一種生物法合成聚3-羥基丙酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種重組大腸桿菌工程菌株、該菌株的制備方法以及利用該重組大腸桿菌工程菌株通過生物法從乙酰輔酶A生物合成聚3-羥基丙酸的方法。本發(fā)明通過以葡萄糖或甘油等為碳源，在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞(例如，大腸桿菌)中共同過量表達(dá)內(nèi)源或外源的乙酰輔酶A羧化酶基因(acc)和丙酰輔酶A合成酶基因(prpE)，以及外源的丙二酸單酰輔酶A還原酶基因(mcr)和聚羥基脂肪酸合成酶基因(phaC)，利用葡萄糖降解中間產(chǎn)物乙酰輔酶A生物合成聚3-羥基丙酸。其中乙酰輔酶A最終是從諸如葡萄糖的簡單起始材料獲得。
【專利說明】一種生物法合成聚3-羥基丙酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及聚3-羥基丙酸的生物合成。具體地，本發(fā)明提供了一種重組大腸桿菌工程菌株、該菌株的制備方法以及利用該重組大腸桿菌工程菌株從乙酰輔酶A生物合成聚3-羥基丙酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]聚3-羥基丙酸(poly (3-hydroxypropionate), P3HP)是一種非常有發(fā)展前景的可生物降解塑料，具有優(yōu)異的生物材料性質(zhì)和機(jī)械性能，比如具有高機(jī)械強(qiáng)度和拉伸強(qiáng)度(> 400MPa)、高斷裂伸長量(> 300% )、生物降解性、生物兼容性、不溶于水、無毒、壓電性、熱塑性等。相對于其它兩種研究較多的可生物降解塑料聚3-羥基丁酸(PHB)和聚乳酸(PLA)來說，P3HP具有更優(yōu)越的性能:它比PLA具有更好的穩(wěn)定性不會水解，又由于碳鏈骨架中沒有甲基而比PHB更易被微生物降解。作為新型功能材料，P3HP可廣泛應(yīng)用于地膜、矯形外科、個(gè)人衛(wèi)生用品、藥物控釋、包裝等領(lǐng)域。
[0003]目前已知的生物并不能合成天然P3HP。P3HP的化學(xué)合成方法中以β-丙內(nèi)酯開環(huán)聚合方法最為成熟。由于β_丙內(nèi)酯為致癌物質(zhì)且價(jià)格昂貴，限制了該方法的應(yīng)用。與化學(xué)合成法相比，生物合成Ρ3ΗΡ具有操作簡單、條件溫和、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。然而，Ρ3ΗΡ的生物合成目前多需添加3-羥基丙酸、I，5-戊二醇、I，7-庚二醇等相關(guān)碳源，這些相關(guān)碳源價(jià)格昂貴，使Ρ3ΗΡ的生產(chǎn)成本過高，無法應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。生物法利用非相關(guān)碳源合成Ρ3ΗΡ的研究剛剛起步，僅有一篇文獻(xiàn)報(bào)道Andreessen等利用工程大腸桿菌以甘油為碳源生產(chǎn)P3HP (Andreessen et al.2010)，且需要兩步培養(yǎng)法，發(fā)酵工藝較為復(fù)雜。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明主要通過在大腸桿菌中建立起利用葡萄糖降解中間產(chǎn)物乙酰輔酶A合成聚3-羥基丙酸的生物合成途徑，從而在重組大腸桿菌工程菌中實(shí)現(xiàn)了大量生物合成聚3-羥基丙酸的目的。
[0005]因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種重組大腸桿菌菌株，所述菌株包含:
[0006](1)編碼乙酰輔酶A羧化酶的核酸分子、與乙酰輔酶A羧化酶基因具有70%以上同源性且編碼具有乙酰輔酶A羧化酶功能的蛋白的核酸分子或與乙酰輔酶A羧化酶基因沒有明顯的同源性但編碼具有乙酰輔酶A羧化酶功能的蛋白的核酸分子；
