酶容易失活，轉化率低，由于蔗糖和轉化后的產物要穿過固定化的顆粒，傳質均勻性受到限制。由于酶的分離純化過程復雜且在此過程中酶活性有部分損失，在立體結構環境中不穩定，易失活等缺點，且酶的價格昂貴，造成酶法反應成本較高，這些方面均嚴重制約了其的工業化應用。固定化細胞法，即用海藻酸鈣凝膠將產酶菌體包埋起來的方法，該法不足之處是對生產環境和條件要求苛刻(例如空氣凈化)。

發明內容
本發明針對現有蔗果低聚糖轉化的酶制劑及其工藝上的不足，經過多年攻關和探索，目的在于提供一種用米曲霉全細胞催化生產蔗果低聚糖的方法。該種全細胞酶制劑制備方法簡單，不涉及到酶的分離純化。這種全細胞酶制劑具有轉化效率高，性能穩定的特點。為了實現上述目的，本發明采用了如下技術方案:一種用米曲霉全細胞催化生產蔗果低聚糖的方法，包括以下步驟:(2)米曲霉全細胞催化劑的制備；(2)利用米曲霉全細胞催化劑生產蔗果低聚糖。包括如下步驟:第一步:將米曲霉孢子接種到液體種子培養基中，接種量為I X IO5 101°個/L，于25_35°C,轉速為100r/min 300r/min的條件下培養16h 24h后的菌體溶液為種子液；

第二步:以體積比為5 10:100的比例，將第一步所得的種子液接種至含產酶誘導劑的液體培養基中，于25°C 35°C，轉速為100r/min 300r/min的條件下培養16 24h后的菌體溶液為全細胞菌體溶液；第三步:收集第二步所得的全細胞菌體溶液，用無菌的200目 400目的濾布過濾、洗滌、再過濾、脫水干燥去除水分，得到具有轉化活性的全細胞。第四步:以重量體積比為flO:100 (m/V)的比例，將第三步所得的全細胞FOS酶至于反應體系中，于pH5.0-7.5、溫度45°C 55°C和轉速為100r/min 300r/min的條件下進行轉化24h 48h。第五步:反應完成后，用板框過濾器過濾反應液，回收全細胞菌體，濾過液經過真空濃縮機濃縮成符合要求的FOS糖漿。利用高壓色譜法檢測反應體系中蔗果低聚糖的含量，所得的蔗果低聚糖總量在50%以上。所述的液體種子培養基為；20g/L 50g/L蔗糖，3g/L 7g/L麥芽粉或10g/L 30g/L玉米粉,5g/L 10g/L蛋白胨或50g/L 100g/L的酵母提取物或其中兩種，lg/L 3g/L NaCl或lg/L 2g/LNaN03或其中的兩種。所述的產酶誘導劑包括糖類化合物、無機鹽(K2HPO4, MgSO4.7H20、NaNO3)、酵母膏中的兩種或二種。所述的含產酶誘導劑的液體培養基為:10g/L 70g/L鹿糖，15g/L 55g/L玉米粉，20g/L 50g/L酵母提取物，Og/L 12g/L K2HP04，Og/L 1.5g/L MgS04.7H20，3g/L lOg/L NaN03。所述米曲霉是指由米曲霉CICC2134(Asperrgilus oryzae 2134,由中國工業微生物菌種保藏管理中心保藏，地址:北京市朝陽區霄云路32號，郵編:100027)。所述洗滌為用NaCl生理鹽水溶液。第三步采用真空冷凍干燥或真空干燥的方法去除水分，得到具有轉化活性的全細胞FOS酶。所得到的全細胞是能將蔗糖轉化為蔗果低聚糖。第四步采用Κ2ΗΡ04/ΚΗ2Ρ04系列緩沖液調節反應體系的pH為5.0-7.0。所述的反應體系是重量百分比為40%_60% (w/w)的蔗糖溶液。本發明與現有的技術相比具有如下的優點:(I)本發明制作方法簡單，不涉及到酶的繁雜分離純化的過程，簡化了設備的投資。(2)米曲霉所需要的營養低，易培養，易操作，制作工藝簡單，細胞體相當于酶的天然保護層，可有效避免酶的失活，免去了酶固定化的步驟。(3)簡化了蔗果低聚糖的生產工藝，直接將全細胞投入到反應液中，減少了液體深層發酵培養中發酵罐及其附屬設備的投入。(4)將全細胞FOS酶投入到FOS的反應體系中，所得的FOS糖液不需要經過脫色，不需要經過離子交換柱脫鹽，只需要經過簡單的過濾，濃縮后即可得到固形物中總低聚糖的含量> 50%的FOS糖漿，整個工藝簡單，操作方便，生產成本明顯降低。


圖1為本發明 實施例1中利用米曲霉全細胞制備蔗果低聚糖的高效液相色譜圖
