專利名稱：一種產朊假絲酵母與米曲霉的共生培養方法
技術領域：
本發明涉及一種產朊假絲酵母與米曲霉的共生培養方法，主要用于制備酵母的有效降解產物(如核苷酸、肽類和氨基酸等)。
背景技術：
酵母富含蛋白質、氨基酸、多種維生素及微量元素，是食品工業中已長期使用的安全微生物。隨著飼料工業的發展和蛋白質資源的日益匱乏，大規模培養酵母菌制備微生物蛋白質飼料已日顯重要；飼用酵母中不僅蛋白質含量高(40％以上)，還含有酵母菌分泌的蛋白酶、消化酶、核苷酸、B族維生素等生理活性物質；而且酵母細胞壁的主成分是葡聚糖、甘露寡糖、糖蛋白和幾丁質，其中的活性成分葡聚糖和甘露寡糖具有刺激細胞免疫和體液免疫、促進有益菌生長、抑制有害菌生長的作用，因此酵母的深度開發利用潛力具大。
國內外飼用酵母的生產傳統方法主要深層發酵法，深層發酵法的特點是機械化程度高，產品細胞多，雜菌少，產品質量穩定；但由于投資規模大，能源消耗大，還有三廢污染。除此以外，固體發酵法的特點是設備投資小，技術簡單，產品具有較高的生物活性，無三廢污染；但由于生產時間長，各種條件不好，產品質量控制難以達到標準。于是最近又出現了液固兩相法生產飼用酵母的方法。但一般制備酵母抽提物往往選擇純度相對高的深層發酵法生產的酵母。為了使酵母自溶產物有更多的風味物質(或前體)，本發明采用產蛋白酶系豐富的米曲霉與酵母共生培養來完成，多種微生物的協同作用即可得到多菌共生酶系互補，發生水解與發酵混合進行，以產生更多的風味物質和營養活性物質。
在此前的相關研究中，章亭洲等(申請號03142242.X)提出“高活性蛋白及多菌種液固聯合發酵生產高活性蛋白技術”。以多種農副產品為原料，通過接種多菌種，并采用液固聯合發酵工藝制得。其原料配方為麩皮，味精渣，啤酒渣，粉絲蛋白粉，玉米蛋白粉；其中發酵菌種采用解脂假絲酵母，米曲霉，解朊假絲酵母，黑曲霉，白地霉。該多菌種液固聯合發酵工藝生產高活性蛋白的流程為(1)斜面菌種；(2)搖瓶培養；(3)發酵罐培養；(4)原料稱重、混合、加水；(5)原料熟化；(6)接種液體菌種；(7)固體發酵；(8)烘干、粉碎；(9)計量、打包。
王加啟等(申請號200410004551.1)提出了“一種反芻動物專用雙效微生物飼料添加劑及其制備”，該發明是采用玉米為原料，經過粉碎、蒸煮、液化、糖化等步驟，制成玉米液化酶解液，作為嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)和釀酒酵母(Saccharomyce cerevisiae)的發酵原料，分別發酵制備成嗜酸乳桿菌和釀酒酵母培養物的活菌制劑；采用玉米、麩皮和豆粕等原料作為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、米曲霉(Aspergillusoryzae)和黑曲霉(Aspergillus niger)的發酵產酶培養基，枯草芽孢桿菌用液體發酵、米曲霉和黑曲霉用固體混合發酵，配伍制成復合酶制劑；將活菌制劑與復合酶制劑按合適比例復配制成雙效添加劑產品。
夏立秋等(申請號03124850.0)提出了“一種血粉飼用蛋白的生產方法”，該方法涉及用混合菌株一次發酵生產血粉蛋白。即經活化培養的米曲霉AS100、AS102芽孢桿菌Asp007與酵母菌Y113分別以5～4∶3～4∶1∶1的比例，以0.5％接種量接入米糠種曲培養中制成種曲，經活化的種曲，以0.5％接種量接入血粉、米糠、菜粕、豆粕與羽毛粉的血粉發酵培養基中發酵48℃小時后干燥制成血粉蛋白。
況啟生等(申請號02108823.3)提出了“多菌種復合米酒曲的制作”，該方法是采用二種或二種以上多菌種分開進行純種培養，然后按一定配比混合生產的多菌種復合米酒曲。
以上技術方法由于使用了固態發酵或其它利用目的，因此其酵母與霉菌的共生發酵法難以得到高蛋白質酵母(含蛋白質50％以上)。

發明內容本發明既是為了提供一種能得到高蛋白質酵母(含蛋白質50％以上)的、產朊假絲酵母與米曲霉的共生培養方法。