[0007](2)編碼丙二酸單酰輔酶A還原酶的核酸分子、與丙二酸單酰輔酶A還原酶基因具有70%以上同源性且編碼具有丙二酸單酰輔酶A還原酶功能的蛋白的核酸分子或與丙二酸單酰輔酶A還原酶基因沒有明顯的同源性但編碼具有丙二酸單酰輔酶A還原酶功能的蛋白的核酸分子；
[0008](3)編碼丙酰輔酶A合成酶的核酸分子、與丙酰輔酶A合成酶基因具有70%以上同源性且編碼具有丙酰輔酶A合成酶功能的蛋白的核酸分子或與丙酰輔酶A合成酶基因沒有明顯的同源性但編碼具有丙酰輔酶A合成酶功能的蛋白的核酸分子；和[0009](4)編碼聚羥基脂肪酸合成酶的核酸分子、與聚羥基脂肪酸合成酶基因具有70%以上同源性且編碼具有聚羥基脂肪酸合成酶功能的蛋白的核酸分子或與聚羥基脂肪酸合成酶基因沒有明顯的同源性但編碼具有聚羥基脂肪酸合成酶功能的蛋白的核酸分子。
[0010]其中所述乙酰輔酶A羧化酶基因acc選自:
[0011]1)埃希氏菌屬大腸桿菌的乙酰輔酶A羧化酶基因acc，
[0012]2)來源于其他細(xì)菌的乙酰輔酶A羧化酶基因，例如，沙門氏菌的乙酰輔酶A羧化酶
基因，
[0013]3)和埃希氏菌屬大腸桿菌的acc基因同源性超過70%且編碼具有與埃希氏菌屬大腸桿菌的acc基因編碼的乙酰輔酶A羧化酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或
[0014]4)來源于其它生物體，和埃希氏菌屬大腸桿菌的acc基因沒有明顯的同源性，但編碼與埃希氏菌屬大腸桿菌的acc基因編碼的乙酰輔酶A羧化酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。
[0015]其中所述丙二酸單酰輔酶A還原酶基因mcr選自:
[0016]I)綠屈撓菌屬橙色綠屈撓菌的丙二酸單酰輔酶A還原酶基因mcr，
[0017]2)來源于其他細(xì)菌的丙二酸單酰輔酶A還原酶基因，
[0018]3)和綠屈撓菌屬橙色綠屈撓菌的mcr基因同源性超過70%且編碼具有與綠屈撓菌屬橙色綠屈撓菌的mcr基因編碼的丙二酸單酰輔酶A還原酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或
[0019]4)來源于其它生物體，和綠屈撓菌屬橙色綠屈撓菌的mcr基因沒有明顯的同源性，但編碼與綠屈撓菌屬橙色綠屈撓菌的mcr基因編碼的丙二酸單酰輔酶A還原酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。
[0020]其中所述丙酰輔酶A合成酶基因prpE選自:
[0021]I)埃希氏菌屬大腸桿菌的丙酰輔酶A合成酶基因prpE,
[0022]2)來源于其他細(xì)菌的丙酰輔酶A合成酶基因，例如，沙門氏菌的丙酰輔酶A合成酶基因，
[0023]3)和埃希氏菌屬大腸桿菌的prpE基因同源性超過70 %且編碼具有與埃希氏菌屬大腸桿菌的PrpE基因編碼的丙酰輔酶A合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或
[0024]4)來源于其它生物體，和埃希氏菌屬大腸桿菌的prpE基因沒有明顯的同源性，但編碼與埃希氏菌屬大腸桿菌的PrpE基因編碼的丙酰輔酶A合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。
[0025]其中所述乙酰輔酶A羧化酶、丙二酸單酰輔酶A還原酶和丙酰輔酶A合成酶這三種酶活性的共同提高增加聚3-羥基丙酸的前體物質(zhì)3-羥基丙酰輔酶A的量。
[0026]其中所述聚羥基脂肪酸合成酶基因phaCl選自:
[0027]I)產(chǎn)堿桿菌屬真氧產(chǎn)堿桿菌的聚羥基脂肪酸合成酶基因phaCl，
[0028]2)和產(chǎn)堿桿菌屬真氧產(chǎn)堿桿菌的phaCl基因同源性超過70%且編碼具有與產(chǎn)堿桿菌屬真氧產(chǎn)堿桿菌的PhaCl基因編碼的聚羥基脂肪酸合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或
[0029]3)來源于其它生物體，和產(chǎn)堿桿菌屬真氧產(chǎn)堿桿菌的phaCl基因沒有明顯的同源性，但編碼與產(chǎn)堿桿菌屬真氧產(chǎn)堿桿菌的PhaCl基因編碼的聚羥基脂肪酸合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。