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步詳細說明，但是本發明要求保護的范圍并不局限于此。實施例1第一步將米曲霉CICC 2134(Aspergilusoryzae2134,由中國工業微生物菌種保藏管理中心保藏，地址:北京市朝陽區霄云路32號，郵編:100027)的孢子接種到液體種子培養基中，接種量為1父105個/1，于331:，轉速為150r/min的搖床上培養16h后的菌體溶液制成種子液；所述液體種子培養基配方為:20g/L蔗糖，30g/L玉米粉，100g/L酵母提取粉，2g/L NaNO3 ;攪拌溶解均勻后用滅菌，冷卻后備用；第二步:以體積比為5:100的比例，將第一步所得的種子液接種至產酶誘導劑的液體培養基中，于33°C，轉速為150rpm的搖床上培養24h后的菌體溶液制成全細胞菌體溶液；所述的含產酶誘導劑的液體培養基為:70g/L蔗糖，20g/L酵母提取物，15g/L玉米粉，3g/L NaNO3 ;攪拌溶解均勻后用滅菌，冷卻后備用；第三步:收集第二步所得的全細胞菌體溶液，用無菌的200目的濾布過濾，用9g/L的NaCl溶液洗滌、再過濾，真空冷凍干燥，得到具有轉化活性的全細胞。第四步:以重量體積比為1:100 (m/V)的比例，將第三步所得的蔗果低聚糖的全細胞FOS酶至于反應體系為重量百分比為50% (w/w)的鹿糖溶液中,將反應體系pH調為5.0、于溫度為45°C和轉速為150r/min的條件下進行轉化24h。第五步:反應完成后，用板框過濾器過濾反應液，回收全細胞菌體，濾過液經過真空濃縮機濃縮成符合要求的FOS糖漿。 根據國標GB/T23528-2009低聚果糖中中的方法，利用高壓色譜法檢測反應體系中蔗果低聚糖的含量，如圖1所示，蔗果三糖、四糖和五糖的出峰時間分別為13.441min、18.314min和25.015min，百分比分別為26.08%,25.92%和4.81%，所得的蔗果低聚糖總量為56.81%,果糖、葡萄糖和鹿糖的出峰時間分別為6.908min、7.552min和9.248min,百分含量分別為4.76%,24.69%和13.74%。本發明制作方法簡單，不涉及到酶的繁雜分離純化的過程，簡化了設備的投資。米曲霉所需要的營養低，易培養，易操作，制作工藝簡單，細胞體相當于酶的天然保護層，可有效避免酶的失活，免去了酶固定化的步驟。簡化了蔗果低聚糖的生產工藝，直接將全細胞投入到反應液中，減少了液體深層發酵培養中發酵罐及其附屬設備的投入。將全細胞投入到FOS的反應體系中，所得的FOS糖液不需要經過脫色，不需要經過離子交換柱脫鹽，只需要經過簡單的過濾，濃縮后即可得到固形物中總低聚糖的含量^ 50%的FOS糖漿，符合GB/T23528-2009低聚果糖的非強制性標準，整個工藝簡單，操作方便,生產成本明顯降低。實施例2第一步將米曲霉CICC 2134(Aspergilus oryzae 2134,由中國工業微生物菌種保藏管理中心保藏，地址:北京市朝陽區霄云路32號，郵編:100027)的孢子接種到液體種子培養基中，接種量為I X IOltl個/L，于28°C，轉速為100r/min的搖床上培養24h后的菌體溶液制成種子液；所述液體種子培養基配方為:50g/L蔗糖，7g/L麥芽粉，10g/L蛋白胨，3g/L的NaCl ;攪拌溶解均勻后用滅菌，冷卻后備用；第二步:以體積比為10:100的比例，將第一步所得的種子液接種至產酶誘導劑的液體培養基中，于28°C，轉速為IOOrpm的條件下培養16h后的菌體溶液制成全細胞菌體溶液；所述的含產酶誘導劑的液體培養基為:70g/L蔗糖，35g/L酵母提取物，15g/L玉米粉，12g/L K2HPO4,1.5g/LMgS04.7H20,10g/L NaNO3 ;攪拌溶解均勻后用滅菌，冷卻后備用；第三步:收集第二步所得的全細胞菌體溶液，用無菌的400目的濾布過濾，用9g/L的NaCl溶液洗滌、再過濾，真空干燥，得到具有轉化活性的全細胞。