為達到發明目的本發明采用的技術方案是一種產朊假絲酵母與米曲霉的共生培養方法，所述方法如下共生培養基終濃度組成為麩皮5～20g/L，豆粕20～40g/L，麥芽汁50～200g/L，酵母膏0.5～2g/L，KH2PO42～8g/L，MgSO4·7H2O 0.5～2.0g/L；調pH7.0，滅菌，冷卻至室溫，以1/6～1/4×105個細胞/mL培養基的接種量接種米曲霉孢子懸液，20～40℃、100～150r/min振蕩培養36～72h后，再以1/15～1/10×106個細胞/mL培養基的接種量接種產朊假絲酵母種子液，20～40℃、100～200r/min振蕩培養18～36h，獲得共生培養產物。
所述米曲霉孢子懸液可由如下方法制備得到將米曲霉菌種轉接于斜面培養基，30℃下培養48～120h，獲得斜面活化菌種，再將斜面活化菌種轉接于斜面培養基上，30℃下恒溫培養96h，用無菌生理鹽水洗下米曲霉孢子，充分振蕩使孢子混合均勻，即得所述米曲霉孢子懸液。所述斜面培養基可為常用適用于米曲霉的培養基，本發明中采用豆汁斜面培養基，配制方法如下稱取一定量的黃豆，加入質量約為黃豆10倍的水浸泡過夜，煮沸2小時，用紗布過濾即得豆汁(加入蔗糖至終濃度為30g/L，即為豆汁液體培養基)；往豆汁中加入蔗糖至終濃度為30g/L和瓊脂至終濃度為20g/L即為豆汁斜面培養基。
所述產朊假絲酵母種子液可由如下方法制備得到將產朊假絲酵母菌種轉接于斜面培養基上，于30℃下恒溫培養36～96h，獲得斜面活化菌種，再將斜面活化菌種轉接于液體培養基，30℃下恒溫培養72h，即得所述產朊假絲酵母種子液。所述斜面培養基和液體培養基可為常見適用于產朊假絲酵母的斜面培養基和液體培養基，本發明中采用麥芽汁斜面培養基和麥芽汁液體培養基，配制稱取一定量的麥芽顆粒，加四倍的水浸泡過夜，打碎磨漿，在72℃的恒溫水浴鍋中糖化一個小時左右，用碘液試驗檢查糖化完全為止，煮沸30分鐘滅酶，離心，得上清液即為麥芽汁(可直接作為麥芽汁液體培養基)，再加入瓊脂至終濃度為20g/L即為麥芽汁斜面培養基。
優選的，所述產朊假絲酵母為產朊假絲酵母1422。
優選的，所述所述米曲霉為米曲霉3042。
前述豆汁液體培養基，121℃滅菌20min，接入米曲霉3042孢子懸液，于30℃，120r/min振蕩培養。從生長曲線發現米曲霉3042在培養40小時后開始進入對數生長期，72小時后基本上進入生長平穩期，因此接入米曲霉3042的菌齡選擇在36～60h，以48h最佳。
前述麥芽汁(100Bê)液體培養基，接入產朊假絲酵母1422菌種子液，于30℃、180r/min振蕩培養，從不同時間所得的菌液光密度值可以得出產朊假絲酵母1422在24小時進入對數生長期，48小時后進入平穩期，故確定接入產朊假絲酵母1422的菌齡為12～48h，以培養24小時為最佳。
具體的，所述方法包括如下步驟(1)將米曲霉3042菌種轉接于豆汁斜面培養基，30℃下培養48～120h，獲得斜面活化菌種，再將斜面活化菌種轉接于豆汁斜面培養基上，30℃下恒溫培養96h，用質量為斜面培養基質量2倍的無菌生理鹽水洗下米曲霉孢子，充分振蕩使孢子混合均勻，獲得米曲霉孢子懸液；(2)將假絲酵母1422菌種轉接于麥芽汁斜面培養基上，于30℃下恒溫培養36～96h，獲得斜面活化菌種，再將斜面活化菌種轉接于豆汁液體培養基，30℃下恒溫培養72h，獲得產朊假絲酵母種子液；(3)共生培養基終濃度組成為麩皮10g/L，豆粕30g/L，麥芽汁100g/L，酵母膏1.5g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 1.1g/L；調pH7.0，滅菌，冷卻至室溫，以1/5×105個細胞/mL培養基的接種量接種步驟(1)所得米曲霉孢子懸液，30℃、120r/min振蕩培養48h后，再以1/12×106個細胞/mL培養基的接種量接種步驟(2)所得產朊假絲酵母種子液，30℃、180r/min振蕩培養24h，獲得共生培養產物。