[0030]在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述重組大腸桿菌菌株為保藏編號為CGMCCN0.6615的菌株P(guān)3HP01，該菌株于2012年9月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(中國北京朝陽區(qū)大屯路中科院微生物研究所，郵編:100101)。
[0031]在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種制備重組大腸桿菌菌株的方法，該方法包括以下步驟:
[0032](I)制備包含聚羥基脂肪酸合成酶基因phaCl、丙酰輔酶A合成酶基因prpE和丙二酸單酰輔酶A還原酶基因mcr的重組質(zhì)粒A ；
[0033](2)制備包含乙酰輔酶A羧化酶基因acc的重組質(zhì)粒B ；
[0034](3)將上述質(zhì)粒A和B共同轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過篩選獲得同時(shí)包含聚羥基脂肪酸合成酶、丙酰輔酶A合成酶、丙二酸單酰輔酶A和乙酰輔酶A羧化酶四種酶活性的重組大腸桿菌菌株。
[0035]在這一方面中，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，在根據(jù)本發(fā)明的第一方面確定了聚羥基脂肪酸合成酶、丙酰輔酶A合成酶、丙二酸單酰輔酶A和乙酰輔酶A羧化酶四種基因的核苷酸序列后，可以利用常規(guī)分子重組克隆技術(shù)將上述四種基因的核苷酸序列與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制元件可操作性連接或彼此之間可操作性連接，然后克隆到適宜的大腸桿菌細(xì)胞中，并且篩選得到同時(shí)包含聚羥基脂肪酸合成酶、丙酰輔酶A合成酶、丙二酸單酰輔酶A和乙酰輔酶A羧化酶這四種酶活性的重組大腸桿菌菌株。此外，上述四種酶的核苷酸序列如果不是來源于大腸桿菌，則可以針對大腸桿菌進(jìn)行密碼子優(yōu)化，這也是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)的。
[0036]在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了生物法合成聚3-羥基丙酸的方法，具體是一種從乙酰輔酶A生物合成聚3-羥基丙酸的方法，所述方法通過將本發(fā)明第一方面所述的重組大腸桿菌菌株在適宜于其生長的條件下在包含適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述重組大腸桿菌菌株利用葡萄糖降解中間產(chǎn)物乙酰輔酶A生物合成聚3-羥基丙酸。
[0037]在所述生物法合成聚3-羥基丙酸的方法中，乙酰輔酶A最終是從諸如葡萄糖的簡單起始材料獲得，由此建立可持續(xù)發(fā)展的聚3-羥基丙酸合成工藝路線。與Andreessen等以甘油為碳源相比，乙酰輔酶A作為糖代謝的中間體，原料來源更廣泛，成本更低；此外，從乙酰輔酶A合成聚3-羥基丙酸的過程中，還原力平衡。本發(fā)明生產(chǎn)工藝簡單，成本低廉，具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0038]本發(fā)明主要通過基因工程手段提高丙二酸單酰輔酶A還原酶(MCR)途徑中限速酶的活性，即提高乙酰輔酶A羧化酶基因(acc)、丙二酸單酰輔酶A還原酶基因(mcr)和丙酰輔酶A合成酶基因(prpE)的活性，從而增加聚3-羥基丙酸的合成前體物3-羥基丙酰輔酶A的量，再利用細(xì)菌聚3-羥基丙酸合成酶將3-羥基丙酰輔酶A催化合成目標(biāo)產(chǎn)物聚3-羥基丙酸。最終在大腸桿菌細(xì)胞中成功建立一種聚3-羥基丙酸生物合成代謝途徑。
[0039]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面中，本發(fā)明提供一種生物法合成聚3-羥基丙酸的方法，所述方法包括下述步驟:
[0040]第一步，利用分子克隆方法構(gòu)建共同過量表達(dá)內(nèi)源或外源的乙酰輔酶A羧化酶基因(acc)和丙酰輔酶A合成酶基因(prpE),以及外源的丙二酸單酰輔酶A還原酶基因(mcr)和聚羥基脂肪酸合成酶基因(PhaC)的重組宿主細(xì)胞；[0041]第二步，將第一步構(gòu)建得到的重組宿主細(xì)胞在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵，添加表達(dá)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間；
[0042]第三步，收集菌體，離心，水洗，凍干后，氯仿萃取，得到的聚3-羥基丙酸產(chǎn)物。
[0043]其中，所述宿主細(xì)胞可以為大腸桿菌或肺炎克雷伯氏菌，優(yōu)選大腸桿菌。所用的重組方法為本領(lǐng)域中的常規(guī)分子克隆方法。例如，實(shí)施例中所述的構(gòu)建方法。可以將上述各種酶構(gòu)建到可誘導(dǎo)的啟動子的控制下，例如，可以用IPTG誘導(dǎo)上述酶類的表達(dá)。
[0044]所述“適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基”包括以各種適于所選用的宿主細(xì)胞(例如，大腸桿菌)生長的培養(yǎng)基，對培養(yǎng)基的碳源沒有特別的限定，碳源可以是葡萄糖、甘油等，只要是能產(chǎn)生乙酰輔酶A的碳源均可。優(yōu)選成本低的碳源，例如，葡萄糖或甘油。
[0045]其中所述的乙酰輔酶A羧化酶基因(acc)、丙酰輔酶A合成酶基因(prpE)、丙二酸單酰輔酶A還原酶基因(mcr)和聚羥基脂肪酸合成酶基因(phaC)均如本發(fā)明第一方面所述。
[0046]更具體地，本發(fā)明提供以下各項(xiàng):
[0047]1.一種重組大腸桿菌菌株，所述菌株包含:
[0048](1)編碼乙酰輔酶A羧化酶的核酸分子、與乙酰輔酶A羧化酶基因具有70%以上同源性且編碼具有乙酰輔酶A羧化酶功能的蛋白的核酸分子或與乙酰輔酶A羧化酶基因沒有明顯的同源性但編碼具有乙酰輔酶A羧化酶功能的蛋白的核酸分子；
[0049](2)編碼丙二酸單酰輔酶A還原酶的核酸分子、與丙二酸單酰輔酶A還原酶基因具有70%以上同源性且編碼具有丙二酸單酰輔酶A還原酶功能的蛋白的核酸分子或與丙二酸單酰輔酶A還原酶基因沒有明顯的同源性但編碼具有丙二酸單酰輔酶A還原酶功能的蛋白的核酸分子；
[0050](3)編碼丙酰輔酶A合成酶的核酸分子、與丙酰輔酶A合成酶基因具有70%以上同源性且編碼具有丙酰輔酶A合成酶功能的蛋白的核酸分子或與丙酰輔酶A合成酶基因沒有明顯的同源性但編碼具有丙酰輔酶A合成酶功能的蛋白的核酸分子；
[0051](4)編碼聚羥基脂肪酸合成酶的核酸分子、與聚羥基脂肪酸合成酶基因具有70%以上同源性且編碼具有聚羥基脂肪酸合成酶功能的蛋白的核酸分子或與聚羥基脂肪酸合成酶基因沒有明顯的同源性但編碼具有聚羥基脂肪酸合成酶功能的蛋白的核酸分子。
[0052]2.根據(jù)第I項(xiàng)所述的重組大腸桿菌菌株，其中所述乙酰輔酶A羧化酶基因(acc)選自:
[0053]1)埃希氏菌屬大腸桿菌的乙酰輔酶A羧化酶基因，
[0054]2)來源于其他細(xì)菌的乙酰輔酶A羧化酶基因，例如，沙門氏菌的乙酰輔酶A羧化酶
基因，
[0055]3)和埃希氏菌屬大腸桿菌的acc基因同源性超過70%且編碼具有與埃希氏菌屬大腸桿菌的acc基因編碼的乙酰輔酶A羧化酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或
[0056]4)來源于其它生物體，和埃希氏菌屬大腸桿菌的acc基因沒有明顯的同源性，但編碼與埃希氏菌屬大腸桿菌的acc基因編碼的乙酰輔酶A羧化酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。
[0057]3.根據(jù)第I項(xiàng)所述的重組大腸桿菌菌株，其中所述丙二酸單酰輔酶A還原酶基因(mcr)選自:[0058]1)綠屈撓菌屬橙色綠屈撓菌的丙二酸單酰輔酶A還原酶基因，
[0059]2)來源于其他細(xì)菌的丙二酸單酰輔酶A還原酶基因，