第四步:以重量體積比為1:100的比例，將第三步所得的蔗果低聚糖的全細胞FOS酶至于反應體系為重量百分比為60%的鹿糖溶液中，將反應體系pH調為6.0、于溫度55°C和轉速為200r/min的條件下進行轉化24h。第五步:反應完成后，用板框過濾器過濾反應液，回收全細胞菌體，濾過液經過真空濃縮機濃縮成符合要求的FOS糖漿。根據國標GB/T23528-2009低聚果糖中高效液相方法檢測，所得蔗果低聚糖(FOS)總量為54.30% (重量百分比)。實施例3第一步將米曲霉CICC 2134(Aspergilus oryzae 2134,由中國工業微生物菌種保藏管理中心保藏，地址:北京市朝陽區霄云路32號，郵編:100027)的孢子接種到液體種子培養基中，接種量為1父106個/1，于251:，轉速為120r/min的搖床上培養20h后的菌體溶液制成種子液；所述液體種子培養基配方為:30g/L蔗糖，5g/L麥芽粉，7g/L蛋白胨，50g/L的酵母提取物，1.5g/L NaCl, 1.5g/L NaNO3 ;攪拌溶解均勻后用滅菌，冷卻后備用；第二步以體積比為8:100的比例，將第一步所得的種子液接種至產酶誘導劑的液體培養基中，于25°C，轉速為300rpm的搖床上培養20h后的菌體溶液制成全細胞菌體溶液；所述的含產酶誘導劑的液體培養基為:10g/L蔗糖，50g/L酵母提取物，20g/L玉米粉，6g/LK2HPO4,0.5g/LMgS04.7H20，6.5g/L NaNO3 ;攪拌溶解均勻后用滅菌，冷卻后備用；第三步收集第二步 所得的全細胞菌體溶液,用無菌的300目的濾布過濾,用9g/L的NaCl溶液洗滌、再過濾，真空冷凍干燥，得到具有轉化活性的全細胞。第四步以重量體積比為5:100 (m/V)的比例，將第三步所得的蔗果低聚糖的全細胞至于反應體系為重量百分比為40% (w/w)的鹿糖溶液中，將反應體系pH調為7.5、于溫度50°C和轉速為300r/min的條件下進行轉化36h。第五步反應完成后，用板框過濾器過濾反應液，回收全細胞菌體，濾過液經過真空濃縮機濃縮成符合要求的FOS糖漿。根據國標GB/T23528-2009低聚果糖中高效液相方法檢測，所得蔗果低聚糖(FOS)總量為54.92% (重量百分比)。實施例4第一步將米曲霉CICC 2134 (Aspergilus oryzae 2134,由中國工業微生物菌種保藏管理中心保藏，地址:北京市朝陽區霄云路32號，郵編:100027)的孢子接種到液體種子培養基中，接種量為1父107個/1，于351:，轉速為200r/min的搖床上培養18h后的菌體溶液制成種子液；所述液體種子培養基配方為:40g/L蔗糖，10g/L玉米粉，3g/L麥芽粉，5g/L蛋白胨，70g/L酵母提取物，2g/L NaCl，1.0g/L NaNO3 ;攪拌溶解均勻后用滅菌，冷卻后備用；第二步以體積比為7:100的比例，將第一步所得的種子液接種至產酶誘導劑的液體培養基中，于30°C，轉速為200r/min的條件下培養18h后的菌體溶液制成全細胞菌體溶液；所述的含產酶誘導劑的液體培養基為:50g/L蔗糖，40g/L酵母提取物，55g/L玉米粉，3.5g/L K2HPO4,0.8g/LMgS04.7H20，5.5g/L NaNO3 ;攪拌溶解均勻后用滅菌，冷卻后備用；第三步收集第二步所得的全細胞菌體溶液，用無菌的250目的濾布過濾，用9g/L的NaCl溶液洗滌、再過濾，真空冷凍干燥，得到具有轉化活性的全細胞。第四步以重量體積比為8:100 (m/V)的比例，將第三步所得的蔗果低聚糖的全細胞酶制劑至于反應體系為重量百分比為55% (w/w)的鹿糖溶液中中，將反應體系pH調為