通過本發明方法進行的產朊假絲酵母和米曲霉復合共生培養發酵，不僅獲得了含高蛋白質的酵母(粗蛋白質含量高達52.3g/100g(干菌計)以上，復合菌株培養發酵的含菌量達5.933×109個/g(干計)，同時也得到了豐富的內源酶系，中性蛋白酶活高達76單位/克(干計)以上。
具體實施方式
下面以產朊假絲酵母1422和米曲霉3042為例，結合實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此實施例1菌種擴大培養培養基配制豆汁斜面培養基組成稱取一定量的黃豆，加10倍質量的水浸泡過夜，煮沸2小時，用紗布過濾得豆汁；加入蔗糖終濃度為30g/L，瓊脂終濃度為20g/L即為豆汁斜面培養基。
麥芽汁斜面培養基組成稱取一定量的麥芽顆粒，加4倍質量的水浸泡過夜，打碎磨漿，在72℃的恒溫水浴鍋中糖化一個小時左右，用碘液試驗檢查糖化完全為止，煮沸30分鐘滅酶，離心，得麥芽汁，再加入終濃度20g/L的瓊脂即為麥芽汁斜面培養基。
麥芽汁液體培養基組成稱取一定量的麥芽顆粒，加4倍質量的水浸泡過夜，打碎磨漿，在72℃的恒溫水浴鍋中糖化一個小時左右，用碘液試驗檢查糖化完全為止，煮沸30分鐘滅酶，離心，得上清液即為麥芽汁，即麥芽汁液體培養基。
米曲霉3042以無菌操作方式，將米曲霉3042菌種(由杭州食品釀造有限公司提供)轉接于豆汁斜面培養基上，于30℃下培養96h，獲得斜面活化菌種；再以無菌操作方式，將活化菌種轉接于茄子瓶豆汁斜面培養基上，于30℃下恒溫培養96h，用50毫升無菌生理鹽水洗下米曲霉孢子，充分振蕩使孢子混合均勻，制成孢子懸液，細胞濃度為1×105個/mL；產朊假絲酵母1422以無菌操作方式，將產朊假絲酵母1422菌種(由中國工業微生物菌種保藏中心提供)轉接于麥芽汁(50Bê)斜面培養基上，于30℃下恒溫培養72h，獲得斜面活化菌種；再以無菌操作方式，將斜面活化菌種轉接于麥芽汁液體培養基，30℃下恒溫培養72h，即得所述產朊假絲酵母種子液，細胞濃度為1×106個/mL。
實施例2共生培養共生培養基終濃度組成為麩皮10g/L，豆粕30g/L，麥芽汁100g/L，酵母膏1.5g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 1.1g/L；1.5L三角瓶中裝液量300mL，調pH7.0，滅菌，冷卻至室溫，接入實施例1所得米曲霉孢子懸液60mL，30℃、120r/min振蕩培養48h后，再接入實施例1所得產朊假絲酵母種子液25mL，30℃、180r/min振蕩培養24h，發酵結束后，過濾，離心收集菌絲體，不同批次菌粉中蛋白質和內源酶系酶活含量見表1，U為酶活單位，定義為在pH7.2，40℃，1min內產生1μg酪氨酸的酶量(g)為一個單位。
表1不同批次菌粉中蛋白質和內源酶系酶活含量
結論運用本發明方法，產朊假絲酵母1422和米曲霉3042共生培養獲得的產物中，粗蛋白質含量高達52.3g/100g(干計)以上，復合菌株培養發酵的含菌量達5.933×109個/g(干計)，同時也得到了豐富的內源蛋白酶系，酶活高達76U/克(干菌計)以上。
實施例3共生培養基終濃度組成為麩皮15g/L，豆粕25g/L，麥芽汁120g/L，酵母膏0.8g/L，KH2PO45g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L；1.5L三角瓶中裝液量300mL，調pH7.0，滅菌，冷卻至室溫，接入實施例1所得米曲霉孢子懸液50mL，30℃、120r/min振蕩培養48h后，再接入實施例1所得產朊假絲酵母種子液20mL，28℃、150r/min振蕩培養36h，發酵結束后，過濾，離心收集菌絲體，其中粗蛋白質含量為53.35g/100g菌粉，內源蛋白酶系酶活為87U/克干菌粉。