[0060]3)和綠屈撓菌屬橙色綠屈撓菌的mcr基因同源性超過70%且編碼具有與綠屈撓菌屬橙色綠屈撓菌的mcr基因編碼的丙二酸單酰輔酶A還原酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或
[0061]4)來源于其它生物體，和綠屈撓菌屬橙色綠屈撓菌的mcr基因沒有明顯的同源性，但編碼與綠屈撓菌屬橙色綠屈撓菌的mcr基因編碼的丙二酸單酰輔酶A還原酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。
[0062]4.根據(jù)第1項(xiàng)所述的重組大腸桿菌菌株，其中所述丙酰輔酶A合成酶基因(prpE)選自:
[0063]1)埃希氏菌屬大腸桿菌的丙酰輔酶A合成酶基因，
[0064]2)來源于其他細(xì)菌的丙酰輔酶A合成酶基因，例如，沙門氏菌的丙酰輔酶A合成酶基因，
[0065]3)和埃希氏菌屬大腸桿菌的prpE基因同源性超過70 %且編碼具有與埃希氏菌屬大腸桿菌的PrpE基因編碼的丙酰輔酶A合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或
[0066]4)來源于其它生物體，和埃希氏菌屬大腸桿菌的prpE基因沒有明顯的同源性，但編碼與埃希氏菌屬大腸桿菌的PrpE基因編碼的丙酰輔酶A合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。
[0067]5.根據(jù)第I項(xiàng)所述的重組大腸桿菌菌株，其中所述乙酰輔酶A羧化酶/丙二酸單酰輔酶A還原酶和丙酰輔酶A合成酶這三種酶活性的共同提高增加聚3-羥基丙酸的前體物質(zhì)3-羥基丙酰輔酶A的量。
[0068]6.根據(jù)第I項(xiàng)所述的重組大腸桿菌菌株，其中所述聚羥基脂肪酸合成酶基因(phaCl)選自:
[0069]1)產(chǎn)堿桿菌屬真氧產(chǎn)堿桿菌的聚羥基脂肪酸合成酶基因，
[0070]2)和產(chǎn)堿桿菌屬真氧產(chǎn)堿桿菌的phaCl基因同源性超過70%且編碼具有與產(chǎn)堿桿菌屬真氧產(chǎn)堿桿菌的PhaCl基因編碼的聚羥基脂肪酸合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或
[0071]3)來源于其它生物體，和產(chǎn)堿桿菌屬真氧產(chǎn)堿桿菌的phaCl基因沒有明顯的同源性，但編碼與產(chǎn)堿桿菌屬真氧產(chǎn)堿桿菌的PhaCl基因編碼的聚羥基脂肪酸合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。
[0072]7.根據(jù)第I項(xiàng)所述的重組大腸桿菌菌株，所述菌株的保藏號為CGMCC N0.6615。
[0073]8.一種生物法合成聚3-羥基丙酸的方法，所述方法通過將第1-7項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的重組大腸桿菌菌株在適宜于其生長的條件下在包含適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵，所述重組大腸桿菌菌株利用葡萄糖降解中間產(chǎn)物乙酰輔酶A生物合成聚3-羥基丙酸。
[0074]9.一種可生物降解的材料，其由根據(jù)第8項(xiàng)所述的方法合成的聚3-羥基丙酸制成。
[0075]10.根據(jù)第9項(xiàng)所述的材料，所述材料選自包裝材料、緩釋材料、電化學(xué)材料或組織工程材料。[0076]定義和縮寫
[0077]在本文中使用下列的縮寫或簡稱:
[0078]乙酰輔酶A羧化酶基因:acc
[0079]丙酰輔酶A合成酶基因:prpE
[0080]丙二酸單酰輔酶A還原酶基因:mcr
[0081]聚羥基脂肪酸合成酶基因:phaC
[0082]大腸桿菌(Escherichiacoli):Ε.coli