7.0、于溫度48°C和轉速為100r/min的搖床上進行轉化30h。第五步反應完成后，用板框過濾器過濾反應液，回收全細胞菌體，濾過液經過真空濃縮機濃縮成符合要求的FOS糖漿。根據國標GB/T23528-2009低聚果糖中高效液相方法檢測，所得蔗果低聚糖(FOS)總量為53.47% (重量百分比)。實施例5第一步將米曲霉CICC 2134 (Aspergilus oryzae 2134,由中國工業微生物菌種保藏管理中心保藏，地址:北京市朝陽區霄云路32號，郵編:100027)的孢子接種到液體種子培養基中，接種量為1父108個/1，于301:，轉速為300r/min的條件下培養24h后的菌體溶液制成種子液；所述液體種子培養基配方為:45g/L蔗糖，20g/L玉米粉，7.5g/L蛋白胨，60g/L酵母提取物，1.2g/LNaCl, lg/L NaNO3 ;攪拌溶解均勻后用滅菌，冷卻后備用；第二步以體積比為9:100的比例，將第一步所得的種子液接種至產酶誘導劑的液體培養基中，于35°C，轉速為250r/min的條件下培養24h后的菌體溶液制成全細胞菌體溶液；所述的含產酶誘導劑的液體培養基為:45g/L蔗糖，45g/L酵母提取物，35g/L玉米粉，9.0g/L K2HPO4,1.0g/LMgS04.7H20，5.0g/L NaNO3 ;攪拌溶解均勻后用滅菌，冷卻后備用；第三步收集第二步所得 的全細胞菌體溶液，用無菌的350目的濾布過濾，用9g/L的NaCl溶液洗滌、再過濾，真空冷凍干燥，得到具有轉化活性的全細胞。第四步以重量體積比為7:100 (m/V)的比例，將第三步所得的蔗果低聚糖的全細胞FOS酶至于為重量百分比為53% (w/w)的蔗糖溶液中，將反應體系pH調為5.5、于溫度47°C和轉速為250r/min的條件下進行轉化40h。第五步反應完成后，用板框過濾器過濾反應液，回收全細胞菌體，濾過液經過真空濃縮機濃縮成符合要求的FOS糖漿。根據國標GB/T23528-2009低聚果糖中高效液相方法檢測，所得蔗果低聚糖(FOS)總量為50.57% (重量百分比)。實施例6第一步將米曲霉CICC 2134(Aspergilus oryzae 2134,由中國工業微生物菌種保藏管理中心保藏，地址:北京市朝陽區霄云路32號，郵編:100027)的孢子接種到液體種子培養基中，接種量為1\109個/1，于291:，轉速為180r/min的條件下培養22h后的菌體溶液制成種子液；所述液體種子培養基配方為:35g/L蔗糖，15g/L玉米粉，5g/L麥芽粉，8g/L蛋白胨，1.0g/LNaCl, 1.2g/LNaN03 ;攪拌溶解均勻后用滅菌，冷卻后備用；第二步以體積比為6:100的比例，將第一步所得的種子液接種至產酶誘導劑的液體培養基中，于29°C，轉速為160r/min的搖床上培養24h后的菌體溶液制成全細胞菌體溶液；所述的含產酶誘導劑的液體培養基為:60g/L蔗糖，45g/L酵母提取物，30g/L玉米粉，
9.0g/L NaNO3 ;攪拌溶解均勻后用滅菌，冷卻后備用；第三步收集第二步所得的全細胞菌體溶液，用無菌的200目的濾布過濾，用9g/L的NaCl溶液洗滌、再過濾，真空干燥，得到具有轉化活性的全細胞。
第四步以重量體積比為9:100 (m/V)的比例，將第三步所得的蔗果低聚糖的全細胞酶制劑至于反應體系為重量百分比為50% (w/w)的鹿糖溶液中,將反應體系pH調為5.3、于溫度52°C和轉速為180r/min的條件下進行轉化45h。第五步反應完成后，用板框過濾器過濾反應液，回收全細胞菌體，濾過液經過真空濃縮機濃縮成符合要求的FOS糖漿。根據國標GB/T23528-2009低聚果糖中高效液相方法檢測，所得蔗果低聚糖(FOS)總量為55.11% (重量百分比)。本發明米曲霉全細胞催化劑制備及利用其生產蔗果低聚糖的工藝流程如下: 米曲霉孢子一種子活化液體培養基一種子活化菌液一酶誘導液體培養基一菌絲體一收集菌體一過濾一洗滌一過濾一真空冷凍干燥一米曲霉全細胞一反應液一FOS糖漿—濃縮一成品。
權利要求
1.一種用米曲霉全細胞催化生產蔗果低聚糖的方法，其特征在于，包括以下步驟: (i )米曲霉全細胞催化劑的制備；(2 )利用米曲霉全細胞催化生產蔗果低聚糖。