實施例4共生培養基終濃度組成為麩皮8g/L，豆粕36g/L，麥芽汁80g/L，酵母膏1.6g/L，KH2PO46g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L；1.5L三角瓶中裝液量300mL，調pH7.0，滅菌，冷卻至室溫，接入實施例1所得米曲霉孢子懸液50mL，30℃、120r/min振蕩培養48h后，再接入實施例1所得產朊假絲酵母種子液20mL，35℃、120r/min振蕩培養48h，發酵結束后，過濾，離心收集菌絲體，其中粗蛋白質含量為52.16g/100g菌粉，內源蛋白酶系酶活為85U/克干菌粉。
權利要求
1.一種產朊假絲酵母與米曲霉的共生培養方法，其特征在于所述方法如下共生培養基終濃度組成為麩皮5～20g/L，豆粕20～40g/L，麥芽汁50～200g/L，酵母膏0.5～2g/L，KH2PO42～8g/L，MgSO4·7H2O 0.5～2.0g/L；調pH7.0，滅菌，冷卻至室溫，以1/6～1/4×105個細胞/mL培養基的接種量接種米曲霉孢子懸液，20～40℃、100～150r/min振蕩培養36～72h后，再以1/15～1/10×106個細胞/mL培養基的接種量接種產朊假絲酵母種子液，20～40℃、100～200r/min振蕩培養18～36h，獲得共生培養產物。
2.如權利要求1所述的產朊假絲酵母與米曲霉的共生培養方法，其特征在于所述米曲霉孢子懸液由如下方法制備得到將米曲霉菌種轉接于斜面培養基，30℃下培養48～120h，獲得斜面活化菌種，再將斜面活化菌種轉接于斜面培養基上，30℃下恒溫培養96h，用無菌生理鹽水洗下米曲霉孢子，充分振蕩使孢子混合均勻，即得所述米曲霉孢子懸液。
3.如權利要求1所述的產朊假絲酵母與米曲霉的共生培養方法，其特征在于所述產朊假絲酵母種子液由如下方法制備得到將產朊假絲酵母菌種轉接于斜面培養基上，于30℃下恒溫培養36～96h，獲得斜面活化菌種，再將斜面活化菌種轉接于液體培養基，30℃下恒溫培養72h，即得所述產朊假絲酵母種子液。
4.如權利要求1或2所述的產朊假絲酵母與米曲霉的共生培養方法，其特征在于所述產朊假絲酵母為產朊假絲酵母1422。
5.如權利要求1或3所述的產朊假絲酵母與米曲霉的共生培養方法，其特征在于所述所述米曲霉為米曲霉3042。
6.如權利要求1所述的產朊假絲酵母與米曲霉的共生培養方法，其特征在于所述方法包括如下步驟(1)將米曲霉3042菌種轉接于豆汁斜面培養基，30℃下培養48～120h，獲得斜面活化菌種，再將斜面活化菌種轉接于豆汁斜面培養基上，30℃下恒溫培養96h，用質量為斜面培養基質量2倍的無菌生理鹽水洗下米曲霉孢子，充分振蕩使孢子混合均勻，獲得米曲霉孢子懸液；(2)將產朊假絲酵母1422菌種轉接于麥芽汁斜面培養基上，于30℃下恒溫培養36～96h，獲得斜面活化菌種，再將斜面活化菌種轉接于麥芽汁液體培養基，30℃下恒溫培養72h，獲得產朊假絲酵母種子液；(3)共生培養基終濃度組成為麩皮10g/L，豆粕30g/L，麥芽汁100g/L，酵母膏1.5g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 1.1g/L；調pH7.0，滅菌，冷卻至室溫，以1/5×105個細胞/mL培養基的接種量接種步驟(1)所得米曲霉孢子懸液，30℃、120r/min振蕩培養48h后，再以1/12×106個細胞/mL培養基的接種量接種步驟(2)所得產朊假絲酵母種子液，30℃、180r/min振蕩培養24h，獲得共生培養產物。
全文摘要
本發明提供了一種產朊假絲酵母與米曲霉的共生培養方法，所述方法如下共生培養基終濃度組成為麩皮5～20g/L，豆粕20～40g/L，麥芽汁50～200g/L，酵母膏0.5～2g/L，KH
文檔編號C12R1/69GK101050432SQ20071006755
公開日2007年10月10日 申請日期2007年3月9日 優先權日2007年3月9日
發明者丁玉庭, 聶小華, 劉書來 申請人:浙江工業大學