[0083]“可操作性連接”指在表達(dá)調(diào)控元件和受調(diào)控序列(例如基因)的多核苷酸之間的功能連接，使得受調(diào)控序列在適于表達(dá)該受調(diào)控序列的條件下表達(dá)，從而產(chǎn)生所期望的肽或多肽。例如，表達(dá)調(diào)控元件可以是轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件如啟動子、增強(qiáng)子序列和其他順式作用元件等。[0084]“過量表達(dá)”或“過表達(dá)”是指特定基因在生物體中的表達(dá)超過正常水平(即，野生型表達(dá)水平)，例如，通過增強(qiáng)內(nèi)源表達(dá)或引入外源基因來實(shí)現(xiàn)。
[0085]保藏說明:
[0086]本發(fā)明構(gòu)建的重組大腸埃希氏菌(Escherichia coli,又稱大腸桿菌)菌株已于2012年9月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(中國北京朝陽區(qū)大屯路中科院微生物研究所，郵編=100101)，保藏編號為CGMCC N0.6615，命名為P3HP01。
[0087]附圖簡述
[0088]從下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點(diǎn)將更明顯，其中:
[0089]圖1.利用乙酰輔酶A生物合成聚3-羥基丙酸代謝途徑示意圖；
[0090]圖2.pET21a-phaC-prpE_mcr載體構(gòu)建不意圖(即，pHP304質(zhì)粒圖譜);
[0091]圖3.重組大腸桿菌目標(biāo)蛋白的表達(dá)鑒定圖，M表示分子量標(biāo)記,泳道I為E.coliBL21 (DE3)/pACYCDuet-l/pET21a，泳道 2 為 E.coliBL21 (DE3)/pACYC-accABCD，泳道 3 為E.coli BL21 (DE3)/pHP304,泳道 4 為 E.coli BL21 (DE3)/pHP304/pACYC_accABCD，箭頭表示外源蛋白的表達(dá)，乙酰輔酶A羧化酶C亞基AccC (49.3kDa)，A亞基AccA和D亞基AccD (35kDa 和 33.3kDa)，B 亞基 AccB (16.7kDa)，丙二酸單酰輔酶 A 還原酶 MCR(132kDa)，和聚羥基脂肪酸合成酶PhaCl (64kDa)；
[0092]圖4.本發(fā)明的重組細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)聚3-羥基丙酸的核磁圖譜，a圖為H譜，b圖為C譜。
[0093]序列表說明
[0094]
【權(quán)利要求】
1.一種重組大腸桿菌菌株，所述菌株包含: (1)編碼乙酰輔酶A羧化酶的核酸分子、與乙酰輔酶A羧化酶基因具有70%以上同源性且編碼具有乙酰輔酶A羧化酶功能的蛋白的核酸分子或與乙酰輔酶A羧化酶基因沒有明顯的同源性但編碼具有乙酰輔酶A羧化酶功能的蛋白的核酸分子； (2)編碼丙二酸單酰輔酶A還原酶的核酸分子、與丙二酸單酰輔酶A還原酶基因具有70%以上同源性且編碼具有丙二酸單酰輔酶A還原酶功能的蛋白的核酸分子或與丙二酸單酰輔酶A還原酶基因沒有明顯的同源性但編碼具有丙二酸單酰輔酶A還原酶功能的蛋白的核酸分子； (3)編碼丙酰輔酶A合成酶的核酸分子、與丙酰輔酶A合成酶基因具有70%以上同源性且編碼具有丙酰輔酶A合成酶功能的蛋白的核酸分子或與丙酰輔酶A合成酶基因沒有明顯的同源性但編碼具有丙酰輔酶A合成酶功能的蛋白的核酸分子；和 (4)編碼聚羥基脂肪酸合成酶的核酸分子、與聚羥基脂肪酸合成酶基因具有70%以上同源性且編碼具有聚羥基脂肪酸合成酶功能的蛋白的核酸分子或與聚羥基脂肪酸合成酶基因沒有明顯的同源性但編碼具有聚羥基脂肪酸合成酶功能的蛋白的核酸分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組大腸桿菌菌株，其中所述乙酰輔酶A羧化酶基因acc選自: 1)埃希氏菌屬大腸桿菌的乙酰輔酶A羧化酶基因， 2)來源于其他細(xì)菌 的乙酰輔酶A羧化酶基因，例如，沙門氏菌的乙酰輔酶A羧化酶基因， 3)和埃希氏菌屬大腸桿菌的acc基因同源性超過70%且編碼具有與埃希氏菌屬大腸桿菌的acc基因編碼的乙酰輔酶A羧化酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或 