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述米曲霉全細胞的制備，包括如下步驟: (1)將米曲霉孢子接種到液體種子培養基中，接種量為IX IO5個/L 101°個/L，于25V -35°C,轉速為100r/min 300r/min的條件下培養16h 24h后的菌體溶液為種子液； 所述的液體種子培養基的配方為:20 50g/L鹿糖，3g/L 7g/L麥芽粉或10g/L 30g/L玉米粉,5g/L 10g/L蛋白胨或50g/L 100g/L的酵母提取物或其中兩種，lg/L 3g/L NaCl或lg/L 2g/L NaNO3或其中的兩種；攪拌溶解均勻后用滅菌，冷卻后備用； (2)以體積比為5 10:100的比例，將第一步所得的種子液接種至產酶誘導劑的液體發酵產酶培養基中，于25°C 35°C，轉速為100r/min 300r/min的條件下培養16h 24h后的菌體溶液制成全細胞菌體溶液； (3)收集(2)所得的全細胞菌體溶液，用無菌的200目 400目的濾布過濾、洗滌、再過濾、干燥去除水分，得到具有轉化活性的全細胞。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的種子液體培養基為:20 50g/L蔗糖,3g/L 7g/L麥芽粉或10g/L 30g/L玉米粉,5g/L 10g/L蛋白胨或50g/L IOOg/L的酵母提取物或其中兩種，lg/L 3g/L NaCl或lg/L 2g/L NaNO3或其中的兩種。
4.根據權利要 求1、2所述的方法，其特征在于，所述的產酶誘導劑包括蔗糖、淀粉、無機鹽(K2HPO4、MgSO4.7H20、NaNO3)和酵母提取物中的兩種或三種或四種。
5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的含產酶誘導劑的液體培養基:10g/L 70g/L 鹿糖，15g/L 55g/L 玉米粉,20g/L 50g/L 酵母提取物,0g/L 12g/L K2HPO4,0g/L 1.5g/L MgSO4.7H20，3g/L 10g/LNaN03。
6.權利要求1或2或3或4或5所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述洗滌為用NaCl生理鹽水溶液。
7.根據權利要求1或2或3或4或5或6所述的方法，其特征在于，所述米曲霉全細胞催化生產蔗果低聚糖的步驟如下: (I)以重量體積比為I 10:100的比例，將第三步所得的全細胞FOS酶至于FOS反應體系中，于PH5.0-7.5，溫度45°C 55°C，轉速為100r/min 300r/min的條件下進行轉化24h 48h ； 第(2)反應完成后，用板框過濾器過濾反應液，回收全細胞菌體，濾過液經過真空濃縮機濃縮成符合要求的FOS糖漿。利用高壓色譜法檢測反應體系中蔗果低聚糖的含量，所得的鹿果低聚糖總量在50%以上。
8.根據權利要求1或2或3或4或5或6或7所述的方法，其特征在于，所述米曲霉是指米曲霉CICC2134 (Aspergilus oryzae 2134,由中國工業微生物菌種保藏管理中心保藏，地址:北京市朝陽區霄云路32號，郵編:100027)。
9.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，用Κ2ΗΡ04/ΚΗ2Ρ04系列緩沖液調節反應體系的 pH 為 5.0-7.0。
全文摘要
本發明公開了一種用米曲霉全細胞催化生產蔗果低聚糖的方法，它包括兩部分(1)全細胞催化劑的制備，是將米曲霉孢子接種至種子培養基中，在一定的條件下制成種子液，再將種子液接種至產酶誘導劑的液體發酵產酶培養基中，在一定條件下制成全細胞菌體溶液；收集菌體，菌體經過200-400目的濾布過濾、洗滌、再過濾、真空冷凍干燥后制成米曲霉全細胞；(2)利用上述的米曲霉全細胞催化生產蔗果低聚糖，在一定條件下進行轉化，轉化結束后的所得的糖液經過過濾和真空濃縮得到蔗果低聚糖糖漿。本發明得到的產品經高壓液相色譜法檢測，固形物中總低聚糖的含量≥50%，本發明的工藝簡單，操作方便，酶活性高，轉化效率高，具有重要的工業價值。
文檔編號C12R1/69GK103194506SQ20121055211
公開日2013年7月10日 申請日期2012年12月18日 優先權日2012年12月18日
發明者劉冬梅, 周康, 范夢柯, 葉嘉倫, 韋健軍, 周偉文, 韋勝軍 申請人:中山市比克生物科技有限公司