4)來源于其它生物體，和埃希氏菌屬大腸桿菌的acc基因沒有明顯的同源性，但編碼與埃希氏菌屬大腸桿菌的acc基因編碼的乙酰輔酶A羧化酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組大腸桿菌菌株，其中所述丙二酸單酰輔酶A還原酶基因mcr選自: 1)綠屈撓菌屬橙色綠屈撓菌的丙二酸單酰輔酶A還原酶基因， 2)來源于其他細(xì)菌的丙二酸單酰輔酶A還原酶基因， 3)和綠屈撓菌屬橙色綠屈撓菌的mcr基因同源性超過70%且編碼具有與綠屈撓菌屬橙色綠屈撓菌的mcr基因編碼的丙二酸單酰輔酶A還原酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或 4)來源于其它生物體，和綠屈撓菌屬橙色綠屈撓菌的mcr基因沒有明顯的同源性，但編碼與綠屈撓菌屬橙色綠屈撓菌的mcr基因編碼的丙二酸單酰輔酶A還原酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組大腸桿菌菌株，其中所述丙酰輔酶A合成酶基因prpE選自: 1)埃希氏菌屬大腸桿菌的丙酰輔酶A合成酶基因， 2)來源于其他細(xì)菌的丙酰輔酶A合成酶基因，例如，沙門氏菌的丙酰輔酶A合成酶基因，3)和埃希氏菌屬大腸桿菌的prpE基因同源性超過70%且編碼具有與埃希氏菌屬大腸桿菌的PrpE基因編碼的丙酰輔酶A合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或 4)來源于其它生物體，和埃希氏菌屬大腸桿菌的prpE基因沒有明顯的同源性，但編碼與埃希氏菌屬大腸桿菌的PrpE基因編碼的丙酰輔酶A合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組大腸桿菌菌株，其中所述乙酰輔酶A羧化酶、丙二酸單酰輔酶A還原酶和丙酰輔酶A合成酶這三種酶活性的共同提高增加聚3-羥基丙酸的前體物質(zhì)3-羥基丙酰輔酶A的量。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組大腸桿菌菌株，其中所述聚羥基脂肪酸合成酶基因phaCl選自: 1)產(chǎn)堿桿菌屬真氧產(chǎn)堿桿菌的聚羥基脂肪酸合成酶基因， 2)和產(chǎn)堿桿菌屬真氧產(chǎn)堿桿菌的PhaCl基因同源性超過70%且編碼具有與產(chǎn)堿桿菌屬真氧產(chǎn)堿桿菌的PhaCl基因編碼的聚羥基脂肪酸合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或 3)來源于其它生物體，和產(chǎn)堿桿菌屬真氧產(chǎn)堿桿菌的PhaCl基因沒有明顯的同源性，但編碼與產(chǎn)堿桿菌屬真氧產(chǎn)堿桿菌的PhaCl基因編碼的聚羥基脂肪酸合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組大腸桿菌菌株，所述菌株的保藏號為CGMCCN0.6615。
8.—種生物法合成聚3-羥基丙酸的方法，所述方法通過將權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的重組大腸桿菌菌株在適宜于其生長的條件下在包含適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵，所述重組大腸桿菌菌株利用葡萄糖降解中間產(chǎn)物乙酰輔酶A生物合成聚3-羥基丙酸。
9.一種可生物降解的材料，其由根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法合成的聚3-羥基丙酸制成。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的材料，所述材料選自包裝材料、緩釋材料、電化學(xué)材料或組織工程材料。
【文檔編號】C12P7/62GK103898034SQ201210581073
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月27日
【發(fā)明者】咸漠, 趙廣, 王 琦, 劉長水 申請人:中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所